Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Vi takker Keir Neuman for hans kritiske læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af den intramurale program af NHLBI, NIH.

1. Forbered strømningskamrene
<ol><li>Rengør glasdækslerne<ol>
<li>Vaskflasker med destilleret vand, ethanol og isopropanol skylles de 24 mm x 50 mm dækslæd i følgende rækkefølge: vand, ethanol, vand, isopropanol, vand. Tør dækslerne med en strøm af rent kvælstof. Det er vigtigt at skylle dækslerne fra top til bund og holde det nederste hjørne med soft-tippede fakmenter. Dækslingen tørres i samme retning for at undgå at overføre forurening fra snævlerne (figur 2A).</li>
...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

Den Massefotometri baseret protokol skitseret her giver en hurtig og præcis metode til måling af antigen-antistof bindende tilhørsforhold. MP-analyse bruger en meget lille mængde materiale, og yderligere oplysninger, herunder støkiometri, oligomerisering og renhed , kan vurderes ud fra de samme data (Figur 5). Uden ændringer gælder denne metode for målinger af dissociationskonstanter i ca. 5 nM til 500 nM-området og for ligandmolekyler med molekylmasse på ca. 20 kDa eller større. ...

Antistoffer er blevet allestedsnærværende værktøjer molekylærbiologi og anvendes i udstrakt grad i både medicinske og forskning applikationer. Inden for medicin er de af afgørende betydning inden for diagnostik, men deres terapeutiske anvendelser udvides også, og der udvikles hele tiden nyeantistofbaserede behandlinger 1,2,3,4. De videnskabelige anvendelser af antistoffer omfatter mange uundværlige laboratorieteknikker såsom immunfluorescens5,immunoprecipation6,flow cytometri7, ELISA, og vestlige blotting. For hver af disse anvendelser er det af afgørende betydning at opnå nøjagtige målinger af antistoffets bindende egenskaber, herunder bindende affinitet og specificitet.
Siden den første kommercielle overflade plasmon resonans (SPR) instrument blev indført i 1990, optiske biosensorer er blevet "guld standard" af antistof karakterisering, men andre teknikker, herunder ELISA, er også rutinemæssigt anvendes til at måle antistof tilhørsforhold8,9. Disse metoder kræver normalt immobilisering eller mærkning af de analyserede molekyler, som potentielt kan påvirke samspillet mellem interesse. De er også relativt langsomme, involverer flere analysetrin, før resultaterne kan indsamles til dataanalyse. En nyligt udviklet enkelt-molekyle metode, masse fotometri (MP), registrerer molekyler direkte i opløsning, når de lander på overfladen af mikroskopet coverslip10,11. Den lyssprændebaserede optiske detektion, som MP anvender, kræver ikke mærkning eller modifikation af protein. Individuelle proteinmolekyler registreres af det interferometriske spredningsmikroskop som mørke pletter, der optræder i billedet (Figur 1D), og flere tusinde molekyler kan detekteres under den et minuts dataindsamling12. Signalet fra hver enkelt partikel kvantificeres, og kontrastværdien (relativt mørke) beregnes. De interferometriske kontrastværdier er proportionale med proteinernes molekylære masser, hvilket gør det muligt at identificere bundne og frie arter i antigen-antistofblandingen. Samtidig måler MP ved at tælle molekylære landingshændelser direkte arternes populationer. Dette giver MP-baserede metoder en unik evne til selvstændigt at kvantificere tilhørsforhold til flere bindende websteder.
Binding af antigenet (Ag)molekyler til de to bindingssteder for det intakte antistof (Ab) kan beskrives som: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> med ligevægtsfræsekonstanterne Ka1 og Ka2 defineret som: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> hvor ci og fi repræsenterer henholdsvis koncentration og brøkdel af komponenten i. Den samlede antigenkoncentration (cAg)kan udtrykkes som: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Da de samlede koncentrationer af antistoffet (cAb)tot og antigen (cAg)tot er kendt, kan denne ligning anvendes til direkte at montere de eksperimentelle komponentfraktioner, der er fremkommet ved mp-målingerne, og beregne ligevægtskonstanterne Ka1 og Ka2 (se supplerende oplysninger).
MP-dataene kan også bruges til at anslå samarbejdet mellem de to antistofbindingssteder11. For to antistof paratoper med identiske mikroskopiske bindings konstanter, de statistiske faktorer, der beskriver processen med befolkningen i Ab· Ag og Ab· Ag2 komplekser dikterer, at den tilsyneladende makroskopiske ligevægt konstanter Ka1 og Ka2 vil ikke være numerisk lige, og Ka1 = 4Ka2. Forsøgsværdierne for Ka1 < 4Ka2 indikerer derfor positiv samarbejdsvillighed mellem de to antistofbindingssteder. På samme måde angiver Ka1 > 4Ka2 negativ samarbejdsvillighed.
MP målinger af antigen-antistof bindende affinitet er hurtige og kræver en lille mængde materiale. De MP-massefordelinger, der anvendes til beregninger af ligevægtskonstant, giver yderligere oplysninger om prøveegenskaberne og gør det muligt at vurdere prøvens renhed, oligomerisering og aggregering i et enkelt eksperiment. Den samme metode kan bruges til at måle høj affinitet protein-protein bindende, og MP er især nyttig til undersøgelser af multi-valent protein interaktioner. Multi-protein komplekser har normalt store molekylære masser, optimal for MP detektion, og enkelt-molekyle data kan bruges til at måle støkiometri og beregne tilhørsforhold af flere bindende steder samtidigt. Disse oplysninger er normalt vanskelige at opnå ved hjælp af bulk-baserede metoder.
Uden ændringer er den nuværende protokol velegnet til målinger af relativt høj affinitet, submikromolære interaktioner med antigener af en molekylmasse på 20 kDa eller større. For at opnå optimale resultater bør proteinlagrene være af høj renhed, men der er ingen specifikke bufferkrav. Ved hjælp af MP kan antigenantistofbindingen vurderes på mindre end fem minutter. Den dataindsamling og analyse, der kræves til nøjagtige Kd beregninger kan udføres inden for 30 minutter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

