Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
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Wir danken Keir Neuman für seine kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch das intramurale Programm des NHLBI, NIH unterstützt.

1. Bereiten Sie die Strömungskammern vor
<ol><li>Reinigen Sie die Glasabdeckungen<ol>
<li>Mit Waschflaschen mit destilliertem Wasser, Ethanol und Isopropanol die 24 mm x 50 mm Abdeckungen in folgender Reihenfolge abspülen: Wasser, Ethanol, Wasser, Isopropanol, Wasser. Trocknen Sie die Abdeckungen mit einem Strom von sauberem Stickstoff. Es ist wichtig, die Abdeckungen von oben nach unten zu spülen, die untere Ecke mit Soft-Tipp-Zange zu halten. Trocknen Sie den Deckelinrutsch in die gleiche Richtung, um eine Kontami...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. 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Das hier beschriebene Mass Photometry-basierte Protokoll bietet eine schnelle und genaue Methode zur Messung von Antigen-Antikörper-Bindungsaffinitäten. Die MP-Analyse verwendet eine sehr geringe Menge an Material, und zusätzliche Informationen – einschließlich Stoichiometrie, Oligomerisierung und Reinheit – können anhand derselben Daten ausgewertet werden (Abbildung 5). Ohne Modifikationen ist diese Methode auf die Messungen von Dissoziationskonstanten im Bereich von ca. 5 nM bis 5...

Antikörper sind zu allgegenwärtigen Werkzeugen der Molekularbiologie geworden und werden sowohl in medizinischen als auch in Forschungsanwendungen ausgiebig eingesetzt. In der Medizin sind sie in der Diagnostik von entscheidender Bedeutung, aber auch ihre therapeutischen Anwendungen werden erweitert und neue Antikörper-basierte Therapien werden ständig entwickelt1,2,3,4. Die wissenschaftlichen Anwendungen von Antikörpern umfassen viele unverzichtbare Labortechniken wie Immunfluoreszenz5, Immunpräzipitation6, Durchflusszytometrie7, ELISA und Western Blotting. Für jede dieser Anwendungen ist es von entscheidender Bedeutung, genaue Messungen der Bindungseigenschaften des Antikörpers, einschließlich Bindungsaffinität und Spezifität, zu erhalten.
Seit der Einführung des ersten kommerziellen Oberflächen-Plasmonresonanz-Instruments (SPR) im Jahr 1990 sind optische Biosensoren zum "Goldstandard" der Antikörpercharakterisierung geworden, aber auch andere Techniken, einschließlich ELISA, werden routinemäßig zur Messung von Antikörperaffinitäten8,9verwendet. Diese Methoden erfordern in der Regel eine Immobilisierung oder Kennzeichnung der analysierten Moleküle, was die Interaktion von Interesse potenziell beeinflussen kann. Sie sind auch relativ langsam und beinhalten mehrere Assay-Schritte, bevor die Ergebnisse für die Datenanalyse gesammelt werden können. Eine kürzlich entwickelte Einzelmolekülmethode, die Massenphotometrie (MP), erkennt Moleküle direkt in Lösung, wenn sie auf der Oberfläche des Mikroskopdeckelslanden 10,11. Die lichtstreuende optische Detektion, die MP verwendet, erfordert keine Proteinkennzeichnung oder -modifikation. Einzelne Proteinmoleküle werden vom interferometrischen Streumikroskop als dunkle Flecken im Bild aufgezeichnet (Abbildung 1D), und mehrere tausend Moleküle können während der einminütigen Datenerfassung12nachgewiesen werden. Das von jedem einzelnen Teilchen erzeugte Signal wird quantifiziert, und sein Kontrastwert (relative Dunkelheit) wird berechnet. Die interferometrischen Kontrastwerte sind proportional zu den Molekularmassen der Proteine, was die Identifizierung gebundener und freier Arten in der Antigen-Antikörper-Mischung ermöglicht. Gleichzeitig misst MP durch zählende molekulare Landeereignisse direkt die Artenpopulationen. Dies gibt MP-basierten Methoden eine einzigartige Fähigkeit, Affinitäten mehrerer Bindungssites unabhängig zu quantifizieren.
