Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

نشكر كير نيومان على قراءته النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل البرنامج داخل الأمعاء في المعهد الوطني للصحة.

1. إعداد غرف التدفق
<ol><li>تنظيف أغطية الزجاج<ol>
<li>باستخدام زجاجات الغسيل بالماء المقطر والإيثانول والأيزوبروبانول، شطف 24 مم × 50 مم يغطي بالترتيب التالي: الماء والإيثانول والماء والإيزوبروبانول والماء. جفف الأغطية مع تيار من النيتروجين النظيف. من المهم شطف الأغطية من أعلى إلى أسفل ، مع عقد ?...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

يوفر بروتوكول القياس الضوئي الشامل الموضح هنا طريقة سريعة ودقيقة لقياس تقاربات ربط الأجسام المضادة. يستخدم تحليل MP كمية صغيرة جدًا من المواد، ويمكن تقييم المعلومات الإضافية - بما في ذلك قياس الرزينة ، oligomerization ، والنقاء - من نفس البيانات (الشكل 5). دون تعديلات، وهذا الأسلوب ?...

أصبحت الأجسام المضادة أدوات في كل مكان من البيولوجيا الجزيئية وتستخدم على نطاق واسع في كل من التطبيقات الطبية والبحثية. في الطب، فهي ذات أهمية حاسمة في التشخيص، ولكن تطبيقاتها العلاجية تتوسع أيضاً ويتم تطوير العلاجات الجديدة القائمة على الأجسام المضادة باستمرار1،2،3،4. وتشمل التطبيقات العلمية للأجسام المضادة العديد من التقنيات المختبرية التي لا غنى عنها مثل immunofluorescence5، المناعي6، تدفق cytometry7، ELISA ، والنشاف الغربية. بالنسبة لكل من هذه التطبيقات، فإن الحصول على قياسات دقيقة لخصائص الربط للجسم المضاد، بما في ذلك تقارب الربط وخصوصيته، أمر بالغ الأهمية.
منذ أول جهاز الرنين البلازمون سطح التجارية (SPR) تم إدخالها في عام 1990، أصبحت أجهزة الاستشعار الحيوي البصرية "المعيار الذهبي" لتوصيف الأجسام المضادة، ولكن التقنيات الأخرى، بما في ذلك ELISA، تستخدم أيضا بشكل روتيني لقياس تقارب الأجسام المضادة8،9. هذه الطرق عادة ما تتطلب شل أو وضع العلامات على الجزيئات المحللة، والتي يمكن أن تؤثر على التفاعل بين الفائدة. كما أنها بطيئة نسبياً، وتنطوي على خطوات مقارنة متعددة قبل أن يتسنى جمع النتائج لتحليل البيانات. A وضعت مؤخرا واحد جزيء طريقة، القياس الضوئي الشامل (MP)، يكتشف الجزيئات مباشرة في الحل عندما تهبط على سطح المجهر يغطي10،11. لا يتطلب الكشف البصري القائم على تشتت الضوء الذي يستخدمه النائب وضع العلامات على البروتين أو تعديله. يتم تسجيل جزيئات البروتين الفردية بواسطة المجهر التشتت التداخلي كما البقع الداكنة التي تظهر في الصورة (الشكل 1D) ، ويمكن الكشف عن عدة آلاف من الجزيئات خلال الحصول على البيانات لمدة دقيقة واحدة12. يتم تحديد كمية الإشارة التي يتم إنشاؤها بواسطة كل جسيم على حدة، ويتم حساب قيمة التباين (ظلام نسبي). وتتناسب قيم التباين التداخلي مع الكتل الجزيئية للبروتينات، مما يسمح بتحديد الأنواع المقيدة والحرّة في خليط الأجسام المضادة للمضادات. في الوقت نفسه، من خلال عد أحداث الهبوط الجزيئي، MP يقيس مباشرة مجموعات الأنواع. وهذا يعطي MP الأساليب المستندة إلى قدرة فريدة لتحديد بشكل مستقل تقارب مواقع الربط المتعددة.