Målinger af specificiteten og affiniteten af antigenantistofinteraktioner er af afgørende betydning for medicinske og forskningsprogrammer. I denne protokol beskriver vi implementeringen af en ny enkeltmolekyleteknik, massefotometri (MP), til dette formål. MP er en etiket- og immobiliseringsfri teknik, der registrerer og kvantificerer molekylære masser og populationer af antistoffer og antigen-antistofkomplekser på et enkelt molekyleniveau. MP analyserer antigen-antistof prøven inden for få minutter, giver mulighed for præcis bestemmelse af den bindende affinitet og samtidig give oplysninger om støkiometri og oligomeric tilstand af proteiner. Dette er en enkel og ligetil teknik, der kræver kun picomole mængder af protein og ingen dyre forbrugsstoffer. Den samme procedure kan anvendes til at studere proteinproteinbinding for proteiner med en molekylmasse på over 50 kDa. For multivalente proteininteraktioner kan tilhørst af flere bindingssteder opnås i en enkelt måling. Men, enkelt-molekyle form for måling og den manglende mærkning pålægger nogle eksperimentelle begrænsninger. Denne metode giver de bedste resultater, når den anvendes til målinger af sub-mikromolar interaktion tilhørsforhold, antigener med en molekylær masse på 20 kDa eller større, og relativt rent protein prøver. Vi beskriver også proceduren for udførelse af de nødvendige tilpasnings- og beregningstrin ved hjælp af grundlæggende dataanalysesoftware.

Vi har tidligere undersøgt samspillet mellem humane α-thrombin (HT) og mus monoklonale anti-human trombin antistof (AHT) ved hjælp af MP baseret assay11. Da den molekylære masse af HT (37 kDa) er under 40 kDa-detektionsgrænsen, kan den maksimale prøvekoncentration overstige 50 nM MP-koncentrationsbegrænsningen uden at påvirke massefordelingens opløsning negativt. Forsøget var planlagt som en titrering serie med AHT antistof på en fast 25 nM koncentration, og HT ved koncentrationer på 7...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Vi beskriver en enkelt-molekyle tilgang til antigen-antistof affinitet målinger ved hjælp af masse fotometri (MP). MP-baserede protokol er hurtig, præcis, bruger en meget lille mængde materiale, og kræver ikke protein modifikation.