Die Bindung der Antigenmoleküle (Ag) an die beiden Bindungsstellen des intakten Antikörpers (Ab) kann wie folgt beschrieben werden: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> mit den Gleichgewichtsassoziationskonstanten Ka1 und Ka2 definiert als: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> wobei ci und fi die Konzentration und den Anteil der Komponente idarstellen. Die Gesamtantigenkonzentration (cAg)tot kann wie: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Da die Gesamtkonzentrationen des Antikörpers (cAb)tot und antigen (cAg)tot bekannt sind, kann diese Gleichung verwendet werden, um die experimentellen Bauteilfraktionen, die aus den MP-Messungen gewonnen wurden, direkt anzupassen und die Gleichgewichtsassoziationskonstanten Ka1 und Ka2 zu berechnen (siehe Ergänzende Informationen).
Die MP-Daten können auch verwendet werden, um die Kooperative zwischen den beiden Antikörperbindungsstellen11zu schätzen. Bei zwei Antikörperparatopen mit identischen mikroskopischen Bindungskonstanten sind die statistischen Faktoren, die den Prozess der Population des Ab- Ag und Ab Ag2-Komplexe diktieren, dass die scheinbaren makroskopischen Gleichgewichtskonstanten Ka1 und Ka2 nicht numerisch gleich sind und Ka1 = 4Ka2. Daher weisen die experimentellen Werte von Ka1 < 4Ka2 auf eine positive Kooperatoaktivität zwischen den beiden Antikörperbindungsstellen hin. Ebenso weist Ka1 > 4Ka2 auf negative Kooperatonität hin.
MP-Messungen der Antigen-Antikörper-Bindungsaffinität sind schnell und erfordern eine geringe Menge an Material. Die MP-Massenverteilungen, die für Gleichgewichtskonstantenberechnungen verwendet werden, liefern zusätzliche Informationen über die Probeneigenschaften und ermöglichen die Bewertung der Probenreinheit, Oligomerisierung und Aggregation in einem einzigen Experiment. Die gleiche Methode kann verwendet werden, um eine proteinreiche Protein-Protein-Bindung mit hoher Affinität zu messen, und MP ist besonders nützlich für Studien mit multivalenten Proteinwechselwirkungen. Multiproteinkomplexe haben in der Regel große molekulare Massen, optimal für die MP-Erkennung, und Einzelmoleküldaten können verwendet werden, um stoichiometrie zu messen und Affinitäten mehrerer Bindungsstellen gleichzeitig zu berechnen. Diese Informationen sind in der Regel schwierig, mit massenbasierten Methoden zu erhalten.
