Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
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हम पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए कीर न्यूमन को धन्यवाद देते हैं । इस काम को एनएचएलबीआई, एनआईएच के इंट्राम्यूरल प्रोग्राम ने सपोर्ट किया ।

1. प्रवाह कक्षों तैयार
<ol><li>ग्लास कवरस्लिप को साफ करें<ol>
<li>आसुत पानी, इथेनॉल और आइसोप्रोपैनॉल के साथ धोने की बोतलों का उपयोग करके, निम्नलिखित क्रम में 24 मिमी x 50 मिमी कवरलिप कुल्ला: पानी, इथेनॉल, पानी, आइसोप्?...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

यहां उल्लिखित मास फोटोमेट्री आधारित प्रोटोकॉल एंटीजन-एंटीबॉडी बाध्यकारी समानताओं को मापने की एक तेज और सटीक विधि प्रदान करता है। एमपी विश्लेषण सामग्री की एक बहुत छोटी राशि का उपयोग करता है, और अतिरि?...

एंटीबॉडी आणविक जीव विज्ञान के सर्वव्यापी उपकरण बन गए हैं और चिकित्सा और अनुसंधान अनुप्रयोगों दोनों में बड़े पैमाने पर उपयोग किए जाते हैं। चिकित्सा में, वे निदान में गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं, लेकिन उनके चिकित्सीय अनुप्रयोगों का भी विस्तार हो रहा है और नए एंटीबॉडी आधारित उपचार लगातार विकसित किए जा रहे हैं1,2,3,4। एंटीबॉडी के वैज्ञानिक अनुप्रयोगों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस5,इम्यूनोप्रिपिष6,प्रवाह साइटोमेट्री7,एलिसा और पश्चिमी ब्लॉटिंग जैसी कई अपरिहार्य प्रयोगशाला तकनीकें शामिल हैं। इन अनुप्रयोगों में से प्रत्येक के लिए, बाध्यकारी आत्मीयता और विशिष्टता सहित एंटीबॉडी के बाध्यकारी गुणों का सटीक माप प्राप्त करना महत्वपूर्ण महत्व का है।
चूंकि 1 99 0 में पहली वाणिज्यिक सतह प्लाज्मन अनुनाद (एसपीआर) उपकरण पेश किया गया था, ऑप्टिकल बायोसेंसर एंटीबॉडी लक्षण वर्णन के "स्वर्ण मानक" बन गए हैं, लेकिन एलिसा सहित अन्य तकनीकों का उपयोग नियमित रूप से एंटीबॉडी एफ़िनिटी8, 9को मापने के लिए कियाजाताहै। इन तरीकों को आमतौर पर विश्लेषण किए गए अणुओं के स्थिरीकरण या लेबलिंग की आवश्यकता होती है, जो संभावित रूप से ब्याज की बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं। वे भी अपेक्षाकृत धीमी गति से कर रहे हैं, कई परख कदम शामिल इससे पहले कि परिणाम डेटा विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है । हाल ही में विकसित एकल अणु विधि, मास फोटोमेट्री (एमपी), जब वे माइक्रोस्कोप कवरलिप10, 11की सतह पर उतरते हैं तो सीधे समाधान में अणुओं का पता लगाताहै। एमपी द्वारा नियोजित प्रकाश बिखरने वाले ऑप्टिकल डिटेक्शन में प्रोटीन लेबलिंग या संशोधन की आवश्यकता नहीं होती है। अलग - अलग प्रोटीन अणुओं को इंटरफेरोमेट्रिक बिखरने वाले माइक्रोस्कोप द्वारा छवि(चित्र 1डी)में दिखाई देने वाले काले धब्बे के रूप