ربط المستضد (Ag) يمكن وصف جزيئات إلى موقعين ملزمين من الأجسام المضادة سليمة (Ab) كما : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> مع الثوابت اقتران التوازن Ka1 و Ka2 تعريف ك: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> حيث ci و fi تمثل التركيز وجزء من المكون i، على التوالي. يمكن التعبير عن تركيز المستضد الكلي (cAg)على النحو: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
منذ تركيزات مجموع الأجسام المضادة (جAb)tot و antigen (cAg) من المعروفأن هذه المعادلة يمكن استخدامها لتناسب مباشرة الكسور المكون التجريبية التي تم الحصول عليها من قياسات MP وحساب ثوابت اقتران التوازن Ka1 و Ka2 (انظر المعلومات التكميلية).
ويمكن أيضا أن تستخدم بيانات MP لتقدير التعاون بين موقعين للجسم المضاد ملزمة11. لاثنان جسم مضادّة ثوابت مع ثوابت متماثلة مجهريّة ملزمة, العاملات إحصائيّة يصف العملية من مجموعة سكان من ال أب· Ag وAb· Ag2 المجمعات تملي أن الثوابت التوازن العيان واضح Ka1 و Ka2 لن تكون متساوية عدديا، وKa1 = 4Ka2. ولذلك، تشير القيم التجريبية لـ Ka1 < 4Ka2 إلى التعاون الإيجابي بين موقعي ربط الأجسام المضادة. وبالمثل، Ka1 > 4Ka2 يشير إلى التعاونية السلبية.
قياسات MP لتقارب الربط المضاد للجسم سريع ويتطلب كمية صغيرة من المواد. توفر التوزيعات الكتلة النائب المستخدمة في عمليات حسابية ثابتة التوازن معلومات إضافية حول خصائص العينة وتمكن من تقييم نقاء العينة، oligomerization، وتجميع في تجربة واحدة. ويمكن استخدام نفس الطريقة لقياس نسبة عالية من البروتين البروتين ملزمة، وMP مفيد بشكل خاص لدراسات التفاعلات البروتينية متعددة التكافؤ. وعادة ما يكون المجمعات متعددة البروتينات كتل جزيئية كبيرة، الأمثل للكشف عن النائب، ويمكن استخدام بيانات جزيء واحد لقياس stoichiometry وحساب تقارب مواقع الربط متعددة في وقت واحد. عادةً ما يصعب الحصول على هذه المعلومات باستخدام أساليب مجمعة.
دون تعديلات، والبروتوكول الحالي هو مناسبة لقياسات تقارب عالية نسبيا، تفاعلات دون micromolar مع مستضدات من كتلة جزيئية من 20 كيلو أم لا أو أكبر. للحصول على أفضل النتائج، يجب أن تكون مخزونات البروتين من درجة النقاء العالية، ولكن لا توجد متطلبات محددة العازلة. باستخدام MP، يمكن تقييم ربط الأجسام المضادة المضادة في أقل من خمس دقائق. يمكن إجراء جمع البيانات والتحليل المطلوبة لإجراء حسابات Kd دقيقة في غضون 30 دقيقة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