Ohne Modifikationen eignet sich das aktuelle Protokoll für Messungen von relativ hochaffinen submikromolaren Wechselwirkungen mit Antigenen einer Molekülmasse von 20 kDa oder größer. Für optimale Ergebnisse sollten Proteinvorräte von hoher Reinheit sein, aber es gibt keine spezifischen Pufferanforderungen. Durch die Verwendung von MP kann die Antigen-Antikörper-Bindung in weniger als fünf Minuten beurteilt werden. Die datenerfassung und -analyse, die für genaue Kd-Berechnungen erforderlich sind, kann innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

Messungen der Spezifität und Affinität von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen sind für medizinische und forschungsmedizinische Anwendungen von entscheidender Bedeutung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Implementierung einer neuen Einzelmolekültechnik, der Massenphotometrie (MP), zu diesem Zweck. MP ist eine etiketten- und immobilisierungsfreie Technik, die molekulare Massen und Populationen von Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen auf einer Einmolekülebene erkennt und quantifiziert. MP analysiert die Antigen-Antikörper-Probe innerhalb von Minuten, um die Bindungsaffinität präzise zu bestimmen und gleichzeitig Informationen über die Stoichiometrie und den oligomeren Zustand der Proteine bereitzustellen. Dies ist eine einfache und einfache Technik, die nur Picomol-Mengen an Protein und keine teuren Verbrauchsmaterialien erfordert. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um die Protein-Protein-Bindung für Proteine mit einer Molekularmasse von mehr als 50 kDa zu untersuchen. Bei multivalenten Proteinwechselwirkungen können die Affinitäten mehrerer Bindungsstellen in einer einzigen Messung ermittelt werden. Die einmolekulare Messart und die fehlende Etikettierung setzen jedoch einige experimentelle Einschränkungen mit sich. Diese Methode liefert die besten Ergebnisse, wenn sie auf Messungen von submikromolaren Wechselwirkungsaffinitäten, Antigenen mit einer Molekularmasse von 20 kDa oder größer und relativ reinen Proteinproben angewendet wird. Wir beschreiben auch das Verfahren zur Durchführung der erforderlichen Anpassungs- und Berechnungsschritte mit einer Basisdatenanalysesoftware.

Wir haben zuvor die Wechselwirkung von humanen α-Thrombin (HT) und Maus monoklonalen anti-humanen Thrombin-Antikörper (AHT) mit dem MP-basierten Assay11untersucht. Da die Molekularmasse des HT (37 kDa) unter der 40 kDa-Nachweisgrenze liegt, kann die maximale Probenkonzentration die Konzentrationsbeschränkung von 50 nM MP überschreiten, ohne die Auflösung von Massenverteilungen negativ zu beeinflussen. Das Experiment war als Titrationsserie mit dem AHT-Antikörper mit einer festen Konzentratio...

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Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Wir beschreiben einen einmolekularen Ansatz für Antigen-Antikörper-Affinitätsmessungen mit Massenphotometrie (MP). Das MP-basierte Protokoll ist schnell, genau, verwendet eine sehr geringe Menge an Material und erfordert keine Proteinmodifikation.

Schnelle Bestimmung der Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Antikörper werden routinemäßig in Labortechniken eingesetzt und ihre therapeutischen und diagnostischen Anwendungen werden schnell erweitert. Eine schnelle und genaue Antigen-Antikörper-Bindungscharakterisierung ist für diese Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Die Massenphotometrie misst schnell Bindungsaffinitäten mit extrem geringen Materialmengen.Es ist keine Etikettierung oder Immobilisierung erforderlich und Aus demselben Experiment können Informationen über Proteinoligomerisierung und Reinheit gewonnen werden. Dieses Protokoll kann nicht nur zur Untersuchung von Antikörpern, sondern auch zur Messung starker Protein-Protein-Bindungen für Proteine mit