में दर्ज किया जाता है और एक मिनट के डेटा अधिग्रहण12के दौरान कई हजार अणुओं का पता लगाया जा सकता है। प्रत्येक कण द्वारा उत्पन्न संकेत की मात्रा निर्धारित की जाती है, और इसके विपरीत मूल्य (सापेक्ष अंधेरे) की गणना की जाती है। इंटरफेरोमेट्रिक कंट्रास्ट वैल्यूज प्रोटीन के आणविक जनता के आनुपातिक होते हैं, जो एंटीजन-एंटीबॉडी मिश्रण में बंधे और मुक्त प्रजातियों की पहचान के लिए अनुमति देता है। इसके साथ ही आणविक लैंडिंग की घटनाओं की गणना करके, सांसद सीधे प्रजातियों की आबादी को मापता है । यह सांसद आधारित तरीकों को स्वतंत्र रूप से कई बाध्यकारी साइटों की समानताओं को निर्धारित करने की एक अनूठी क्षमता देता है।
अक्षुण्ण एंटीबॉडी(एबी)के दो बाध्यकारी स्थलों के लिए एंटीजन(एजी)अणुओं के बाध्यकारी के रूप में वर्णित किया जा सकता है: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> संतुलन संघ के साथ स्थिर कश्मीर a1 और कश्मीरa2 के रूप में परिभाषित: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> जहां सीमैं और एफमैं क्रमशः एकाग्रता और घटक मैं के अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं। कुल एंटीजन एकाग्रता(सीएजी)मुन्ना के रूप में व्यक्त किया जा सकता है: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
चूंकि एंटीबॉडी(सीएबी)मुन्ना और एंटीजन(सीएजी)मुन्ना की कुल सांद्रता ज्ञात है, इसलिए इस समीकरण का उपयोग एमपी माप से प्राप्त प्रयोगात्मक घटक अंशों को सीधे फिट करने और संतुलन संघ कॉन्स्टेंट्स K a1 और Ka2 (अनुपूरक जानकारी देखें) की गणना करने के लिए किया जा सकता है।
एमपी के आंकड़ों का उपयोग दो एंटीबॉडी बाइंडिंग साइटों के बीच सहयोगशीलता का अनुमान लगाने के लिए भी किया जासकताहै । समान सूक्ष्म बाध्यकारी स्थिरांक वाले दो एंटीबॉडी पैराटोप के लिए, सांख्यिकीयकारक एबी की जनसंख्या की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं · एजी और एबी· एजी2 परिसरों हुक्म है कि स्पष्ट स्थूल संतुलन स्थिरांक Ka1 और Ka2 संख्यात्मक रूप से बराबर नहीं होगा, और कश्मीरa1 = 4Ka2। इसलिए, Ka1 & 4Ka2 के प्रायोगिक मूल्य दो एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों के बीच सकारात्मक सहयोगशीलता का संकेत देते हैं। इसी तरह, Ka1 > 4Ka2 नकारात्मक सहयोगशीलता को इंगित करता है।
एंटीजन-एंटीबॉडी बाध्यकारी आत्मीयता के एमपी माप तेज होते हैं और थोड़ी मात्रा में सामग्री की आवश्यकता होती है। संतुलन निरंतर गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले एमपी मास वितरण नमूना गुणों के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं और एक ही प्रयोग में नमूना शुद्धता, अल्पाहारीकरण और एकत्रीकरण का आकलन सक्षम करते हैं। एक ही विधि का उपयोग उच्च आत्मीयता प्रोटीन-प्रोटीन बाध्यकारी को मापने के