Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

אנו מודים לקייר נוימן על הקריאה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית האינטרא-מורלית של ה-NHLBI, NIH.

1. הכן את תאי הזרימה
<ol><li>נקה את כיסויי הזכוכית<ol>
<li>באמצעות בקבוקי כביסה עם מים מזוקקים, אתנול, ו isopropanol, לשטוף את 24 מ"מ x 50 מ"מ מכסה בסדר הבא: מים, אתנול, מים, isopropanol, מים. יבש את הכיסויים עם זרם של חנקן נקי. חשוב לשטוף את הכיסויים מלמעלה למטה, מחזיקים את הפינה התחתונה עם מדפים רכים. יבש את הכיסויי?...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

פרוטוקול Mass Photometry המתואר כאן מספק שיטה מהירה ומדויקת למדידת זיקה לקשירת נוגדנים אנטיגן. ניתוח MP משתמש בכמות קטנה מאוד של חומר, ומידע נוסף – כולל סטואיכימטריה, אוליגומריזציה וטוהר – ניתן להעריך מאותם נתונים (איור 5). ללא שינויים, שיטה זו חלה על המדידות של קבועי דיסוציאציה בט...

נוגדנים הפכו לכלים בכל מקום של ביולוגיה מולקולרית והם משמשים בהרחבה הן ביישומים רפואיים והן ביישומים מחקריים. ברפואה, הם חשובים ביותר באבחון, אבל היישומים הטיפוליים שלהם מתרחבים גם טיפולים מבוססי נוגדנים חדשיםמפותחים כל הזמן 1,2,3,4. היישומים המדעיים של נוגדנים כוללים טכניקות מעבדה חיוניות רבות כגון immunofluorescence5, immunoprecipitation6, ציטומטריהזרימה 7, ELISA, ו סופג מערבי. עבור כל אחד מיישומים אלה, השגת מדידות מדויקות של תכונות מחייבות של הנוגדן, כולל זיקה מחייבת וספניות, היא בעלת חשיבות מכרעת.
מאז הוצג המכשיר המסחרי הראשון תהודה פלסמון (SPR) בשנת 1990, biosensors אופטי הפכו "תקן הזהב" של אפיון נוגדנים, אבל טכניקות אחרות, כולל ELISA, משמשים גם באופן שגרתי למדידת זיקהנוגדנים 8,9. שיטות אלה דורשות בדרך כלל קיבוע או תיוג של המולקולות המנותחות, אשר עלולות להשפיע על האינטראקציה של עניין. הם גם איטיים יחסית, מעורבים שלבי בדיקה מרובים לפני שניתן יהיה לאסוף את התוצאות לניתוח נתונים. שיטה שפותחה לאחרונה מולקולה אחת, פוטומטריה המונית (MP), מזהה מולקולות ישירות בת פתרון כאשר הם נוחתים על פני השטח של המיקרוסקופ מכסה אתהנקודה 10,11. הזיהוי האופטי מבוסס פיזור האור שחבר הפרלמנט משתמש בו אינו דורש תיוג או שינוי של חלבונים. מולקולות חלבון בודדות מתועדות על ידי מיקרוסקופ פיזור אינטרפרומטריכתמים כהיםהמופיעים בתמונה ( איור 1D ), וכמה אלפי מולקולות ניתן לזהות במהלך רכישת נתונים שלדקה אחת 12. האות שנוצר על-ידי כל חלקיק בודד מכומת, וערך החדות שלו (חשכה יחסית) מחושב. ערכי הניגוד האינטרפרומטרי פרופורציונליים להמונים המולקולריים של החלבונים, המאפשרים זיהוי של מינים קשורים וחופשיים בתערובת נוגדני האנטיגן. במקביל, על ידי ספירת אירועי נחיתה מולקולרית, חבר הפרלמנט מודד ישירות את אוכלוסיות המינים. הדבר מעניק לשיטות מבוססות MP יכולת ייחודית לכמת באופן עצמאי זיקה לאתרי איגוד מרובים.