einer Molekularmasse von mehr als 50 Kilodaltonen verwendet werden. Beginnen Sie mit Soft-Tip-Zangen und waschen Sie Flaschen, um 24 mal 50 Millimeter Abdeckungen von oben nach unten mit destilliertem Wasser, Ethanol, destilliertem Wasser, Isopropanol und destilliertem Wasser sequenziell zu spülen.Nach der letzten Wäsche trocknen Sie die Abdeckungen mit einem Strom von sauberem Stickstoff in die gleiche Richtung, um eine Kontamination durch die Zange zu vermeiden. Spülen Sie 24 mal 24 Millimeter Abdeckungen mit destilliertem Wasser und Ethanol, wie gezeigt, gefolgt von der Trocknung mit einem Strom von sauberem Stickstoff. Nach dem Trocknen einen 24 mal 24 Millimeter großen Deckelaufschlag auf ein Stück Aluminiumfolie legen und Doppelbandstreifen auf den Deckelbeschlag legen.Dann den 24 mal 24 Millimeter großen Deckel aus der Folie schneiden und die Folie vorsichtig auf die Arbeitsseite des 24 mal 50 Millimeter großen Deckels drücken. Um Antikörper-Antigen-Proben für die Affinitätsmessungen vorzubereiten, filtern Sie mindestens zwei Milliliter PBS durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter, um Staubpartikel und Aggregate zu entfernen, und zentrifugieren Sie die antigenen Antikörper- und Antigenbestände von Interesse. Messen Sie die UV-Absorption von 280 Nanometern der Antikörper- und Antigenbestände, um ihre tatsächlichen Konzentrationen zu bestimmen, und erstellen Sie eine Titrationsreihe von Antikörper-Antigen-Gemischen im entsprechenden Bereich von Antigenkonzentrationen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern pro Probe.Dann inkubieren Sie die Antigen-Antikörper-Mischungen für ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur, damit die Bindungsreaktion das chemische Gleichgewicht erreicht. Um die Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie zu bewerten, tragen Sie einen Tropfen Mikroskop-Tauchöl auf das Instrumentenobjektiv auf und legen Sie die Durchflusskammer auf die Bühne des Mikroskops. Fügen Sie 10 Mikroliter gefilterten PBS an ein Ende des Durchflusskammerkanals hinzu.Der Puffer wird durch Kapillarwirkung in den Kanal einlaufen. Verwenden Sie in der Registerkarte Fokussteuerung der Datenerfassungssoftware die Tasten für die grobe Stufenbewegung nach oben und unten, um die ersten Anpassungen vorzunehmen, und klicken Sie auf Schärfe, um die Schärfesignalanzeige anzuzeigen. Verwenden Sie die Schaltflächen für die Feineinstellung nach oben und unten, um den Schärfewert zu maximieren, und klicken Sie auf Fokus und Sperrfokus festlegen, um die Fokusverfolgungsfunktion zu aktivieren.Ein Bild eines sauberen Dias sollte einen Signalwert von 0,05%Load 20 Mikroliter der ersten Antikörper-Antigen-Probe haben, wie gezeigt, und die Flüssigkeit vom anderen Ende mit einem kleinen Stück Blotpapier bloten. Klicken Sie sofort nach dem Laden auf Datensatz, um die entsprechende Anzahl von Frames zu erhalten, die 100 Sekunden Daten entsprechen. Geben Sie am Ende des Datenerfassungszeitraums einen Dateinamen für die Daten ein, und klicken Sie auf OK, und klicken Sie dann auf Beispiel, um die Datei zu speichern.Um die Massenphotometriedaten zu analysieren, öffnen Sie die Interessendatei, und klicken Sie auf Analysieren. Klicken Sie auf Laden, um die Kalibrierungsfunktion zu laden, auf Datei zu klicken und Die Ergebnisse zu speichern, um die analysierten Daten zu speichern. Um die relativen Konzentrationen jeder Art in der Probe zu erhalten, öffnen Sie die Veranstaltungen angepasst.csv-Datei, kopieren Sie die Daten in Spalte M in die entsprechende Plot- und Analysesoftware, und verwenden Sie die Histogrammfunktion der Plotstatistik, um die molekulare Massenverteilung zu zeichnen. Doppelklicken Sie auf das Histogramm, um das Ploteigenschaftenfenster zu öffnen, das automatische Binning zu deaktivieren und eine Lagerplatzgröße von 2,5 Kilodaltons