Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Wij danken Keir Neuman voor zijn kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het intramurale programma van de NHLBI, NIH.

1. Bereid de stroomkamers voor
<ol><li>Maak de glazen hesjes schoon<ol>
<li>Met behulp van wasflessen met gedestilleerd water, ethanol en isopropanol, spoel de 24 mm x 50 mm covers in de volgende volgorde: water, ethanol, water, isopropanol, water. Droog de coverslips met een stroom van schone stikstof. Het is belangrijk om de coverslips van boven naar beneden te spoelen, waarbij de onderste hoek met zachte tangen wordt vastgehouden. Droog de afdekken in dezelfde richting om besmetting van de tangen te voorkomen (<stro...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

Het op massafotometrie gebaseerde protocol dat hier wordt beschreven, biedt een snelle en nauwkeurige methode voor het meten van antigeen-antilichaambindingsafdijningen. MP-analyse maakt gebruik van een zeer kleine hoeveelheid materiaal, en aanvullende informatie, waaronder stoichiometrie, oligomerisatie en zuiverheid, kan worden beoordeeld aan de hand van dezelfde gegevens(figuur 5). Zonder wijzigingen is deze methode van toepassing op de metingen van dissociatieconstanten in het ongeveer 5...

Antilichamen zijn alomtegenwoordige instrumenten van moleculaire biologie geworden en worden op grote schaal gebruikt in zowel medische als onderzoekstoepassingen. In de geneeskunde zijn ze van cruciaal belang in de diagnostiek, maar hun therapeutische toepassingen worden ook uitgebreid en nieuwe op antilichamen gebaseerde therapieën worden voortdurend ontwikkeld1,2,3,4. De wetenschappelijke toepassingen van antilichamen omvatten vele onmisbare laboratoriumtechnieken zoals immunofluorescentie5,immunoprecipitatie6, stroomcytometrie7,ELISA en westerse blotting. Voor elk van deze toepassingen is het verkrijgen van nauwkeurige metingen van de bindende eigenschappen van het antilichaam, inclusief bindende affiniteit en specificiteit, van cruciaal belang.
Sinds de introductie van het eerste commerciële oppervlakteplasmon resonantie (SPR) instrument in 1990 zijn optische biosensoren de "gouden standaard" van antilichaamkarakterisering geworden, maar andere technieken, waaronder ELISA, worden ook routinematig gebruikt om antilichaamaffinities8,9te meten . Deze methoden vereisen meestal immobilisatie of etikettering van de geanalyseerde moleculen, die mogelijk van invloed kunnen zijn op de interactie van belang. Ze zijn ook relatief traag, waarbij meerdere teststappen voordat de resultaten kunnen worden verzameld voor gegevensanalyse. Een onlangs ontwikkelde single-molecule methode, massa fotometrie (MP), detecteert moleculen direct in oplossing wanneer ze landen op het oppervlak van de microscoop coverslip10,11. De op lichtverstrooiing gebaseerde optische detectie die MP gebruikt, vereist geen eiwitlabeling of modificatie. Individuele eiwitmoleculen worden geregistreerd door de interferometrische verstrooiingsmicroscoop als donkere vlekken die in de afbeelding verschijnen(figuur 1D), en enkele duizenden moleculen kunnen worden gedetecteerd tijdens de data-acquisitie van één minuut12. Het signaal dat door elk afzonderlijk deeltje wordt gegenereerd, wordt gekwantificeerd en de contrastwaarde (relatieve duisternis) wordt berekend. De interferometrische contrastwaarden zijn evenredig aan de moleculaire massa's van de eiwitten, waardoor gebonden en vrije soorten in het antigeen-antilichaammengsel kunnen worden geïdentificeerd. Tegelijkertijd meet MP door moleculaire landingsgebeurtenissen te tellen rechtstreeks de soortenpopulaties. Dit geeft MP gebaseerde methoden een unieke mogelijkheid om onafhankelijk te kwantificeren affiniteiten van meerdere bindende sites.
Binding van de antigeen (Ag)moleculen aan de twee bindende plaatsen van het intacte antilichaam (Ab) kan worden omschreven als: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> met de evenwichtsassociatie constanten Ka1 en Ka2 gedefinieerd als: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> waar ci en fi respectievelijk concentratie en fractie van het onderdeel ivertegenwoordigen. De totale antigeenconcentratie (cAg)tot kan worden uitgedrukt als: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Aangezien de totale concentraties van het antilichaam (cAb)tot en antigeen (cAg)tot bekend zijn, kan deze vergelijking worden gebruikt om rechtstreeks te passen bij de experimentele componentfracties verkregen uit de MP-metingen en de evenwichtsstifies Ka1 en Ka2 te berekenen (zie Aanvullende informatie).
De MP-gegevens kunnen ook worden gebruikt om de samenwerking tussen de twee antilichaambindende sites11te schatten . Voor twee antilichaamparatopes met identieke microscopische bindende constanten, de statistische factoren die het proces van bevolking van Abbeschrijven · Ag en Ab· Ag2 complexen dicteren dat de schijnbare macroscopische evenwichtsconstanten Ka1 en Ka2 zal niet numeriek gelijk zijn, en Ka1 = 4Ka2. Daarom wijzen de experimentele waarden van Ka1 < 4Ka2 op een positieve samenwerking tussen de twee antilichaambindingslocaties. K a1 > 4Ka2 geeft ook negatieve samenwerking aan.
MP-metingen van de antigeen-antilichaambinding zijn snel en vereisen een kleine hoeveelheid materiaal. De MP-massaverdelingen die worden gebruikt voor evenwichtsconstante berekeningen bieden aanvullende informatie over de eigenschappen van het monster en maken de beoordeling van de monsterzuiverheid, oligomerisatie en aggregatie in één experiment mogelijk. Dezelfde methode kan worden gebruikt om hoge affiniteit eiwit-eiwit binding te meten, en MP is vooral nuttig voor studies van multi-valent eiwit interacties. Multi-eiwit complexen hebben meestal grote moleculaire massa's, optimaal voor MP detectie, en single-molecule gegevens kunnen worden gebruikt om stoichiometrie te meten en affinities van meerdere bindende sites tegelijk te berekenen. Deze informatie is meestal moeilijk te verkrijgen met behulp van bulk-gebaseerde methoden.
Zonder wijzigingen is het huidige protocol geschikt voor metingen van relatief hoge affiniteit, submicromolar interacties met antigenen van een moleculaire massa van 20 kDa of groter. Voor optimale resultaten moeten eiwitvoorraden van hoge zuiverheid zijn, maar er zijn geen specifieke buffervereisten. Door mp te gebruiken, kan de antigeen-antilichaambinding in minder dan vijf minuten worden beoordeeld. Het verzamelen en analyseren van gegevens die nodig zijn voor nauwkeurige Kd-berekeningen kan binnen 30 minuten worden uitgevoerd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

