Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
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Ringraziamo Keir Neuman per la sua lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal programma intramurale della NHLBI, NIH.

1. Preparare le camere di flusso
<ol><li>Pulire le coperture in vetro<ol>
<li>Utilizzando bottiglie di lavaggio con acqua distillata, etanolo e isopropanolo, sciacquare i copricapo da 24 mm x 50 mm nel seguente ordine: acqua, etanolo, acqua, isopropanolo, acqua. Asciugare i copricapo con un flusso di azoto pulito. È importante risciacquare i coprispalla dall'alto verso il basso, tenendo l'angolo inferiore con forcep a punta morbida. Asciugare il coperchio nella stessa direzione per evitare di trasferire la contaminazi...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

Il protocollo basato sulla fotometria di massa qui delineato fornisce un metodo rapido e accurato per misurare le affinità di legame antigene-anticorpo. L'analisi MP utilizza una quantità molto piccola di materiale e ulteriori informazioni, tra cui stechiometria, oligomerizzazione e purezza, possono essere valutate dagli stessi dati (Figura 5). Senza modifiche, questo metodo è applicabile alle misurazioni delle costanti di dissociazione nell'intervallo da 5 nM a 500 nM circa, e per le mol...

Gli anticorpi sono diventati strumenti onnipresenti della biologia molecolare e sono ampiamente utilizzati sia in applicazioni mediche che di ricerca. In medicina, sono di fondamentale importanza nella diagnostica, ma anche le loro applicazioni terapeutiche si stanno espandendo e nuove terapie basate su anticorpi vengono costantementesviluppate 1,2,3,4. Le applicazioni scientifiche degli anticorpi includono molte tecniche di laboratorio indispensabili come l'immunofluorescenza5,l'immunoprecipitazione6,la citometria aflusso 7,ELISA e l'blotting occidentale. Per ognuna di queste applicazioni, ottenere misurazioni accurate delle proprietà di legame dell'anticorpo, inclusa l'affinità di legame e la specificità, è di fondamentale importanza.
Da quando il primo strumento commerciale di risonanza plasmonica di superficie (SPR) è stato introdotto nel 1990, i biosensori ottici sono diventati il "gold standard" della caratterizzazione degli anticorpi, ma altre tecniche, tra cui ELISA, sono anche abitualmente utilizzate per misurare le affinitàanticorpali 8,9. Questi metodi di solito richiedono l'immobilizzazione o l'etichettatura delle molecole analizzate, che possono potenzialmente influenzare l'interazione di interesse. Sono anche relativamente lenti, coinvolgendo più fasi di dosaggio prima che i risultati possano essere raccolti per l'analisi dei dati. Un metodo a singola molecola recentemente sviluppato, la fotometria di massa (MP), rileva le molecole direttamente in soluzione quando atterrano sulla superficie del microscopio coverslip10,11. Il rilevamento ottico basato sulla diffusione della luce che MP utilizza non richiede l'etichettatura o la modifica delle proteine. Le singole molecole proteiche sono registrate dal microscopio a dispersione interferometrica come macchie scure che appaiono nell'immagine (Figura 1D), e diverse migliaia di molecole possono essere rilevate durante l'acquisizione di dati di un minuto12. Il segnale generato da ogni singola particella viene quantificato e viene calcolato il suo valore di contrasto (oscurità relativa). I valori di contrasto interferometrico sono proporzionali alle masse molecolari delle proteine, il che consente l'identificazione di specie legate e libere nella miscela antigene-anticorpo. Allo stesso tempo, contando gli eventi di atterraggio molecolare, MP misura direttamente le popolazioni di specie. Ciò offre ai metodi basati su MP una capacità unica di quantificare in modo indipendente le affinità di più siti di associazione.
Il legame delle molecole diantigene( Ag ) ai due siti di legame dell'anticorpo intatto (Ab) può essere descritto come: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> con le costanti di associazione di equilibrio Ka1 e Ka2 definite come: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> dove ci e fi rappresentano rispettivamente la concentrazione e la frazione del componente i. La concentrazione totale di antigeni (cAg)può essere espressa come: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Poiché le concentrazioni totalidell'anticorpo (cAb) tot e dell'antigene (cAg)tot sono note, questa equazione può essere utilizzata per adattarsi direttamente alle frazioni di componenti sperimentali ottenute dalle misurazioni MP e calcolare le costanti di associazione di equilibrio Ka1 e Ka2 (vedi Informazioni supplementari).
I dati MP possono anche essere utilizzati per stimare la cooperatività tra i due siti di legame anticorpale11. Per due paratopi anticorpali con identiche costanti di legame microscopico, i fattori statistici che descrivono il processo di popolazione dell'Ab· Ag e Ab· Icomplessi ag 2 impongono che le costanti apparenti di equilibrio macroscopico Ka1 e Ka2 non siano numericamente uguali, e Ka1 = 4Ka2. Pertanto, i valori sperimentali di Ka1 < 4Ka2 indicano una cooperatività positiva tra i due siti di legame anticorpale. Allo stesso modo, Ka1 > 4Ka2 indica una cooperatività negativa.
Le misurazioni MP dell'affinità legante antigene-anticorpo sono veloci e richiedono una piccola quantità di materiale. Le distribuzioni di massa MP utilizzate per i calcoli costanti di equilibrio forniscono informazioni aggiuntive sulle proprietà del campione e consentono la valutazione della purezza del campione, dell'oligomerizzazione e dell'aggregazione in un singolo esperimento. Lo stesso metodo può essere usato per misurare il legame proteina-proteina ad alta affinità, e mp è particolarmente utile per studi sulle interazioni proteiche multivalenti. I complessi multi-proteina di solito hanno grandi masse molecolari, ottimali per il rilevamento mp, e i dati a singola molecola possono essere usati per misurare la stechiometria e calcolare contemporaneamente affinità di più siti di legame. Queste informazioni sono in genere difficili da ottenere utilizzando metodi basati sulla massa.
Senza modifiche, l'attuale protocollo è adatto per misurazioni di interazioni sub-micromolare ad affinità relativamente elevata con antigeni di massa molecolare di 20 kDa o superiore. Per risultati ottimali, gli stock proteici dovrebbero essere di elevata purezza, ma non ci sono requisiti tampone specifici. Utilizzando MP, il legame antigene-anticorpo può essere valutato in meno di cinque minuti. La raccolta e l'analisi dei dati necessarie per calcoli Kd accurati possono essere eseguite entro 30 minuti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