إن قياسات خصوصية وتقارب تفاعلات الأجسام المضادة للأجسام المضادة ذات أهمية حاسمة للتطبيقات الطبية والبحثية. في هذا البروتوكول، نحن وصف تنفيذ تقنية جزيء واحد جديد، قياس ضوئي الشامل (MP)، لهذا الغرض. MP هو تقنية خالية من التسمية والشل الحركة التي تكشف عن الكتل الجزيئية وفئات الأجسام المضادة ومجمعات الأجسام المضادة على مستوى جزيء واحد. MP يحلل عينة الأجسام المضادة للمضادات في غضون دقائق، مما يسمح لتحديد دقيق من تقارب ملزمة وفي وقت واحد توفير المعلومات عن علم التشنج والدولة القلية من البروتينات. هذا هو تقنية بسيطة ومباشرة التي تتطلب سوى بيكومويل كميات من البروتين والمواد الاستهلاكية لا مكلفة. ويمكن استخدام نفس الإجراء لدراسة البروتين البروتين ملزمة للبروتينات مع كتلة الجزيئية أكبر من 50 كيلو Da. للتفاعلات البروتينية المتعددة التكافؤ، يمكن الحصول على تقارب مواقع الربط المتعددة في قياس واحد. ومع ذلك، فإن طريقة قياس الجزيء الواحد وعدم وجود العلامات تفرض بعض القيود التجريبية. هذه الطريقة تعطي أفضل النتائج عند تطبيقها على قياسات تقارب التفاعل دون ميكرومولار، مستضدات مع كتلة جزيئية من 20 كيلو أم أيه أو أكبر، و نقي نسبيا عينات البروتين. كما أننا نُصف الإجراء اللازم لتنفيذ خطوات التركيب والحساب المطلوبة باستخدام برنامج تحليل البيانات الأساسي.

لقد سبق فحصنا التفاعل بين الإنسان α-ثرومبين (HT) والماوس أحادية النسيلة المضادة البشرية ثرومبين الأجسام المضادة (AHT) باستخدام MP يستند إلى المقايسة11. وبما أن الكتلة الجزيئية لـ HT (37 كيلو Da) أقل من حد الكشف عن 40 كيلو Da، فإن الحد الأقصى لتركيز العينة يمكن أن يتجاوز الحد الأقصى من ترك?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

نحن وصف نهج جزيء واحد لقياسات تقارب الأجسام المضادة المضادة باستخدام القياس الضوئي الشامل (MP). البروتوكول المستندة إلى MP سريع ودقيق، ويستخدم كمية صغيرة جدا من المواد، ولا يتطلب تعديل البروتين.