Hurtig bestemmelse af antistof-antigen affinitet ved massefotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Antistoffer anvendes rutinemæssigt i laboratorieteknikker, og deres terapeutiske og diagnostiske anvendelser udvides hurtigt. Hurtig og præcis antigen-antistofbindingskarakterisering er af afgørende betydning for disse applikationer. Massefotometri måler hurtigt bindende tilhørsforhold ved hjælp af ekstremt små mængder materiale.Ingen mærkning eller immobilisering er påkrævet, og oplysninger om protein oligomerisering og renhed kan fås fra samme eksperiment. Denne protokol kan ikke kun bruges til at studere antistoffer, men også til at måle stærke proteinproteinbindinger for proteiner med en molekylmasse på over 50 kilodaltons. Begynd med at bruge soft-tip tang og vask flasker til sekventielt skyl 24 med 50 millimeter coverslips fra top til bund med destilleret vand, ethanol, destilleret vand, isopropanol, og destilleret vand.Efter den sidste vask tørres dækslerne med en strøm af rent nitrogen i samme retning for at undgå at overføre forurening fra forstølen. Skyl 24 med 24 millimeter dækslæd med destilleret vand og ethanol som påvist, efterfulgt af tørring med en strøm af rent kvælstof. Efter tørring, placere en 24 af 24 millimeter coverslip på et stykke aluminiumsfolie og placere strimler af dobbeltsidet tape på coverslip.Skær derefter 24 med 24 millimeter dækslæb ud af folien og tryk forsigtigt folien på arbejdssiden af 24 med 50 millimeter dækslæb. For at forberede antistofantigenprøver til affinitetsmålingerne skal der filtreres mindst to milliliter PBS gennem et 0,22 mikron sprøjtefilter for at fjerne støvpartikler og aggregater og centrifuge antistoffet og antigenlagrene af interesse. Antistof- og antigenlagrene måles med 280 nanometerets UV-absorbans for at bestemme deres faktiske koncentrationer, og der udarbejdes en titreringsserie af antistofantigenblandinger ved et passende udvalg af antigenkoncentrationer i et endeligt volumen på 50 mikroliter pr. prøve.Derefter inkuberes antigen-antistofblandingerne i ca. 10 minutter ved stuetemperatur, så den bindende reaktion når kemisk ligevægt. For at vurdere antistof-antigen affinitet ved masse fotometri, anvende en dråbe mikroskop nedsænkning olie til instrumentet objektivet og placere flow kammer på scenen af mikroskopet. Der tilsættes 10 mikroliter filtreret PBS i den ene ende af flowkammerets kanal.Bufferen kommer ind i kanalen ved hjælp af kapillær handling. I fokuskontrolfanen i dataindsamlingssoftwaren skal du bruge knapperne til grov trinbevægelse op og ned til at foretage de første justeringer og klikke på skarphed for at få vist skarphedssignaludlæsningen. Brug justeringsknapperne med fin op- og ned til at maksimere skarphedsværdien, og klik på sæt fokus og lås fokus for at aktivere fokussporingsfunktionen.Et billede af et rent dias skal have en signalværdi på 0,05 % Belastning af 20 mikroliter af den første antistofantigenprøve som påvist, der blotting væsken fra den anden ende med et lille stykke blotting papir. Umiddelbart efter indlæsning skal du klikke på post for at få det rette antal rammer svarende til 100 sekunders data. I slutningen af dataindsamlingsperioden skal du angive et filnavn til dataene og klikke på OK og derefter prøve for at gemme filen.Hvis du vil analysere massefotometridataene, skal du åbne filen med interesse og klikke på Analysér. Klik på indlæsning for at indlæse kalibreringsfunktionen, og klik på filen, og gem resultater, så de analyserede data gemmes. For at opnå de relative koncentrationer af hver art i prøven åbnes de indskÃ 10, klarede arrangementerne.csv-fil, kopiere data i kolonne M i den relevante plotte og analyse software, og bruge plottet statistik histogram funktion til at plotte den molekylære masse distribution. Dobbeltklik på histogrammet for at åbne vinduet med plotegenskaber, deaktiver den automatiske placering og vælg en placeringsstørrelse på 2,5 kilodaltons. Hvis du vil oprette placeringscentre og optællingsdata, skal du klikke på anvend og gå.Hvis du vil tilpasse histogrammet til gaussiske funktioner, skal du markere