Metingen van de specificiteit en affiniteit van antigeen-antilichaam interacties zijn van cruciaal belang voor medische en onderzoekstoepassingen. In dit protocol beschrijven we de implementatie van een nieuwe single-molecule techniek, massa fotometrie (MP), voor dit doel. MP is een label- en immobilisatievrije techniek die moleculaire massa's en populaties van antilichamen en antigeen-antilichaamcomplexen op één molecuulniveau detecteert en kwantificeert. MP analyseert het antigenantilichaammonster binnen enkele minuten, waardoor de bindingsaffiniteit nauwkeurig kan worden bepaald en tegelijkertijd informatie kan worden verstrekt over de stoichiometrie en de oligomeric toestand van de eiwitten. Dit is een eenvoudige en eenvoudige techniek die alleen picomole hoeveelheden eiwit en geen dure verbruiksgoederen vereist. Dezelfde procedure kan worden gebruikt om eiwit-eiwitbinding te bestuderen voor eiwitten met een moleculaire massa groter dan 50 kDa. Voor multivalente eiwitinteracties kunnen de affiniteiten van meerdere bindingsplaatsen in één meting worden verkregen. Echter, de single-molecule wijze van meting en het ontbreken van etikettering legt een aantal experimentele beperkingen. Deze methode geeft de beste resultaten wanneer toegepast op metingen van sub-micromolar interactie affiniteiten, antigenen met een moleculaire massa van 20 kDa of groter, en relatief zuivere eiwitmonsters. We beschrijven ook de procedure voor het uitvoeren van de vereiste montage- en berekeningsstappen met behulp van basisgegevensanalysesoftware.

We hebben eerder onderzocht de interactie van de menselijke α-trombin (HT) en muis monoklonale anti-menselijke trombine antilichaam (AHT) met behulp van de MP gebaseerde test11. Aangezien de moleculaire massa van de HT (37 kDa) onder de detectiegrens van 40 kDa ligt, kan de maximale steekproefconcentratie de concentratiebeperking van 50 nM MP overschrijden zonder de resolutie van massaverdelingen negatief te beïnvloeden. Het experiment was gepland als een titratieserie met het AHT-antilichaam bi...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

We beschrijven een single-molecule benadering van antigeen-antilichaam affiniteit metingen met behulp van massa fotometrie (MP). Het MP-gebaseerde protocol is snel, nauwkeurig, gebruikt een zeer kleine hoeveelheid materiaal en vereist geen eiwitmodificatie.

Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Antilichamen worden routinematig gebruikt in laboratoriumtechnieken en hun therapeutische en diagnostische toepassingen breiden zich snel uit. Snelle en nauwkeurige antigeen-antilichaam bindende karakterisering is van cruciaal belang voor deze toepassingen. Massafotometrie meet snel bindende affiniteiten met extreem kleine hoeveelheden materiaal.Er is geen etikettering of immobilisatie vereist en informatie over eiwitreligie en zuiverheid kan worden verkregen uit hetzelfde experiment. Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt om antilichamen te bestuderen, maar ook om sterke eiwit-eiwitbindingen te meten voor eiwitten met een moleculaire massa groter dan 50 kilodaltons. Begin met het gebruik van soft-tip tangen en wasflessen om achtereenvolgens 24 bij 50 millimeter coverslips van boven naar beneden te spoelen met gedestilleerd water, ethanol, gedestilleerd water, isopropanol en gedestilleerd water.Na de laatste wasbeurt droog je de covers met een stroom schone stikstof in dezelfde richting om besmetting van de tangen te voorkomen. Spoel 24 bij 24 millimeter coverslips met gedestilleerd water en ethanol zoals aangetoond, gevolgd door drogen met een stroom van schone stikstof. Na het drogen, plaats een 24 bij 24 millimeter coverslip op een stuk aluminiumfolie en plaats stroken van dubbelzijdige tape op de coverslip.Snijd vervolgens de 24 bij 24 millimeter coverslip uit de folie en druk de folie voorzichtig op de werkende kant van de 24 bij 50 millimeter coverslip. Om antilichaam-antigeenmonsters voor te bereiden op de affiniteitsmetingen, filtert u ten minste twee milliliter PBS door een spuitfilter van 0,22 micron om stofdeeltjes en aggregaten te verwijderen en de antilichaam- en antigeenvoorraden te centrifugeren. Meet de 280 nanometer UV-absorptie van de antilichamen en antigeenvoorraden om hun werkelijke concentraties te bepalen en bereid een titratiereeks van antilichaam-antigeenmengsels voor op het juiste bereik van antigeenconcentraties in een eindvolume van 50 microliter per monster.Vervolgens de antigeen-antilichaammengsels ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur uitbroeden om de bindingsreactie in staat te stellen chemisch evenwicht te bereiken. Om de antilichaam-antigeen affiniteit te beoordelen door middel van massa fotometrie, breng een druppel microscoop onderdompeling olie aan op het instrument doel en plaats de flow kamer op het stadium van de microscoop. Voeg 10 microliter gefilterde PBS toe aan het ene uiteinde van het kanaal van de stroomkamer.De buffer komt het kanaal binnen door capillaire actie. Gebruik in het tabblad Focus control van de software voor het verzamelen van gegevens de grove trapbeweging op en neer om de eerste aanpassingen aan te brengen en op scherpte te klikken om de uitlezing van het scherptesignaal weer te geven. Gebruik de fijne op- en neerverstellingsknoppen om de scherptewaarde te maximaliseren en klik op scherpstelling en vergrendelfocus om de focustrackingfunctie te activeren.Een afbeelding van een schone dia moet een signaalwaarde hebben die gelijk is aan of lager is dan 0,05%Load 20 microliters van het eerste antilichaam-antigeenmonster zoals aangetoond, waarbij de vloeistof van het andere uiteinde wordt bedekt met een klein stukje vlekpapier. Klik onmiddellijk na het laden op record om het juiste aantal frames te verkrijgen dat gelijk is aan 100 seconden aan gegevens. Voer aan het einde van de periode voor het verzamelen van gegevens een bestandsnaam voor de gegevens in en klik op OK en vervolgens op voorbeeld om het bestand op te slaan.Als u de gegevens van de massafotometrie wilt analyseren, opent u het interessant bestand en klikt u op analyseren. Klik op laden om de kalibratiefunctie te laden en klik op bestand en sla resultaten op om de geanalyseerde gegevens op te slaan. Open de ingelaste gebeurtenissen om de relatieve concentraties van elke soort in het monster te verkrijgen.csv-bestand, kopieer de gegevens in kolom M in de juiste plotten en analyse software, en gebruik de plot statistieken histogram functie om de moleculaire massaverdeling plot. Dubbelklik op het histogram om het venster ploteigenschappen te openen, de