लिए किया जा सकता है, और एमपी बहु-वैलेंट प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। बहु-प्रोटीन परिसरों में आमतौर पर बड़े आणविक जनता होती है, जो एमपी डिटेक्शन के लिए इष्टतम होती है, और एकल-अणु डेटा का उपयोग स्टोइकिओमेट्री को मापने और एक साथ कई बाध्यकारी साइटों की समानताओं की गणना करने के लिए किया जा सकता है। यह जानकारी आमतौर पर थोक-आधारित तरीकों का उपयोग करके प्राप्त करना मुश्किल होता है।
संशोधनों के बिना, वर्तमान प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत उच्च-आत्मीयता, 20 केडीए या उससे बड़े आणविक द्रव्यमान के एंटीजन के साथ उप-माइक्रोमोलर इंटरैक्शन के माप के लिए उपयुक्त है। इष्टतम परिणामों के लिए, प्रोटीन स्टॉक उच्च शुद्धता का होना चाहिए, लेकिन कोई विशिष्ट बफर आवश्यकताएं नहीं हैं। एमपी का इस्तेमाल करके एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग का आकलन पांच मिनट से भी कम समय में किया जा सकता है । सटीक Kd गणना के लिए आवश्यक डेटा संग्रह और विश्लेषण 30 मिनट केभीतर किया जा सकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन की विशिष्टता और आत्मीयता के माप चिकित्सा और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम इस उद्देश्य के लिए एक नई एकल अणु तकनीक, मास फोटोमेट्री (एमपी) के कार्यान्वयन का वर्णन करते हैं। एमपी एक लेबल और स्थिरीकरण मुक्त तकनीक है जो आणविक जनता और एंटीबॉडी और एंटीजन-एंटीबॉडी परिसरों की आबादी को एकल अणु स्तर पर पता लगाती है और मात्रा देती है। सांसद मिनटों के भीतर एंटीजन-एंटीबॉडी नमूने का विश्लेषण करता है, बाध्यकारी आत्मीयता के सटीक निर्धारण के लिए अनुमति देता है और साथ ही स्टोइचिओमेट्री और प्रोटीन की ओलिगोमेरिक स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करता है। यह एक सरल और सीधी तकनीक है जिसके लिए प्रोटीन की केवल पिकोमोल मात्रा और कोई महंगी उपभोग्य सामग्री की आवश्यकता होती है। इसी प्रक्रिया का उपयोग प्रोटीन के लिए प्रोटीन-प्रोटीन बाध्यकारी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिसमें 50 केडीए से बड़ा आणविक द्रव्यमान होता है। बहुसंत प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए, कई बाध्यकारी साइटों की समानताएं एक ही माप में प्राप्त की जा सकती हैं। हालांकि, माप के एकल अणु मोड और लेबलिंग की कमी कुछ प्रयोगात्मक सीमाएं लगाता है । यह विधि उप-माइक्रोमॉलर इंटरैक्शन एफ़िनिटीज के माप पर लागू होने पर सबसे अच्छा परिणाम देती है, 20 केडीए या उससे अधिक के आणविक द्रव्यमान के साथ एंटीजन, और अपेक्षाकृत शुद्ध प्रोटीन नमूने। हम बुनियादी डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आवश्यक फिटिंग और गणना चरणों को करने की प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।