קשירה של מולקולותאנטיגן( Ag ) לשני אתרי קשירה של הנוגדןשלם( Ab ) ניתן לתאר כ: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> עם קבועי שיוך שיווי המשקל K a1ו- Ka2 המוגדרים כ: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> כאשר ci ו- f אני מייצג ריכוז ושבר של הרכיב i, בהתאמה. ריכוז אנטיגן הכולל (cAg)טוט יכול לבוא לידי ביטוי כ: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
מאז הריכוזים הכוללים שלהנוגדן( cAb)טוט ואנטיגן (cAg)טוט ידועים, משוואה זו יכולה לשמש כדי להתאים ישירות את שברי הרכיב הניסיוני המתקבלים ממדידות MP ולחשב את קבועי שיוך שיווי המשקל K A1 ו- Ka2 (ראה מידע משלים).
ניתן להשתמש גם בנתונים של MP כדי להעריך שיתוף פעולה בין שני אתרי איגוד הנוגדנים11. עבור שני משטחי נוגדנים עם קבועי קשירה מיקרוסקופיים זהים, הגורמים הסטטיסטיים המתארים את תהליך האוכלוסייה של Ab· אג ואב· קומפלקסים Ag2 מכתיבים כי קבועי שיווי המשקל המקרוסקופיים לכאורה Ka1 ו- Ka2 לא יהיו שווים מבחינה מספרית, ו- Ka1 = 4Ka2. לכן, הערכים הניסיוניים של Ka1 < 4Ka2 מצביעים על שיתוף פעולה חיובי בין שני אתרי איגוד הנוגדנים. באופן דומה, Ka1 > 4K a2מציין שיתוף פעולה שלילי.
מדידות MP של זיקה מחייב נוגדן אנטיגן הם מהירים ודורשים כמות קטנה של חומר. ההתפלגויות ההמוניות של MP המשמשות לחישובים קבועים של שיווי משקל מספקות מידע נוסף אודות מאפייני המדגם ומאפשרות הערכה של טוהר המדגם, אוליגומריזציה וצבירה בניסוי יחיד. ניתן להשתמש באותה שיטה כדי למדוד זיקה גבוהה חלבון חלבון מחייב, ו MP הוא שימושי במיוחד עבור מחקרים של אינטראקציות חלבון רב ואלנט. קומפלקסים מרובי חלבונים בדרך כלל יש מסות מולקולריות גדולות, אופטימלי לגילוי MP, ונתונים מולקולה אחת ניתן להשתמש כדי למדוד stoichiometry ולחשב זיקה של אתרי קשירה מרובים בו זמנית. בדרך כלל קשה להשיג מידע זה בשיטות המבוססות בצובר.
ללא שינויים, הפרוטוקול הנוכחי מתאים למדידות של זיקה גבוהה יחסית, אינטראקציות תת מיקרומולריות עם אנטיגנים של מסה מולקולרית של 20 kDa ומעלה. לקבלת תוצאות מיטביות, מלאי החלבון צריך להיות בעל טוהר גבוה, אך אין דרישות חיץ ספציפיות. באמצעות MP, ניתן להעריך את איגוד נוגדני האנטיגן בפחות מחמש דקות. איסוף הנתונים והניתוח הנדרשים לחישובי KD מדויקים יכולים להתבצע תוך 30 דקות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