التحديد السريع لتقارب الأجسام المضادة- المستضدات بواسطة القياس الضوئي الشامل

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

وتستخدم الأجسام المضادة بشكل روتيني في تقنيات المختبرات وتطبيقاتها العلاجية والتشخيصية تتوسع بسرعة. توصيف ربط الأجسام المضادة للأجسام المضادة سريع ودقيق مهم للغاية لهذه التطبيقات. يقيس القياس الضوئي الشامل بسرعة تقارب الربط باستخدام كميات صغيرة للغاية من المواد.ولا يلزم وضع العلامات أو الجمود، ويمكن الحصول على معلومات عن نقاء البروتينات وإضفاء الطابع النقّي عليها من التجربة نفسها. يمكن استخدام هذا البروتوكول ليس فقط لدراسة الأجسام المضادة ، ولكن أيضًا لقياس الارتباطات القوية للبروتين والبروتين للبروتينات ذات الكتلة الجزيئية الأكبر من 50 كيلو دالات. تبدأ باستخدام ملقط لينة تلميح وزجاجات غسل لشطف بالتسلسل 24 من 50 ملليمتر يغطي من أعلى إلى أسفل مع الماء المقطر والإيثانول والماء المقطر، ايزوبروبانول، والماء المقطر.بعد الغسيل الأخير، جفف الأغطية مع تيار من النيتروجين النظيف في نفس الاتجاه لتجنب نقل التلوث من ملقط. شطف 24 في 24 ملليمتر يغطي مع الماء المقطر والإيثانول كما هو موضح، تليها التجفيف مع تيار من النيتروجين نظيفة. بعد التجفيف، ضع غطاء 24 في 24 ملليمتر على قطعة من رقائق الألومنيوم ووضع شرائط من الشريط على الوجهين على غطاء.ثم قطع 24 من 24 ملليمتر يغطي من احباط واضغط بلطف احباط على الجانب العامل من 24 من 50 ملليمتر coverslip. لإعداد عينات مستضد الأجسام لقياسات التقارب، قم بفرز ما لا يقل عن ملليلترين من PBS من خلال فلتر حقنة 0.22 ميكرون لإزالة جزيئات الغبار والمجاميع، والطرد المركزي مخزون الأجسام المضادة والمستضدات ذات الاهتمام. قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر من أرصدة الأجسام المضادة ومضادات لتحديد تركيزاتها الفعلية، وإعداد سلسلة المعايرة من خليط مضاد الأجسام في النطاق المناسب من تركيزات مستضد في حجم النهائي من 50 ميكرولتر لكل عينة.ثم احتضان خليط الأجسام المضادة للضد لمدة 10 دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة للسماح للتفاعل ملزمة للوصول إلى التوازن الكيميائي. لتقييم تقارب الأجسام المضادة المضادة بواسطة القياس الضوئي الشامل ، قم بتطبيق قطرة زيت الغمر بالمجهر على هدف الأداة ووضع غرفة التدفق على خشبة مسرح المجهر. إضافة 10 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها إلى نهاية واحدة من قناة غرفة التدفق.سيدخل المخزن المؤقت القناة بواسطة إجراء شعري. في علامة التبويب التحكم البؤري لبرنامج تجميع البيانات، استخدم أزرار حركة المرحلة الخشنة لأعلى ولللأسفل لإجراء التعديلات الأولية والنقر على الحدة لعرض قراءة إشارة الحدة. استخدم أزرار الضبط لأعلى ولفلة لتعظيم قيمة الحدة وانقر فوق ضبط التركيز والتركيز على التركيز لتنشيط وظيفة تتبع التركيز البؤري.يجب أن يكون لصورة الشريحة النظيفة قيمة إشارة تساوي أو أقل من 0.05٪ تحميل 20 ميكرولترات من أول عينة مستضد الأجسام كما هو موضح، النشاف السائل من الطرف الآخر مع قطعة صغيرة من الورق النشاف. فور التحميل، انقر فوق سجل للحصول على العدد المناسب من الإطارات ما يعادل 100 ثانية من البيانات. في نهاية فترة تجميع البيانات، أدخل اسم ملف للبيانات وانقر فوق موافق، ثم قم بأخذ عينة لحفظ الملف.لتحليل بيانات القياس الضوئي الشامل، افتح الملف الذي يهمك وانقر فوق التحليل. انقر فوق تحميل لتحميل وظيفة المعايرة وانقر فوق ملف وحفظ النتائج لحفظ البيانات تحليلها. للحصول على التركيزات النسبية لكل نوع في العينة، افتح الأحداث.CSV ملف، نسخ البيانات في العمود M في برنامج التخطيط والتحليل المناسب، واستخدام الرسم البياني الرسم البياني لرسم توزيع الكتلة الجزيئية. انقر نقراً مزدوجاً فوق الرسم البياني لفتح نافذة خصائص الرسم، وتعطيل binning التلقائي، وحدد حجم سلة من 2.5 كيلودالتون. لإنشاء مراكز الحاويات وعدد البيانات، انقر فوق تطبيق والذهاب.