हमने पहले एमपी आधारित परख11का उपयोग करके मानव α-थ्रोम्बिन (एचटी) और माउस मोनोक्लोनल एंटी-ह्यूमन थ्रोम्बिन एंटीबॉडी (एएचटी) की बातचीत की जांच की है । चूंकि एचटी (37 केडीए) का आणविक द्रव्यमान 40 केडीए ...

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Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

हम बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री (एमपी) का उपयोग करके एंटीजन-एंटीबॉडी आत्मीयता माप के लिए एक एकल अणु दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। एमपी-आधारित प्रोटोकॉल तेज, सटीक है, बहुत कम मात्रा में सामग्री का उपयोग करता है, और प्रोटीन संशोधन की आवश्यकता नहीं है।

मास फोटोमेट्री द्वारा एंटीबॉडी-एंटीजन आत्मीयता का तेजी से निर्धारण

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

एंटीबॉडी नियमित रूप से प्रयोगशाला तकनीकों में उपयोग किया जाता है और उनके चिकित्सीय और नैदानिक अनुप्रयोगों का जल्दी से विस्तार हो रहा है। इन अनुप्रयोगों के लिए तेज और सटीक एंटीजन-एंटीबॉडी बाध्यकारी लक्षण वर्णन गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। मास फोटोमेट्री जल्दी से सामग्री की बेहद छोटी मात्रा का उपयोग कर बाध्यकारी समानताएं उपाय।किसी लेबलिंग या स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं है और प्रोटीन ओलिगोमेराइजेशन और शुद्धता के बारे में जानकारी एक ही प्रयोग से प्राप्त की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग न केवल एंटीबॉडी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि 50 किलोडडलटन से बड़े आणविक द्रव्यमान के साथ प्रोटीन के लिए मजबूत प्रोटीन-प्रोटीन बाइंडिंग को मापने के लिए भी किया जा सकता है। नरम टिप संदंश का उपयोग करके शुरू करें और बोतलों को धोने के लिए धीरे-धीरे आसुत पानी, इथेनॉल, आसुत पानी, आइसोप्रोपैनॉल और आसुत पानी के साथ ऊपर से नीचे तक 24 बाय 50 मिलीमीटर कवरस्लिप कुल्ला करें।अंतिम धोने के बाद, संदंश से प्रदूषण को स्थानांतरित करने से बचने के लिए एक ही दिशा में स्वच्छ नाइट्रोजन की धारा के साथ कवरस्लिप को सुखाएं। प्रदर्शन के रूप में आसुत पानी और इथेनॉल के साथ 24 मिलीमीटर कवर्लिप द्वारा 24 कुल्ला, स्वच्छ नाइट्रोजन की एक धारा के साथ सूखने के बाद । सूखने के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े पर 24 से 24 मिलीमीटर कवरलिप रखें और कवरस्लिप पर डबल-तरफा टेप की स्ट्रिप्स रखें।फिर पन्नी से बाहर 24 बाय 24 मिलीमीटर कवरलिप काटें और धीरे-धीरे पन्नी को 24 बाय 50 मिलीमीटर कवरस्लिप के काम करने की ओर दबाएं। आत्मीयता मापन के लिए एंटीबॉडी-एंटीजन नमूने तैयार करने के लिए, धूल कणों और समुच्चय को हटाने के लिए 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पीबीएस के कम से कम दो मिलीलीटर को फ़िल्टर करें, और ब्याज के एंटीबॉडी और एंटीजन स्टॉक को अपकेंद्री करें। एंटीबॉडी और एंटीजन शेयरों के 280 नैनोमीटर यूवी अवशोषण को मापने के लिए उनकी वास्तविक सांद्रता निर्धारित करते हैं, और प्रति नमूना 50 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में एंटीजन सांद्रता की उचित रेंज में एंटीबॉडी-एंटीजन मिश्रण की एक टिटरेशन श्रृंखला तैयार करते हैं।फिर कमरे के तापमान पर लगभग 10 मिनट के लिए एंटीजन-एंटीबॉडी मिश्रण को इनक्यूबेट करें ताकि बाध्यकारी प्रतिक्रिया रासायनिक संतुलन तक पहुंच सके। मास फोटोमेट्री द्वारा एंटीबॉडी-एंटीजन आत्मीयता का आकलन करने के लिए, उपकरण उद्देश्य के लिए माइक्रोस्कोप विसर्जन तेल की एक बूंद लागू करें और माइक्रोस्कोप के चरण पर प्रवाह कक्ष रखें। फ्लो चैंबर चैनल के एक छोर पर फ़िल्टर किए गए पीबीएस के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।