מדידות של הספציפיות והזיקה של אינטראקציות נוגדנים אנטיגן חשובים ביותר עבור יישומים רפואיים ומחקריים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את היישום של טכניקה חדשה של מולקולה אחת, פוטומטריה המונית (MP), למטרה זו. MP היא טכניקה נטולת תוויות ואי-תנועה המזהה ומכומתת מסות מולקולריות ואוכלוסיות של נוגדנים ותסביך נוגדנים ברמת מולקולה אחת. MP מנתח את דגימת האנטיגן-נוגדן בתוך דקות, ומאפשר קביעה מדויקת של הזיקה מחייבת בו זמנית מתן מידע על stoichiometry ואת המצב האוליגומרי של החלבונים. זוהי טכניקה פשוטה וישירה הדורשת רק כמויות picomole של חלבון ולא מתכלים יקרים. אותו הליך יכול לשמש לחקר חלבון חלבון מחייב חלבונים עם מסה מולקולרית גדולה מ 50 kDa. עבור אינטראקציות חלבון רב-לשוניות, ניתן להשיג את הזיקה של אתרי קשירה מרובים במדידה אחת. עם זאת, מצב המדידה של מולקולה אחת וחוסר התיוג כופה כמה מגבלות ניסיוניות. שיטה זו נותנת את התוצאות הטובות ביותר כאשר מוחל על מדידות של זיקה אינטראקציה תת מיקרומולרית, אנטיגנים עם מסה מולקולרית של 20 kDa או יותר, דגימות חלבון טהור יחסית. כמו כן, אנו מתארים את ההליך לביצוע שלבי ההתאמה והחישוב הנדרשים באמצעות תוכנה בסיסית לניתוח נתונים.

בעבר בדקנו את האינטראקציה של α-טרומבין אנושי (HT) ונוגדן טרומבין אנטי-אנושי עכבר (AHT) באמצעות ה- MP מבוסס assay11. מאז המסה המולקולרית של HT (37 kDa) הוא מתחת לגבול זיהוי 40 kDa, ריכוז המדגם המרבי יכול לחרוג ממגבלת ריכוז 50 ננומטרי מגה פיקסל מבלי להשפיע לרעה על הרזולוציה של הפצות המוניות. הניסו...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

אנו מתארים גישה של מולקולה אחת למדידות זיקה לאנטיגן-נוגדנים באמצעות פוטומטריה המונית (MP). הפרוטוקול מבוסס MP הוא מהיר, מדויק, משתמש בכמות קטנה מאוד של חומר, ואינו דורש שינוי חלבון.