لملاءمة الرسم البياني مع وظائف جاوسي، حدد مراكز الحاويات و تحسب الأعمدة وانقر فوق قمم التحليلات ووظيفة قائمة الاحتواء المتعددة للذروة الأساسية. انقر نقراً مزدوجاً للإشارة إلى مواضع الذروة التقريبية على الرسم توزيع وانقر فوق فتح NL صالح. تحقق من مربعات الاختيار الثابتة لمراكز الذروة XC وتعيين قيمها على الكتل الجزيئية المتوقعة من الأجسام المضادة الحرة ومجمعات الأجسام المضادة المضادة المفردة والمزدوجة.تحقق من خيار المشاركة لمعلمات العرض وانقر فوق احتواء. وتمثل قيم ارتفاع الذروة المجهزة لمكونات الغاوسية التركيز النسبي لكل نوع في العينة. ثم استخدم المعادلة لحساب جزء تركيز كل نوع من قيم ذروة الارتفاع.لحساب ثوابت التوازن باستخدام برنامج جدول بيانات، افتح التحلل. ورقة عمل xlsx. في ورقة العمل هذه، يمكن تعديل قيم الخلايا المميزة باللون الأصفر في الصفوف من 1 إلى 10 لإجراء عمليات حسابية ثابتة للتوازن.أدخل قيم ثابت التحلل المقدر في وحدات نانوموللار في الخلايا B1 و B2. إذا لم تكن قيم ثابت الانفصام المقدر معروفة، اترك القيم الافتراضية في الخلايا B1 و B2 دون تغيير. أدخل مجموع الأجسام المضادة ومجموع تركيزات المستضدات في وحدات نانوموللار في الخلايا D2 و E2 وأدخل قيم الكسر المحسوبة لكل نوع في الخلايا F2 وG2 و H2. عند إجراء التحليل العمومي المعايرة، أضف قيم كسر البيانات المناسبة في الصفوف من 2 إلى 10. في إطار معلمات solver، حدد الخلية B15 لمربع الهدف المحدد والخلايا B1 إلى B2 عن طريق تغيير الخلايا المتغيرة.حدد زر الحد الأدنى للخيار إلى وتحقق من جعل المتغيرات غير المقيدة غير سالبة مربع، ثم حدد GRG غير الخطية كأسلوب حل وانقر فوق حل. سيتم عرض القيم الثابتة للتفكك المناسب في الخلايا B1 و B2. وسيتم عرض مجموع النهائي من الأخطاء التربيعية في الخلية B15. في هذه التجربة التمثيلية، تم تنفيذ سلسلة المعايرة مع الأجسام المضادة مضادة بشرية خافض في تركيز 25 نانومولير ثابت و0، 7.5، 15، 30، 60، و 120 نانومولار الإنسان ألفا ثرومبين تركيزات تم إجراءها للحصول على التوزيعات الكتلة الجزيئية من المخاليط المضادة للجسم و 15، 30، 60، و 120 نانومولار الإنسان ألفا ثرومبين تركيزات تم تنفيذها للحصول على التوزيعات الكتلة الجزيئية من مستضد الأجسام المضادة و عينة الأجسام المضادة فقط.تم تطبيع أفضل المعلمات ذروة الارتفاع تناسب من المكونات غاوسي للحصول على كسور تركيز الأنواع. ثم كانت قيم كسر التركيز ملائمة على الصعيد العالمي للحصول على تقاربات الربط بين الأجسام المضادة المضادة. ويمكن بعد ذلك رسم كسور التركيز التجريبية ونتائج الملاءمة العالمية للأجسام المضادة الحرة، ومجمع مستضد واحد، ومجمع مستضد مزدوج.للحصول على قيم دقيقة KD، يجب اختيار تركيزات البروتين بعناية لملء جميع أنواع التفاعل. نوصي بإعداد سلسلة المعايرة باستخدام مجموعة من تركيزات المستضد. بعد تركيب البيانات، يمكن استخدام أسلوب إسقاط الخطأ للحصول على خطأ المناسب، ولكن من الأفضل تكرار التجربة وحساب الانحرافات المعيارية لقيم التقارب الربط المتوسط.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

تحديد الأنواع والكميات في مخاليط عن طريق MRM الطيف الكتلي من الببتيدات التطبيقية للمصادقة اللحوم

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

والليزر السريع جس الطريقة يسهل تحديد غير الغازية وخالية الاتصال من الخواص الحرارية ورقة

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

تصميم عالية تقارب الأجسام المضادة مستضد حركية ملزم باستخدام أربعة منصات جهاز الاستشعار البيولوجي

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...