Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
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我们感谢基尔·诺伊曼对手稿的批判性阅读。这项工作得到了国家卫生和、国家卫生和、国家卫生和、国家、地膜内方案的支持。

1. 准备流室
<ol><li>清洁玻璃盖玻片<ol>
<li>使用用蒸馏水、乙醇和异丙醇洗瓶，按以下顺序冲洗 24 mm x 50 mm 盖玻片：水、乙醇、水、异丙醇、水。用干净的氮气流擦干盖玻片。重要的是要从上到下冲洗盖玻片，用软尖钳握住底角。以相同方向干燥盖玻片，以避免从钳子中转移污染物（图2A）。</li>
		<li>同样，用蒸馏水、乙醇和蒸馏水冲洗 24 mm x 24 mm 盖玻片。用干净的氮气流擦...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

此处概述的基于质量光度测量的协议提供了一种快速、准确的测量抗原-抗体结合亲和力的方法。MP 分析使用非常少量的材料，并且可以从相同的数据评估其他信息（包括测定、寡聚化和纯度）（图5）。如果不作修改，此方法适用于在大约 5 nM 至 500 nM 范围内的分离常数的测量，以及分子质量约为 20 kDa 或更大的配体分子的测量。当至少一个结合伙伴的分子质量大于50kDa时，?...

抗体已成为分子生物学的无处不在的工具，并广泛应用于医学和研究应用。在医学方面，它们在诊断中至关重要，但它们的治疗应用也在不断扩大，新的抗体疗法也在不断开发1、2、3、4。抗体的科学应用包括许多不可或缺的实验室技术，如免疫荧光5、免疫沉淀6、流细胞学7、ELISA和西印迹。对于每个应用，获得抗体结合特性的准确测量，包括结合亲和力和特异性，至关重要。
自1990年引进第一台商用表面表面质共振（SPR）仪器以来，光学生物传感器已成为抗体表征的"黄金标准"，但包括ELISA在内的其他技术也经常用于测量抗体亲和力8、9。这些方法通常需要对分析的分子进行固定或标记，这可能会影响兴趣的相互作用。它们也相对缓慢，涉及多个检测步骤，然后才能收集结果进行数据分析。最近研制的单分子方法，质量光度测量（MP），当分子降落在显微镜表面时，直接检测溶液中的分子。MP 采用的基于光散射的光学检测不需要蛋白质标记或修改。干涉测量散射显微镜将单个蛋白质分子记录为图像中出现的黑点（图1D），在一分钟的数据采集12中可以检测到几千个分子。每个粒子生成的信号被量化，并计算其对比度值（相对黑暗）。干涉测比值与蛋白质的分子质量成正比，从而可以识别抗原-抗体混合物中的结合和自由物种。同时，通过计算分子着陆事件，MP直接测量物种种群。这为基于 MP 的方法提供了独立量化多个绑定站点的亲缘性的独特功能。
抗原（Ag） 分子与完整抗体 （Ab） 的两个结合位点结合可描述为： <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> 平衡关联常数 Ka1 和 Ka2 定义为： <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> 其中ci和 f i分别表示成分 i 的浓度和分数。总抗原浓度 （cAg）托特可以表示为： <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
由于抗体（cAb）托特和抗原 （cAg） tot 的总浓度已知 ，此方程可用于直接拟合从 MP 测量中获得的实验组分分数，并计算平衡关联常数 Ka1 和 Ka2（ 参见 补充信息）。
MP数据也可用于估计两个抗体结合位点11之间的合作性。对于具有相同微观结合常数的两种抗体副托普，描述 Ab + 种群过程的统计因子阿格和阿布|Ag2复合物规定，表观宏观平衡常数Ka1和Ka2在数值上不相等，而Ka1 = 4Ka2。因此，Ka1 < 4Ka2的实验值表示两个抗体结合位点之间的正合作率。同样，Ka1 > 4Ka2表示负合作性。
抗原-抗体结合亲和力的MP测量速度快，需要少量材料。用于平衡常量计算的MP质量分布提供了有关样品特性的附加信息，并可用于在单个实验中评估样品纯度、寡聚化和聚合。同样的方法可用于测量高亲和力蛋白-蛋白质结合，MP对于研究多价蛋白相互作用特别有用。多蛋白复合物通常具有较大的分子质量，是 MP 检测的最佳选择，单分子数据可用于同时测量组分测量和计算多个结合位点的亲缘性。使用基于批量的方法通常很难获取此信息。
如果不进行修改，目前的协议适用于测量相对高的亲和力，亚微摩尔相互作用的分子质量为20kDa或更大的抗原。为了获得最佳效果，蛋白质储存应具有高纯度，但没有特定的缓冲液要求。通过使用MP，抗原抗体结合可以在五分钟内评估。准确的Kd 计算所需的数据收集和分析可以在 30 分钟内完成。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