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

נוגדנים משמשים באופן שגרתי בטכניקות מעבדה ויומי הטיפול והאבחון שלהם מתרחבים במהירות. אפיון מחייב אנטיגן-נוגדן מהיר ומדויק חשוב ביותר ליישומים אלה. פוטומטריה המונית מודדת במהירות זיקה מחייבת באמצעות כמויות קטנות מאוד של חומר.אין צורך בתיוג או קיבוע ומידע על אוליגומריזציה של חלבונים וטוהר ניתן להשיג מאותו ניסוי. פרוטוקול זה יכול לשמש לא רק כדי ללמוד נוגדנים, אלא גם כדי למדוד קשירות חלבון חלבון חזק עבור חלבונים עם מסה מולקולרית גדולה מ 50 קילודלטונים. התחל על ידי שימוש במטליות קצה רך ולשטוף בקבוקים כדי לשטוף ברצף 24 על ידי 50 מילימטר מכסה מלמעלה למטה עם מים מזוקקים, אתנול, מים מזוקקים, isopropanol, ומים מזוקקים.לאחר הכביסה האחרונה, לייבש את coverslips עם זרם של חנקן נקי באותו כיוון, כדי למנוע העברת זיהום מן המדפים. לשטוף 24 על ידי 24 מילימטר מכסה עם מים מזוקקים ואתנול כפי שהוכח, ואחריו ייבוש עם זרם של חנקן נקי. לאחר הייבוש, מניחים כיסוי של 24 על 24 מילימטרים על פיסת רדיד אלומיניום וממקמים רצועות של סרט הדבקה דו-צדדי על המכסה.ואז לחתוך את 24 על ידי 24 מילימטר coverslip מתוך נייר הכסף בעדינות ללחוץ על נייר כסף על הצד העובד של 24 על ידי 50 מילימטר coverslip. כדי להכין דגימות נוגדנים אנטיגן למדידות הזיקה, לסנן לפחות שני מיליליטר של PBS באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרון כדי להסיר חלקיקי אבק אגרגטים, ו צנטריפוגה את מלאי הנוגדנים ואנטיגן של עניין. למדוד את ספיגת 280 ננומטר UV של מלאי הנוגדנים ואנטיגן כדי לקבוע את הריכוזים בפועל שלהם, ולהכין סדרה של תערובות נוגדנים אנטיגן בטווח המתאים של ריכוזי אנטיגן בנפח סופי של 50 microliters לכל מדגם.לאחר מכן להדגיר את תערובות נוגדני אנטיגן במשך כ 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את התגובה מחייב להגיע שיווי משקל כימי. כדי להעריך את זיקה נוגדן אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית, להחיל טיפה של שמן טבילה מיקרוסקופ על מטרת המכשיר ולהחיל את תא הזרימה על הבמה של המיקרוסקופ. הוסף 10 מיקרוליטרים של PBS מסונן לקצה אחד של ערוץ תא הזרימה.המאגר ייכנס לערוץ בפעולה נימית. בכרטיסייה בקרת המיקוד של תוכנת איסוף הנתונים, השתמש בלחצנים גסים שלב למעלה ולמטה כדי לבצע את ההתאמות הראשוניות ולחץ על חדות כדי להציג את קריאת אות החדות. השתמש בלחצני ההתאמה העדינים למעלה ולמטה כדי למקסם את ערך החדות ולחץ על הגדרת מיקוד ונעל את המוקד כדי להפעיל את פונקציית המעקב אחר המוקד.תמונה של שקופית נקייה צריכה להיות ערך אות שווה או מתחת ל- 0.05%Load 20 microliters של דגימת נוגדן אנטיגן הראשונה כפי שהוכח, סופג את הנוזל מהחלק השני עם פיסת נייר סופג קטנה. מיד לאחר הטעינה, לחץ על רשומה כדי להשיג את המספר המתאים של מסגרות שוות ערך ל- 100 שניות של נתונים. בסוף תקופת איסוף הנתונים, הזן שם קובץ עבור הנתונים ולחץ על אישור ולאחר מכן תדגום כדי לשמור את הקובץ.כדי לנתח את נתוני פוטומטריית המסה, פתח את קובץ העניין ולחץ על נתח. לחץ על טען כדי לטעון את פונקציית הכיול ולחץ על קובץ ושמור תוצאות כדי לשמור את הנתונים שנותחו. כדי להשיג את הריכוזים היחסיים של כל מין בדגימה, פתח את האירועים.קובץ csv, העתק את הנתונים בעמודה M לתוכנה המתאימה להתוויה וניתוח, ולהשתמש בפונקציית היסטוגרמה של סטטיסטיקת התוויית נתונים כדי להתוות את התפלגות המסה המולקולרית. לחץ פעמיים על ההיסטוגרמה כדי לפתוח את חלון מאפייני ההתוויה, להשבית את binning אוטומטית, ובחר גודל סל של 2.5 קילודאלטון. כדי ליצור את מרכזי המחסנים ולספירת נתונים, לחץ על החל ולך.