auszuwählen. Um die Lagerplatzzentren zu erstellen und Daten zu zählen, klicken Sie auf Anwenden und los.Um das Histogramm an Gaußsche Funktionen anzupassen, wählen Sie die Abschnittszentren und -zählungen aus, und klicken Sie auf die Analysespitzen und die Menüfunktion für die Mehrfachanpassung mit mehreren Spitzenzeiten. Doppelklicken Sie, um die ungefähren Spitzenpositionen im Verteilungsdiagramm anzugeben, und klicken Sie auf NL-anpassung öffnen. Überprüfen Sie die festen Kontrollkästchen für die XC-Spitzenzentren und legen Sie ihre Werte auf die erwarteten Molekularmassen des freien Antikörpers und der Einzel- und Doppel-Antigen-Antikörper-Komplexe fest.Aktivieren Sie die Freigabeoption für die Breitenparameter, und klicken Sie auf Passen. Die angepassten Spitzenhöhenwerte der Gaußschen Komponenten stellen die relative Konzentration jeder Art in der Probe dar. Verwenden Sie dann die Gleichung, um den Konzentrationsanteil jeder Art aus den Spitzenhöhenwerten zu berechnen.Um Gleichgewichtskonstanten mithilfe eines Tabellenkalkulationsprogramms zu berechnen, öffnen Sie die Dissoziationskonstantberechnung. xlsx-Arbeitsblatt. In diesem Arbeitsblatt können die gelb hervorgehobenen Zellenwerte in den Zeilen 1 bis 10 geändert werden, um die Gleichgewichtskonstantenberechnungen durchzuführen.Geben Sie die geschätzten Dissoziationskonstantenwerte in nanomolaren Einheiten in die Zellen B1 und B2 ein. Wenn die geschätzten Dissoziationskonstantenwerte nicht bekannt sind, lassen Sie die Standardwerte in den Zellen B1 und B2 unverändert. Geben Sie die Gesamtantikörper- und Gesamtantigenkonzentrationen in Nanomolareinheiten in die Zellen D2 und E2 ein und geben Sie die berechneten Bruchwerte für jede Spezies in die Zellen F2, G2 und H2 ein. Fügen Sie bei der globalen Analyse der Titration die entsprechenden Datenfraktionswerte in die Zeilen 2 bis 10 hinzu. Wählen Sie im Fenster Solverparameter Zelle B15 für das festgelegte Zielfeld und die Zellen B1 bis B2 für das Feld durch Ändern variabler Zellen aus.Wählen Sie die Min-Schaltfläche für die Option zu aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Nicht eingeschränkte Variablen nicht negativ machen, und wählen Sie dann GRG nichtlinear als Lösungsmethode aus, und klicken Sie auf Lösen. Die am besten fitungsdissoziationskonstanten Werte werden in den Zellen B1 und B2 angezeigt. Und die endgültige Summe der quadrierten Fehler wird in Zelle B15 angezeigt. In diesem repräsentativen Experiment wurde eine Titrationsreihe mit dem antihumanen Thrombin-Antikörper in einer festen Konzentration von 25 Nanomolaren und 0, 7,5, 15, 30, 60 und 120 nanomolaren humanen Alpha-Thrombin-Konzentrationen durchgeführt, um die molekularen Massenverteilungen der Antigen-Antikörper-Gemischs und der Antikörper-Nur-Probe zu erhalten.Die besten Passpunkthöhenparameter der Gaußschen Komponenten wurden normalisiert, um Artenkonzentrationsfraktionen zu erhalten. Die Konzentrationsfraktionswerte wurden dann global fit, um die Antigen-Antikörper-Bindungsaffinitäten zu erhalten. Die experimentellen Konzentrationsfraktionen und die globalen Passungsergebnisse für den freien Antikörper, den einzelnen Antigen-Antikörper-Komplex und den doppelten Antigenkomplex könnten dann geplottet werden.Um genaue KD-Werte zu erhalten, müssen Proteinkonzentrationen sorgfältig ausgewählt werden, um alle Reaktionsarten zu bevölkern. Wir empfehlen, eine Titrationsserie mit einer Reihe von Antigenkonzentrationen vorzubereiten. Nach dem Anpassen der Daten kann die Fehlerprojektionsmethode verwendet werden, um den Anpassungsfehler zu erhalten, aber es ist besser, das Experiment zu wiederholen und die Standardabweichungen der durchschnittlichen Bindungsaffinitätswerte zu berechnen.

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Biochemistry

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