automatische opslaglocatie uit te schakelen en een opslaglocatiegrootte van 2,5 kilodaltons te selecteren. Als u de opslaglocatiecentra wilt maken en gegevens wilt tellen, klikt u op toepassen en gaan.Als u het histogram wilt aanpassen met Gaussische functies, selecteert u de opslaglocatiecentra en telt u kolommen en klikt u op de analysepieken en de basislijnvakfunctie voor meerdere piekpast. Dubbelklik om de geschatte piekposities op het distributieperceel aan te geven en klik op open NL fit. Controleer de vaste selectievakjes voor de XC-piekcentra en stel hun waarden in op de verwachte moleculaire massa's van het vrije antilichaam en de enkele en dubbele antigeen-antilichaamcomplexen.Controleer de optie delen op de breedteparameters en klik op pasvorm. De ingerichte piekhoogtewaarden van de Gaussische componenten vertegenwoordigen de relatieve concentratie van elke soort in het monster. Gebruik vervolgens de vergelijking om de concentratiefractie van elke soort te berekenen op basis van de piekhoogtewaarden.Als u evenwichtsconstanten wilt berekenen met behulp van een spreadsheetprogramma, opent u de dissociatieconstantcalculatie. xlsx-werkblad. In dit werkblad kunnen de geel gemarkeerde celwaarden in rijen 1 tot en met 10 worden gewijzigd om de constante berekeningen van het evenwicht uit te voeren.Voer de geschatte dissociatieconstantewaarden in nanomolar-eenheden in de cellen B1 en B2 in. Als de geschatte dissociatieconstantewaarden niet bekend zijn, blijven de standaardwaarden in de cellen B1 en B2 ongewijzigd. Voer de totale antilichaam- en totale antigeenconcentraties in nanomolar-eenheden in de cellen D2 en E2 in en voer de berekende fractiewaarden voor elke soort in de cellen F2, G2 en H2. Voeg bij het uitvoeren van een globale analyse van de titratie de juiste gegevensfractiewaarden toe aan rijen 2 tot en met 10. Selecteer in het venster parameters van de oplosser cel B15 voor het ingestelde doelvak en de cellen B1 tot B2 voor het vak Variabele cellen.Selecteer de min-knop voor de optie naar en schakel het selectievakje Niet-negatieve variabelen maken in en selecteer GRG nonlinear als oplosmethode en klik op oplossen. De constante waarden van de best passende dissociatie worden weergegeven in de cellen B1 en B2. En de uiteindelijke som van de kwadraatfouten wordt weergegeven in cel B15. In dit representatieve experiment werd een titratiereeks uitgevoerd met het anti-menselijke trombineantilichaam bij een vaste concentratie van 25 nanomolar en 0, 7,5, 15, 30, 60 en 120 nanomolar menselijke alfa-trombinconcentraties om de moleculaire massaverdelingen van de antigeen-antilichaammengsels en het concentratiemonster alleen te verkrijgen.Best fit piekhoogte parameters van de Gaussische componenten werden genormaliseerd om soorten concentratie fracties te verkrijgen. De concentratiefractiewaarden waren vervolgens wereldwijd geschikt om de antigeen-antilichaambindende affiniteiten te verkrijgen. De experimentele concentratiefracties en de globale pasvormresultaten voor het vrije antilichaam, het enkele antigeen-antilichaamcomplex en het dubbele antigeencomplex kunnen dan worden uitgezet.Om nauwkeurige KD-waarden te verkrijgen, moeten eiwitconcentraties zorgvuldig worden geselecteerd om alle reactiesoorten te bevolken. We raden u aan een titratieserie te bereiden met behulp van een reeks antigeenconcentraties. Na het monteren van de gegevens kan de foutprojectiemethode worden gebruikt om de montagefout te verkrijgen, maar het is beter om het experiment te herhalen en de standaardafwijkingen van de gemiddelde bindingsaffiniteitswaarden te berekenen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Soorten Bepaling en kwantificering in mengsels met behulp van MRM Massaspectrometrie van peptiden Applied to Meat Authentication

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Een Rapid Laser Probing Methode faciliteert de niet-invasieve en Contacteer-vrij Bepaling van Leaf thermische eigenschappen

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Geactiveerde kruisgebonden agarose voor de snelle ontwikkeling van Affiniteits chromatografie harsen-antilichamen vangen als een casestudy

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...