Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
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Nous remercions Keir Neuman pour sa lecture critique du manuscrit. Ce travail a été appuyé par le programme intra-muros de l’ICSLNH, nih.

1. Préparer les chambres d’écoulement
<ol><li>Nettoyez les couvertures en verre<ol>
<li>À l’aide de bouteilles de lavage à l’eau distillée, à l’éthanol et à l’isopropanol, rincez les couvercles de 24 mm x 50 mm dans l’ordre suivant : eau, éthanol, eau, isopropanol, eau. Séchez les couvertures avec un jet d’azote propre. Il est important de rincer les coverslips de haut en bas, en tenant le coin inférieur avec des forceps à pointe molle. Séchez le coverslip dans la même direction pour éviter...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

Le protocole basé sur la photométrie de masse décrit ici fournit une méthode rapide et précise de mesure des affinités de liaison antigène-anticorps. L’analyse mp utilise une très petite quantité de matériel, et des informations supplémentaires , y compris la stoichiométrie, l’oligomérisation et la pureté , peuvent être évaluées à partir des mêmes données (figure 5). Sans modifications, cette méthode s’applique aux mesures des constantes de dissociation d’environ...

Les anticorps sont devenus des outils omniprésents de la biologie moléculaire et sont largement utilisés dans les applications médicales et de recherche. En médecine, ils sont d’une importance cruciale dans le diagnostic, mais leurs applications thérapeutiques sont également en expansion et de nouvelles thérapies à base d’anticorps sont constamment développés1,2,3,4. Les applications scientifiques des anticorps incluent beaucoup de techniques indispensables de laboratoire telles que l’immunofluorescence5,l’immunoprécipice6,la cytométriede flux 7,ELISA, et le blotting occidental. Pour chacune de ces applications, l’obtention de mesures précises des propriétés contraignantes de l’anticorps, y compris l’affinité et la spécificité contraignantes, est d’une importance cruciale.
Depuis l’introduction du premier instrument commercial de résonance plasmon de surface (SPR) en 1990, les biocapteurs optiques sont devenus l’étalon-or de la caractérisation des anticorps, mais d’autres techniques, y compris l’ELISA, sont également couramment utilisées pour mesurer les affinités d’anticorps8,9. Ces méthodes nécessitent généralement l’immobilisation ou l’étiquetage des molécules analysées, ce qui peut potentiellement affecter l’interaction d’intérêt. Ils sont également relativement lents, impliquant plusieurs étapes d’analyse avant que les résultats puissent être recueillis pour l’analyse des données. Une méthode à molécule unique récemment mise au point, la photométrie de masse (MP), détecte les molécules directement en solution lorsqu’elles atterrissent à la surface du microscope coverslip10,11. La détection optique à base de diffusion de lumière que MP utilise ne nécessite pas d’étiquetage ou de modification des protéines. Les molécules protéiques individuelles sont enregistrées par le microscope de diffusion interférométrique comme des taches sombres apparaissant dans l’image (Figure 1D), et plusieurs milliers de molécules peuvent être détectées lors de l’acquisition de données d’une minute12. Le signal généré par chaque particule individuelle est quantifié, et sa valeur de contraste (obscurité relative) est calculée. Les valeurs de contraste interférométriques sont proportionnelles aux masses moléculaires des protéines, ce qui permet l’identification d’espèces liées et libres dans le mélange antigène-anticorps. Dans le même temps, en comptant les événements d’atterrissage moléculaire, MP mesure directement les populations d’espèces. Cela donne aux méthodes basées sur mp une capacité unique de quantifier indépendamment les affinités de plusieurs sites de liaison.
La liaison des molécules del’antigène (Ag)aux deux sites de liaison de l’anticorps intact (Ab) peut être décrite comme : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> avec l’association d’équilibre constantes Ka1 et Ka2 définies comme : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> où ci et fi représentent la concentration et la fraction du composant i, respectivement. La concentration totale d’antigène( cAg)tot peut être exprimée comme: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Étant donné que les concentrations totales de l’anticorps (cAb)tot etantigène( cAg)tot sont connus, cette équation peut être utilisée pour s’adapter directement aux fractions de composants expérimentaux obtenues à partir des mesures MP et calculer les constantes de l’association d’équilibre Ka1 et Ka2 (voir Information supplémentaire).
Les données MP peuvent également être utilisées pour estimer la cooperativité entre les deux sites de liaison d’anticorps11. Pour deux paratopes d’anticorps avec des constantes microscopiques identiques de liaison, les facteurs statistiques décrivant le processus de population de l’Ab· Ag et Ab· Ag2 complexes dictent que l’équilibre macroscopique apparent constantes Ka1 et Ka2 ne sera pas numériquement égal, et Ka1 = 4Ka2. Par conséquent, les valeurs expérimentales de Ka1 < 4Ka2 indiquent une cooperativité positive entre les deux sites de liaison d’anticorps. De même, Ka1 > 4Ka2 indique la cooperativité négative.
Les mesures mp de l’affinité de liaison antigène-anticorps sont rapides et nécessitent une petite quantité de matériel. Les distributions de masse MP utilisées pour les calculs constants d’équilibre fournissent des informations supplémentaires sur les propriétés de l’échantillon et permettent d’évaluer la pureté de l’échantillon, l’oligomérisation et l’agrégation en une seule expérience. La même méthode peut être utilisée pour mesurer la liaison protéine-protéine à haute affinité, et mp est particulièrement utile pour les études sur les interactions protéiques multi-valent. Les complexes multi-protéines ont généralement de grandes masses moléculaires, optimales pour la détection mp, et les données d’une molécule peuvent être utilisées pour mesurer la stoichiométrie et calculer les affinités de plusieurs sites de liaison simultanément. Ces informations sont généralement difficiles à obtenir à l’aide de méthodes en vrac.
Sans modifications, le protocole actuel convient aux mesures d’interactions sous-micromolaires relativement élevées avec des antigènes d’une masse moléculaire de 20 kDa ou plus. Pour des résultats optimaux, les stocks de protéines doivent être d’une grande pureté, mais il n’y a pas d’exigences spécifiques en matière de tampon. En utilisant MP, la liaison antigène-anticorps peut être évaluée en moins de cinq minutes. La collecte et l’analyse des données requises pour des calculs Kd précis peuvent être effectuées dans les 30 minutes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