Le misurazioni della specificità e dell'affinità delle interazioni antigene-anticorpo sono di fondamentale importanza per le applicazioni mediche e di ricerca. In questo protocollo, descriviamo l'implementazione di una nuova tecnica a singola molecola, la fotometria di massa (MP), per questo scopo. MP è una tecnica senza etichetta e immobilizzazione che rileva e quantifica masse molecolari e popolazioni di anticorpi e complessi antigene-anticorpi a livello di singola molecola. MP analizza il campione antigene-anticorpo in pochi minuti, consentendo la determinazione precisa dell'affinità di legame e fornendo contemporaneamente informazioni sulla stechiometria e sullo stato oligomerico delle proteine. Questa è una tecnica semplice e diretta che richiede solo quantità di picomole di proteine e non costosi materiali di consumo. La stessa procedura può essere utilizzata per studiare il legame proteina-proteina per proteine con una massa molecolare superiore a 50 kDa. Per le interazioni proteiche multivalenti, le affinità di più siti di legame possono essere ottenute in un'unica misurazione. Tuttavia, il modo di misurazione a singola molecola e la mancanza di etichettatura impongono alcune limitazioni sperimentali. Questo metodo fornisce i migliori risultati se applicato alle misurazioni di affinità di interazione sub-micromolare, antigeni con una massa molecolare di 20 kDa o più grandi, e campioni proteici relativamente puri. Descriviamo anche la procedura per eseguire le fasi di adattamento e calcolo richieste utilizzando il software di analisi dei dati di base.

Abbiamo precedentemente esaminato l'interazione tra l'anticorpo umano α-trombina (HT) e l'anticorpo monoclonale anti-umano della trombina (AHT) utilizzando il saggio basato su MP11. Poiché la massa molecolare dell'HT (37 kDa) è inferiore al limite di rilevamento di 40 kDa, la concentrazione massima del campione può superare la limitazione di concentrazione di 50 nM MP senza influire negativamente sulla risoluzione delle distribuzioni di massa. L'esperimento è stato pianificato come serie di t...

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Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Descriviamo un approccio a singola molecola alle misurazioni dell'affinità antigene-anticorpo usando la fotometria di massa (MP). Il protocollo basato su MP è veloce, accurato, utilizza una quantità molto piccola di materiale e non richiede modifiche proteiche.