बफर केशिका कार्रवाई द्वारा चैनल में प्रवेश करेगा। डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर के फोकस नियंत्रण टैब में, शुरुआती समायोजन करने के लिए मोटे चरण आंदोलन को ऊपर और नीचे बटन का उपयोग करें और तीखेपन सिग्नल रीडआउट देखने के लिए तीखेपन पर क्लिक करें। शार्पनेस वैल्यू को अधिकतम करने के लिए फाइन अप और डाउन एडजस्टमेंट बटन का इस्तेमाल करें और फोकस ट्रैकिंग फंक्शन को एक्टिवेट करने के लिए सेट फोकस और लॉक फोकस पर क्लिक करें।एक साफ स्लाइड की छवि में 0.05% लोड 20 माइक्रोलीटर के बराबर या नीचे एक संकेत मूल्य होना चाहिए, जैसा कि प्रदर्शन किया गया था, दूसरे छोर से तरल को ब्लॉटिंग पेपर के एक छोटे से टुकड़े के साथ दाग लगाना। लोड होने पर तुरंत, डेटा के 100 सेकंड के बराबर फ्रेम की उचित संख्या प्राप्त करने के लिए रिकॉर्ड पर क्लिक करें। डेटा संग्रह अवधि के अंत में, डेटा के लिए एक फाइलनाम दर्ज करें और ओके पर क्लिक करें, फिर फ़ाइल को सहेजने के लिए नमूना।बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री डेटा का विश्लेषण करने के लिए, ब्याज की फाइल खोलें और विश्लेषण करें। अंशांकन फ़ंक्शन लोड करने के लिए लोड पर क्लिक करें और फ़ाइल पर क्लिक करें और विश्लेषण किए गए डेटा को सहेजने के लिए परिणामों को सहेजें। नमूने में प्रत्येक प्रजाति की सापेक्ष सांद्रता प्राप्त करने के लिए, घटनाओं को खोलें।सीएसवी फ़ाइल, कॉलम एम में डेटा को उचित प्लॉटिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में कॉपी करें, और आणविक जन वितरण को प्लॉट करने के लिए प्लॉट स्टैटिस्टिक्स हिस्टोग्राम फ़ंक्शन का उपयोग करें। प्लॉट प्रॉपर्टीज विंडो खोलने के लिए हिस्टोग्राम पर डबल क्लिक करें, ऑटोमैटिक बिनिंग को निष्क्रिय करें, और 2.5 किलोडटन के बिन आकार का चयन करें। बिन केंद्र बनाने और डेटा मायने रखता है बनाने के लिए, लागू करें और जाने पर क्लिक करें ।गॉसियन कार्यों के साथ हिस्टोग्राम को फिट करने के लिए, बिन केंद्रों का चयन करें और कॉलम को गिनाएं और विश्लेषण चोटियों और बेसलाइन मल्टीपल पीक फिट मेनू फ़ंक्शन पर क्लिक करें। वितरण भूखंड पर अनुमानित चोटी की स्थिति को इंगित करने के लिए डबल-क्लिक करें और ओपन एनएल फिट पर क्लिक करें। एक्ससी पीक केंद्रों के लिए निश्चित चेकबॉक्स की जांच करें और अपने मूल्यों को मुफ्त एंटीबॉडी और एकल और डबल एंटीजन-एंटीबॉडी परिसरों की अपेक्षित आणविक जनता के लिए सेट करें।चौड़ाई मापदंडों के लिए शेयर विकल्प की जांच करें और फिट क्लिक करें। गॉसियन घटकों के फिट पीक ऊंचाई मूल्य नमूने में प्रत्येक प्रजाति की सापेक्ष एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं। फिर शिखर ऊंचाई मूल्यों से प्रत्येक प्रजाति के एकाग्रता अंश की गणना करने के लिए समीकरण का उपयोग करें।स्प्रेडशीट कार्यक्रम का उपयोग करके संतुलन स्थिरांक की गणना करने के लिए, वियोजन को खोलें। एक्सएलएक्स वर्कशीट। इस वर्कशीट में, पंक्तियों में पीले हाइलाइट किए गए सेल मूल्यों को संतुलन निरंतर गणना करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।नैनोमोलर इकाइयों में अनुमानित वियोजन स्थिर मूल्यों को कोशिकाओं बी 1 और बी 2 में दर्ज करें। यदि अनुमानित वियोजन निरंतर मूल्यों की जानकारी नहीं है, तो कोशिकाओं B1 और B2 में डिफ़ॉल्ट मूल्यों को अपरिवर्तित छोड़ दें। नैनोमोलर इकाइयों में कुल एंटीबॉडी और कुल एंटीजन सांद्रता को कोशिकाओं डी 2 और ई 2 में दर्ज करें और प्रत्येक प्रजाति के लिए गणना अंश मूल्यों को कोशिकाओं F2, G2 और H2 में दर्ज करें। टाइटेशन का वैश्विक विश्लेषण करते समय, उचित डेटा अंश मूल्यों को पंक्तियों में 2 से 10 जोड़ें। सॉल्वर पैरामीटर विंडो में, वेरिएबल सेल बॉक्स को बदलकर सेट ऑब्जेक्टिव बॉक्स और सेल बी 1 से बी 2 के लिए सेल बी 15 का चयन करें।