Les mesures de la spécificité et de l’affinité des interactions antigène-anticorps sont d’une importance cruciale pour les applications médicales et de recherche. Dans ce protocole, nous décrivons la mise en œuvre d’une nouvelle technique à molécule unique, la photométrie de masse (MP), à cette fin. MP est une technique sans étiquette et sans immobilisation qui détecte et quantifie les masses moléculaires et les populations d’anticorps et de complexes anticorps à un niveau d’une seule molécule. MP analyse l’échantillon d’antigène-anticorps en quelques minutes, permettant la détermination précise de l’affinité contraignante et fournissant simultanément des informations sur la stoichiométrie et l’état oligomérique des protéines. Il s’agit d’une technique simple et simple qui ne nécessite que des quantités picomoles de protéines et pas de consommables coûteux. La même procédure peut être utilisée pour étudier la liaison protéines-protéines pour les protéines dont la masse moléculaire est supérieure à 50 kDa. Pour les interactions protéiques multivalentes, les affinités de plusieurs sites de liaison peuvent être obtenues en une seule mesure. Cependant, le mode de mesure à molécule unique et l’absence d’étiquetage imposent certaines limites expérimentales. Cette méthode donne les meilleurs résultats lorsqu’elle est appliquée à des mesures d’affinités d’interaction sous-micromolaire, d’antigènes d’une masse moléculaire de 20 kDa ou plus, et d’échantillons de protéines relativement purs. Nous décrivons également la procédure d’exécution des étapes de montage et de calcul requises à l’aide d’un logiciel d’analyse de données de base.

Nous avons précédemment examiné l’interaction de la α-thrombine humaine (HT) et de l’anticorps anti-thrombine anti-humain de souris (AHT) utilisant l’essai basé sur MP11. Étant donné que la masse moléculaire du HT (37 kDa) est inférieure à la limite de détection de 40 kDa, la concentration maximale de l’échantillon peut dépasser la limite de concentration de 50 nM MP sans affecter négativement la résolution des distributions de masse. L’expérience a été planifiée comme...