placeringscentrene og tæller kolonner og klikke på analysetoppe og grundlinjemenufunktionen med flere spidsbelastninger. Dobbeltklik for at angive de omtrentlige spidsbelastningspositioner på fordelingsplottet, og klik på åbn NL-tilpasning. Kontroller de faste afkrydsningsfelter for XC peak centre og sæt deres værdier til de forventede molekylære masser af det frie antistof og enkelt og dobbelt antigen-antistof komplekser.Kontroller shareindstillingen for breddeparametrene, og klik på tilpas. De gaussiske bestanddelenes monterede tophøjdeværdier repræsenterer den relative koncentration af hver art i prøven. Brug derefter ligningen til at beregne koncentrationsfraktionen af hver art ud fra tophøjdeværdierne.Hvis du vil beregne ligevægtskonstanter ved hjælp af et regnearksprogram, skal du åbne dissociationconstantcalculationen. xlsx-regneark. I dette regneark kan de gule fremhævede celleværdier i række 1 til 10 ændres for at udføre ligevægtskonstanteberegningerne.Angiv de anslåede dissociationskonstante værdier i nanomolarenheder i cellerne B1 og B2. Hvis de anslåede dissociationskonstante værdier ikke er kendt, skal standardværdierne i cellerne B1 og B2 forblive uændrede. De samlede antistof- og antigenkoncentrationer i nanomolarenheder indgås i cellerne D2 og E2, og de beregnede fraktionsværdier for hver art indgås i cellerne F2, G2 og H2. Når du udfører en global analyse af titreringen, skal du lægge de relevante datafraktionværdier i række 2 til 10. I problemløserparametrene skal du vælge celle B15 for den indstillede målboks og cellerne B1 til B2 for feltet ved at ændre variable celler.Vælg min-knappen for at vælge indstillingen og markere make unconstrained variabler ikke-negative afkrydsningsfelt, og vælg derefter GRG ikke-lineær som løsningsmetode og klik på løse. De bedst egnede dissociationskonstante værdier vises i cellerne B1 og B2. Og den endelige sum af de kvadrerede fejl vil blive vist i celle B15. I dette repræsentative eksperiment blev der udført en titreringsserie med anti-human trombinantistof ved en fast 25 nanomolarkoncentration og 0, 7,5, 15, 30, 60 og 120 nanomolar humane alfa-trombinkoncentrationer for at opnå de molekylære massefordelinger af antigenantistofblandingerne og kun antistoffet.Parametrene for den bedst egnede tophøjde for de gaussiske komponenter blev normaliseret for at opnå artskoncentrationsfraktioner. Koncentrationsfraktionværdierne blev derefter samlet for at opnå antigenantistofbindende tilhørsforhold. De eksperimentelle koncentrationsfraktioner og de globale tilpasningsresultater for det frie antistof, enkelt antigen-antistofkompleks og dobbelt antigenkompleks kan derefter afbildes.For at opnå nøjagtige KD-værdier skal proteinkoncentrationer nøje udvælges for at befolke alle reaktionsarterne. Vi anbefaler, at du forbereder en titreringsserie ved hjælp af en række antigenkoncentrationer. Efter montering af dataene kan fejlprojektionsmetoden bruges til at opnå tilpasningsfejlen, men det er bedre at gentage eksperimentet og beregne standardafvigelserne for de gennemsnitlige bindende affinitetsværdier.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Artsbestemmelse og kvantificering i blandinger Brug MRM massespektrometri af peptider Anvendt til Kød Authentication

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

En hurtig Laser Sondering Metode Letter ikke-invasive og Kontakt-fri Bestemmelse af Leaf Termiske egenskaber

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse af høj-affinitet antistof-antigen Bindende Kinetics Brug Fire Biosensor Platforme

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestemmelse af Protease specificitet i mus væv ekstrakter af MALDI-TOF-massespektrometri: manipulere PH for at forårsage specificitet ændringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifikation af inositol fosfat eller Phosphoinositide interagerende proteiner ved affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiveret tvær kædet Agopstået for den hurtige udvikling af affinitets kromatografi harpiks-antistof opsamling som et casestudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...