टू ऑप्शन के लिए मिन बटन चुनें और बिना अनिरुद्ध वेरिएबल्स नॉन-निगेटिव चेकबॉक्स चेक करें, फिर सॉल्विंग मेथड के रूप में जीआरजी नॉनलाइनर चुनें और सॉल्व करें । सबसे अच्छा फिट वियोजन निरंतर मूल्यों को कोशिकाओं बी 1 और बी 2 में दिखाया जाएगा। और चुकता त्रुटियों का अंतिम योग सेल B15 में दिखाया जाएगा । इस प्रतिनिधि प्रयोग में, एंटीजन-एंटीबॉडी मिश्रण और एंटीबॉडी केवल नमूने के आणविक द्रव्यमान वितरण प्राप्त करने के लिए एक निश्चित 25 नैनोमोलर एकाग्रता और 0, 7.5, 15, 30, 60, और 120 नैनोमोलर मानव अल्फा-थ्रोम्बिन सांद्रता पर एंटी-ह्यूमन थ्रोम्बिन एंटीबॉडी के साथ एक टिटरेशन श्रृंखला का प्रदर्शन किया गया।प्रजातियों की एकाग्रता अंशों को प्राप्त करने के लिए गॉसियन घटकों के सर्वश्रेष्ठ फिट पीक ऊंचाई मापदंडों को सामान्य बनाया गया था। एकाग्रता अंश मूल्यों तो विश्व स्तर पर फिट करने के लिए एंटीजन एंटीबॉडी बाध्यकारी समानताएं प्राप्त कर रहे थे । प्रयोगात्मक एकाग्रता अंश और मुक्त एंटीबॉडी, एकल एंटीजन-एंटीबॉडी परिसर, और डबल एंटीजन परिसर के लिए वैश्विक फिट परिणाम तो साजिश रची जा सकती है।सटीक केडी मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, प्रोटीन सांद्रता को सभी प्रतिक्रिया प्रजातियों को आबाद करने के लिए सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए। हम एंटीजन सांद्रता की एक श्रृंखला का उपयोग करके एक टिटररेशन श्रृंखला तैयार करने की सलाह देते हैं। डेटा फिटिंग के बाद, त्रुटि प्रक्षेपण विधि का उपयोग फिटिंग त्रुटि प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन प्रयोग को दोहराना और औसत बाध्यकारी आत्मीयता मूल्यों के मानक विचलन की गणना करना बेहतर है।

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Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

प्रजाति निर्धारण और मिश्रण में Quantitation मांस प्रमाणीकरण करने के लिए पेप्टाइड्स एप्लाइड के एमआरएम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

एक रैपिड लेजर जांच विधि पत्ता तापीय गुणों की गैर-आक्रामक और संपर्क मुक्त निर्धारण की सुविधा

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

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Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

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The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

मालदी द्वारा माउस ऊतक निष्कर्षों में विशिष्टता को छेड़ने का संकल्प-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री: विशिष्टता परिवर्तन के कारण पीएच हेर-फेर

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

पत्ती स्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री: एक तेजी से परिवेश Ionization तकनीक सीधे संयंत्र के ऊतकों से चयापचयों का आकलन करने के लिए

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान पश्चिमी ब्लॉट या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए जोड़ा गया

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी रेजिन के तीव्र विकास के लिए सक्रिय क्रॉस-लिंक्ड अगारोस - एक केस स्टडी के रूप में एंटीबॉडी कैप्चर

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...