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Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Nous décrivons une approche à molécule unique aux mesures d’affinité d’antigène-anticorps utilisant la photométrie de masse (MP). Le protocole basé sur mp est rapide, précis, utilise une très petite quantité de matériel, et ne nécessite pas de modification des protéines.

Détermination rapide de l’affinité anticorps-antigène par photométrie de masse

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Les anticorps sont couramment utilisés dans les techniques de laboratoire et leurs applications thérapeutiques et diagnostiques se développent rapidement. La caractérisation rapide et précise de liaison antigène-anticorps est d’une importance cruciale pour ces applications. La photométrie de masse mesure rapidement les affinités contraignantes à l’aide de très petites quantités de matériel.Aucune étiquetage ou immobilisation n’est nécessaire et des informations sur l’oligomérisation et la pureté des protéines peuvent être obtenues à partir de la même expérience. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour étudier les anticorps, mais aussi pour mesurer de fortes liaisons protéines-protéines pour les protéines dont la masse moléculaire est supérieure à 50 kilodaltons. Commencez par utiliser des forceps à pointe molle et lavez les bouteilles pour rincer séquentiellement 24 par 50 millimètres de couvertures de haut en bas avec de l’eau distillée, de l’éthanol, de l’eau distillée, de l’isopropanol et de l’eau distillée.Après le dernier lavage, séchez les couvercles avec un jet d’azote propre dans la même direction pour éviter de transférer la contamination par les forceps. Rincer 24 couverts de 24 millimètres avec de l’eau distillée et de l’éthanol comme démontré, suivi du séchage avec un jet d’azote propre. Après séchage, déposer un couvercle de 24 par 24 millimètres sur un morceau de papier d’aluminium et placer des bandes de ruban adhésif à double face sur le coverslip.Ensuite, coupez le coverslip de 24 par 24 millimètres de la feuille et appuyez doucement sur le papier d’aluminium sur le côté de travail de la couverture de 24 par 50 millimètres. Pour préparer des échantillons d’anticorps-antigènes pour les mesures d’affinité, filtrez au moins deux millilitres de PBS à travers un filtre à seringues de 0,22 micron pour éliminer les particules de poussière et les agrégats, et centrifugez les stocks d’anticorps et d’antigènes d’intérêt. Mesurer l’absorption UV de 280 nanomètres des stocks d’anticorps et d’antigènes pour déterminer leurs concentrations réelles et préparer une série de mélanges anticorps-antigènes à la gamme appropriée de concentrations d’antigènes dans un volume final de 50 microlitres par échantillon.Puis incuber les mélanges antigène-anticorps pendant environ 10 minutes à température ambiante pour permettre à la réaction de liaison d’atteindre l’équilibre chimique. Pour évaluer l’affinité anticorps-antigène par photométrie de masse, appliquez une goutte d’huile d’immersion au microscope sur l’objectif de l’instrument et placez la chambre d’écoulement sur le stade du microscope. Ajouter 10 microlitres de PBS filtré à une extrémité du canal de chambre d’écoulement.Le tampon entrera dans le canal par action capillaire. Dans l’onglet de contrôle de mise au point du logiciel de collecte de données, utilisez les boutons de mouvement de scène grossier de haut en bas pour effectuer les ajustements initiaux et cliquez sur la netteté pour afficher la lecture du signal de netteté. Utilisez les boutons d’ajustement de haut en bas fins pour maximiser la valeur de netteté et cliquez sur définir la mise au point et la mise au point de verrouillage pour activer la fonction de suivi de mise au point.Une image d’une diapositive propre doit avoir une valeur de signal égale ou inférieure à 0,05 %Chargez 20 microlitres du premier échantillon d’antigène comme démontré, buvant le liquide de l’autre extrémité avec un petit morceau de papier buvard. Immédiatement après le chargement, cliquez sur enregistrer pour obtenir le nombre approprié d’images équivalent à 100 secondes de données. À la fin de la période de collecte de données, entrez un nom de fichier pour les données et cliquez sur OK, puis échantillon pour enregistrer le fichier.Pour analyser les données de photométrie de masse, ouvrez le fichier d’intérêt et cliquez sur analyser. Cliquez sur charge pour charger la fonction d’étalonnage