测量抗原-抗体相互作用的特异性和亲和力对于医疗和研究应用至关重要。在此协议中，我们描述了一种新的单分子技术，质量光度测量（MP），为此目的的实现。MP 是一种无标签和固定技术，在单分子水平上检测和量化抗体和抗原复合物的分子质量以及数量。MP 在几分钟内分析抗原抗体样品，从而能够精确确定结合亲和力，同时提供有关蛋白质的组细胞和寡聚状态的信息。这是一种简单明了的技术，只需要少量的蛋白质，不需要昂贵的消耗品。同样的程序可用于研究分子质量大于50kDa的蛋白质的蛋白质-蛋白质结合。对于多价蛋白相互作用，可以在一次测量中获得多个结合位点的亲和力。然而，单分子测量模式和缺乏标签存在一些实验限制。该方法在测量亚微摩尔相互作用亲亲度、分子质量为20 kDa或更大的抗原以及相对纯净的蛋白质样品时，可获得最佳效果。我们还描述了使用基本数据分析软件执行所需拟合和计算步骤的过程。

我们之前已经使用基于MP的α 11研究了人类血栓（HT）和小鼠单克隆抗人类血栓抗体（AHT）的相互作用。由于HT（37 kDa）的分子质量低于40kDa检测限值，因此最大样品浓度可以超过50 nM MP 浓度限制，而不会对质量分布的分辨率产生负面影响。实验计划为定型系列，AHT抗体浓度为25 nM，HT浓度为7.5 nM、15 nM、30 nM、60 nM和120 nM。 图3 显示了抗原抗体混合物和抗体样?...

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Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