כדי להתאים את ההיסטוגרמה לפונקציות גאוסיאניות, בחר את מרכזי סל וספירת העמודות ולחץ על פסגות הניתוח ופונקציית התפריט הבסיסית מרובת שיאים. לחץ פעמיים כדי לציין את מיקומי השיא המשוערים בהתווית ההפצה ולחץ על פתח את NL fit. בדוק את תיבות הסימון הקבועות עבור מרכזי השיא של XC והגדר את ערכיהם למסות המולקולריות הצפויות של הנוגדן החופשי ולתסבימי נוגדני האנטיגן הבודדים והכפילים.בדוק את אפשרות השיתוף עבור פרמטרי הרוחב ולחץ על התאם. ערכי שיא הגובה המותאמים של הרכיבים הגאוסיאניים מייצגים את הריכוז היחסי של כל מין בדגימה. לאחר מכן השתמש במשוואה כדי לחשב את שבר הריכוז של כל מין ערכי שיא גובה.כדי לחשב קבועי שיווי משקל באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני, פתח את חישוב הדיסוציאציה. גליון עבודה xlsx. בגליון עבודה זה, ניתן לשנות את ערכי התא המסומן הצהוב בשורות 1 עד 10 כדי לבצע את חישובי קבוע שיווי המשקל.הזן את ערכי קבוע הדיסוציאציה המשוערים ביחידות ננו-מולאר לתאים B1 ו- B2. אם הערכים הקבועים המשוערים של דיסוציאציה אינם ידועים, השאר את ערכי ברירת המחדל בתאים B1 ו- B2 ללא שינוי. הזן את ריכוזי הנוגדנים והאנטיג'ן הכוללים ביחידות ננומולריות לתאים D2 ו- E2 והזן את ערכי השבר המחושבים עבור כל מין לתאים F2, G2 ו- H2. בעת ביצוע ניתוח כללי של ההקצבה, הוסף את ערכי שברי הנתונים המתאימים לשורות 2 עד 10. בחלון הפרמטרים Solver, בחר תא B15 עבור התיבה המטרה set ותאים B1 עד B2 עבור התיבה על-ידי שינוי תאים משתנים.בחר את לחצן min עבור האפשרות אל ובדוק את תיבת הסימון הפוך משתנים ללא הגבלה ללא שליליים ולאחר מכן בחר GRG לא ליניארי כשיטה לפתרון ולחץ על פתור. הערכים הקבועים הטובים ביותר של דיסוציאציה יוצגו בתאים B1 ו- B2. ואת הסכום הסופי של שגיאות בריבוע יוצגו בתא B15. בניסוי מייצג זה, סדרת טיטרציה עם נוגדן הטרומבין האנטי-אנושי בריכוז קבוע של 25 ננומולרים ו-0, 7.5, 15, 30, 60 ו-120 ריכוזי אלפא-טרומבין אנושיים ננומולריים בוצעו כדי להשיג את ההתפלגות המונית המולקולרית של תערובות נוגדני האנטיגן והנוגדן בלבד.הפרמטרים הטובים ביותר בגובה שיא של הרכיבים הגאוסיאניים היו מנורמלים כדי להשיג שברי ריכוז מינים. ערכי שבר הריכוז התאימו אז ברחבי העולם כדי להשיג את הזיקה לקשירת נוגדנים אנטיגן. לאחר מכן ניתן היה לתכנן את שברי הריכוז הניסיוניים ואת תוצאות יתאימו הגלובליות לנוגדנים החופשיים, לתסביך נוגדן אנטיגן יחיד ולתסביך אנטיגן כפול.כדי להשיג ערכי KD מדויקים, ריכוזי חלבונים צריכים להיבחר בקפידה כדי לאכלס את כל מיני התגובות. מומלץ להכין סדרת טיטריות באמצעות מגוון ריכוזי אנטיגן. לאחר התאמת הנתונים, ניתן להשתמש בשיטת הקרנה השגיאה כדי להשיג את שגיאת ההתאמה, אך עדיף לחזור על הניסוי ולחשב את סטיות התקן של ערכי הזיקה הממוצעים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

נחישות כימות המינים בשנת תערובות שימוש ספקטרומטריית מסה MRM של פפטידים יישומית כדי אימות בשר

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

ליזר מהיר גשוש שיטה מקלה על קביעת פולשני צור-חינם של תכונות תרמיות ליף

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

הופעל מקושרת צולבת מקושרת לפיתוח מהיר של שרפים כרומטוגרפיה של אהדה-לכידת נוגדן כמחקר מקרה

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...