et cliquez sur fichier et enregistrer les résultats afin d’enregistrer les données analysées. Pour obtenir les concentrations relatives de chaque espèce dans l’échantillon, ouvrez les événements.fichier csv, copier les données dans la colonne M dans le logiciel de traçage et d’analyse approprié, et utiliser la fonction histogramme statistiques intrigue pour tracer la distribution de masse moléculaire. Double-cliquez sur l’histogramme pour ouvrir la fenêtre des propriétés de la parcelle, désactiver le binning automatique, et sélectionnez une taille de bac de 2,5 kilodaltons. Pour créer les centres de bacs et les données de compte, cliquez sur appliquer et aller.Pour adapter l’histogramme aux fonctions gaussiennes, sélectionnez les centres de bac et compte les colonnes et cliquez sur les pics d’analyse et la fonction de menu de pointe multiple de base. Double-cliquez pour indiquer les positions approximatives de pointe sur le tracé de distribution et cliquez sur l’ajustement NL ouvert. Vérifiez les cases à cocher fixes pour les centres de pointe XC et définissez leurs valeurs aux masses moléculaires attendues de l’anticorps libre et des complexes d’antigènes-anticorps simples et doubles.Vérifiez l’option de partage pour les paramètres de largeur et cliquez sur ajustement. Les valeurs de hauteur maximale ajustées des composants gaussiens représentent la concentration relative de chaque espèce dans l’échantillon. Utilisez ensuite l’équation pour calculer la fraction de concentration de chaque espèce à partir des valeurs de hauteur maximale.Pour calculer les constantes d’équilibre à l’aide d’un programme de feuille de calcul, ouvrez le calcul de la dissociation. feuille de travail xlsx. Dans cette feuille de travail, les valeurs cellulaires surlignées jaunes dans les lignes 1 à 10 peuvent être modifiées pour effectuer les calculs constants d’équilibre.Entrez les valeurs constantes de dissociation estimées dans les unités nanomolaires dans les cellules B1 et B2. Si les valeurs constantes de dissociation estimées ne sont pas connues, laissez les valeurs par défaut dans les cellules B1 et B2 inchangées. Entrez les concentrations totales d’anticorps et d’antigènes totaux dans les unités nanomolaires dans les cellules D2 et E2 et entrez les valeurs calculées de fraction pour chaque espèce dans les cellules F2, G2 et H2. Lors de l’analyse globale de la titration, ajoutez les valeurs de fraction de données appropriées dans les lignes 2 à 10. Dans la fenêtre paramètres solveur, sélectionnez la cellule B15 pour la boîte objective définie et les cellules B1 à B2 pour la boîte de cellules variables en changeant.Sélectionnez le bouton min pour l’option et vérifiez la case à cocher non négative des variables non contraintes, puis sélectionnez GRG non lignear comme méthode de résolution et cliquez sur résoudre. Les valeurs constantes de dissociation les mieux adaptées seront indiquées dans les cellules B1 et B2. Et la somme finale des erreurs au carré sera affichée dans la cellule B15. Dans cette expérience représentative, une série de titration avec l’anticorps anti-humain de thrombine à une concentration humaine fixe de 25 nanomolaires et 0, 7.5, 15, 30, 60, et 120 concentrations humaines nanomolaires d’alpha-thrombine ont été exécutées pour obtenir les distributions moléculaires de masse des mélanges d’antigène-anticorps et de l’échantillon seulement d’anticorps.Les paramètres de hauteur maximale les mieux adaptés des composants gaussiens ont été normalisés pour obtenir des fractions de concentration d’espèces. Les valeurs de fraction de concentration étaient alors adaptées globalement pour obtenir les affinités de liaison d’antigène-anticorps. Les fractions expérimentales de concentration et les résultats d’ajustement global pour l’anticorps libre, le complexe simple d’antigène-anticorps, et le complexe double d’antigène pourraient alors être tracés.Pour obtenir des valeurs de KD précises, les concentrations de protéines doivent être soigneusement sélectionnées pour peupler toutes les espèces de réaction. Nous vous recommandons de préparer une série de titrations à l’aide d’une gamme de concentrations d’antigènes. Après ajustement des données, la méthode de projection d’erreur peut être utilisée pour obtenir l’erreur de montage, mais il est préférable de répéter l’expérience et de calculer les écarts types des valeurs moyennes d’affinité de liaison.

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