我们使用质量光度测量 （MP） 来描述抗原-抗体亲和力测量的单分子方法。基于MP的协议是快速，准确，使用非常少量的材料，不需要蛋白质修改。

通过质量光度法快速测定抗体抗原亲和力

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

抗体通常用于实验室技术，其治疗和诊断应用正在迅速扩大。快速准确的抗原-抗体结合特性对于这些应用至关重要。质量光度测量使用极少量的材料快速测量结合亲缘性。无需贴标签或固定，也可以从同一实验中获得蛋白质寡聚化和纯度信息。该协议不仅可用于研究抗体，还可用于测量分子质量大于50千吨（50千吨）的蛋白质的强蛋白结合。首先使用软尖钳和洗瓶，用蒸馏水、乙醇、蒸馏水、异丙醇和蒸馏水从上到下依次冲洗 24 个 50 毫米的盖玻片。上次洗涤后，用同一方向的清洁氮气流干燥盖玻片，以避免从钳子中转移污染。如证明，用蒸馏水和乙醇冲洗 24 由 24 毫米盖玻片，然后用干净的氮气流干燥。干燥后，将 24 到 24 毫米的盖玻片放在一块铝箔上，并在盖玻片上放置双面胶带。然后从铝箔上切出 24 由 24 毫米盖玻片，然后轻轻地将铝箔压在 24 的 50 毫米盖玻片的工作侧。为了准备抗体抗原样本进行亲和力测量，通过0.22微米注射器过滤器过滤至少两毫升PBS，以去除灰尘颗粒和聚集物，并离心机感兴趣的抗体和抗原库存。测量抗体和抗原库存的 280 纳米紫外线吸收度，以确定其实际浓度，并在适当的抗原浓度范围内，以每样本 50 微升的最终体积制备抗体抗原混合物的滴定序列。然后在室温下孵育抗原-抗体混合物约10分钟，使结合反应达到化学平衡。要通过质量光度测量评估抗体抗原亲和力，在仪器目标上涂抹一滴显微镜浸入油，然后将流室放在显微镜的舞台上。在流室通道的一端添加 10 微升过滤 PBS。缓冲器将通过毛细管作用进入通道。在数据收集软件的对焦控制选项卡中，使用粗糙的阶段上下移动按钮进行初始调整，单击锐度以查看锐度信号读出。使用精细的上下调整按钮最大化锐度值，然后单击设置焦点和锁定焦点以激活焦点跟踪功能。干净的幻灯片的图像应具有等于或低于 0.05% 负载 20 微升的第一个抗体抗原样品，如所示，用一小块印迹纸从另一端印迹液体。加载后立即单击记录以获取相当于 100 秒数据的适当帧数。在数据收集期结束时，输入数据的文件名，然后单击"确定"，然后对示例进行采样以保存文件。要分析大量光度测量数据，请打开感兴趣的文件并单击分析。单击加载以加载校准功能，然后单击文件并保存结果以保存分析的数据。要获取样本中每个物种的相对浓度，请打开拟合的事件。csv 文件，将 M 列中的数据复制到相应的绘图和分析软件中，并使用绘图统计直方图函数绘制分子质量分布图。双击直方图以打开绘图属性窗口，禁用自动装箱，并选择 2.5 千元大小的 bin 大小。若要创建 bin 中心和计数数据，请单击"应用并转到"。要将直方图与高斯函数拟合，请选择条柱中心和计数列，然后单击分析峰值和基线多峰拟合菜单功能。双击以指示分布图上的近似峰值位置，然后单击打开 NL 拟合。检查 XC 峰中心的固定复选框，并设置其值，以自由抗体和单抗原-抗体复合物的预期分子质量。检查共享选项的宽度参数，然后单击"拟合"。高斯分量的拟合峰值高度值表示样品中每个物种的相对浓度。然后使用方程计算每个物种的浓度分数从峰值高度值。要使用电子表格程序计算平衡常数，请打开分离常数。xlsx 工作表。在此工作表中，可以修改行 1 到 10 中的黄色突出显示单元格值以执行均衡常量计算。输入以纳米摩尔单位为单位的估计分离常量值到单元格 B1 和 B2 中。如果估计的分离常量值为不知道，请保持单元格 B1 和 B2 中的默认值不变。将纳米摩尔单位的总抗体和总抗原浓度输入细胞D2和E2，并在细胞F2、G2和H2中输入每个物种的计算分数值。执行滴定全局分析时，将适当的数据分数值添加到第 2 行到第 10 行中。在解算器参数窗口中，通过更改可变单元格框，为 设置的目标框选择单元格 B15，选择单元格 B1 到 B2。选择"执行"选项的最小值按钮并选中"使无约束变量非负"复选框，然后选择 GRG 非线性作为求解方法，然后单击求解。最佳拟合分离常量值将显示在单元格 B1 和 B2 中。平方误差的最终总和将显示在单元格 B15 中。在这个具有代表性的实验中，在固定的25纳米摩尔浓度和0、7.5、15、30、60和120纳米摩尔人α-血栓浓度下，进行了抗人血栓抗体的滴定序列，以获得抗原抗体混合物和抗体样本的分子质量分布。对高斯成分的最佳拟合峰值高度参数进行规范化，以获得物种浓度分数。然后，浓度分数值适合全球，以获得抗原-抗体结合亲和力。然后可以绘制自由抗体、单抗原抗体复合物和双抗原复合物的实验浓度分数和全球拟合结果。为了获得准确的KD值，必须仔细选择蛋白质浓度，以填充所有反应物种。我们建议使用一系列抗原浓度制备滴定序列。拟合数据后，可以使用误差投影方法获取拟合误差，但最好重复实验并计算平均结合相关性值的标准偏差。

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