Rapida determinazione dell'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Gli anticorpi vengono regolarmente utilizzati nelle tecniche di laboratorio e le loro applicazioni terapeutiche e diagnostiche si stanno rapidamente espandendo. La caratterizzazione rapida e accurata del legame antigene-anticorpo è di fondamentale importanza per queste applicazioni. La fotometria di massa misura rapidamente le affinità di legame utilizzando quantità estremamente piccole di materiale.Non è richiesta alcuna etichettatura o immobilizzazione e le informazioni sull'oligomerizzazione e la purezza delle proteine possono essere ottenute dallo stesso esperimento. Questo protocollo può essere utilizzato non solo per studiare gli anticorpi, ma anche per misurare forti legami proteina-proteina per proteine con una massa molecolare superiore a 50 kilodalton. Inizia usando le forcep a punta morbida e lava le bottiglie per risciacquare in sequenza le coverlips da 24 per 50 millimetri dall'alto verso il basso con acqua distillata, etanolo, acqua distillata, isopropanolo e acqua distillata.Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare i copricapo con un flusso di azoto pulito nella stessa direzione per evitare di trasferire la contaminazione dalle forcep. Risciacquare 24 per 24 millimetri di coverslips con acqua distillata ed etanolo come dimostrato, seguito dall'essiccazione con un flusso di azoto pulito. Dopo l'asciugatura, posizionare un coverslip di 24 per 24 millimetri su un pezzo di foglio di alluminio e posizionare strisce di nastro a doppia parte sul coverslip.Quindi tagliare il coverslip da 24 per 24 millimetri dal foglio e premere delicatamente il foglio sul lato di lavoro del coverslip da 24 per 50 millimetri. Per preparare campioni anticorpo-antigene per le misurazioni dell'affinità, filtrare almeno due millilitri di PBS attraverso un filtro siringa da 0,22 micron per rimuovere particelle e aggregati di polvere e centrifugare le scorte di anticorpi e antigeni di interesse. Misurare l'assorbanza UV di 280 nanometri delle scorte di anticorpi e antigeni per determinarne le concentrazioni effettive e preparare una serie di miscela anticorpo-antigene all'intervallo appropriato di concentrazioni di antigene in un volume finale di 50 microlitri per campione.Quindi incubare le miscele antigene-anticorpo per circa 10 minuti a temperatura ambiente per consentire alla reazione di legame di raggiungere l'equilibrio chimico. Per valutare l'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa, applicare una goccia di olio ad immersione al microscopio all'obiettivo dello strumento e posizionare la camera di flusso sullo stadio del microscopio. Aggiungere 10 microlitri di PBS filtrato a un'estremità del canale della camera di flusso.Il buffer entrerà nel canale per azione capillare. Nella scheda di controllo dello stato attivo del software di raccolta dati, utilizzare i pulsanti di movimento grossolano dello stadio su e giù per effettuare le regolazioni iniziali e fare clic sulla nitidezza per visualizzare la lettura del segnale di nitidezza. Utilizzare i pulsanti di regolazione fine su e giù per massimizzare il valore di nitidezza e fare clic su imposta messa a fuoco e blocca messa a fuoco per attivare la funzione di tracciamento dello stato attivo.L'immagine di una diapositiva pulita deve avere un valore di segnale pari o inferiore allo 0,05%Caricare 20 microlitri del primo campione anticorpo-antigene come dimostrato, gonfiando il liquido dall'altra estremità con un piccolo pezzo di carta assorbente. Immediatamente dopo il caricamento, fare clic su record per acquisire il numero appropriato di frame equivalenti a 100 secondi di dati. Alla fine del periodo di raccolta dati immettere un nome di file per i dati e fare clic su OK, quindi eseguire l'esempio per salvare il file.Per analizzare i dati della fotometria di massa, aprire il file di interesse e fare clic su analizza. Fare clic su carica per caricare la funzione di calibrazione e fare clic sul file e salvare i risultati come per salvare i dati analizzati. Per ottenere le concentrazioni relative di ciascuna specie nel campione, aprire gli eventi idonei.csv, copiare i dati nella colonna M nel software di plottaggio e analisi appropriato e utilizzare la funzione istogramma delle statistiche del grafico per tracciare la distribuzione della massa molecolare. Fare doppio clic sull'istogramma per aprire la finestra delle proprietà del tracciato, disattivare l'binning automatico e selezionare una dimensione del contenitore di 2,5 kilodalton. Per creare i centri collocazione e contare i dati, fare clic su applica e vai.Per adattare l'istogramma alle funzioni gaussiane, selezionate i centri collocazione e le colonne di conteggio e fate clic sui picchi di analisi e sulla funzione di menu di adattamento multiplo di picco previsto. Fate doppio clic per indicare le posizioni di picco approssimative nel grafico di distribuzione e fate clic su Apri adattamento NL (Open NL fit). Controllare le caselle di controllo fisse per i centri di picco XC e impostare i loro valori sulle masse molecolari previste dell'anticorpo libero e dei complessi antigene-anticorpo singoli e doppi.Controllare l'opzione di condivisione per i parametri di larghezza e fare clic su adatta. I valori di altezza di picco montati dei componenti gaussiani rappresentano la concentrazione relativa di ciascuna specie nel campione. Quindi usa l'equazione per calcolare la frazione di concentrazione di ogni specie dai valori dell'altezza di picco.Per calcolare le costanti di equilibrio utilizzando un programma foglio di calcolo, aprire il calcolo della dissociazione costante. foglio di lavoro xlsx. In questo foglio di lavoro, i valori delle celle evidenziate in giallo nelle righe da 1 a 10 possono essere modificati per eseguire i calcoli delle costanti di equilibrio.Immettere i valori costanti di dissociazione stimati nelle unità nanomolari nelle celle B1 e B2. Se i valori costanti di dissociazione stimati non sono noti, lasciare invariati i valori predefiniti nelle celle B1 e B2. Immettere l'anticorpo totale e le concentrazioni totali di antigeni nelle unità nanomolari nelle cellule D2 ed E2 e immettere i valori di frazione calcolati per ogni specie nelle cellule F2, G2 e H2. Quando si esegue un'analisi globale della titolazione, aggiungere i valori appropriati della frazione di dati nelle righe da 2 a 10. Nella finestra parametri risolutore selezionare la cella B15 per la casella obiettivo impostata e le celle da B1 a B2 per la casella modificando celle variabili.Selezionare il pulsante min per l'opzione a e selezionare la casella di controllo rendi non negative le variabili non vincolate, quindi selezionare GRG non lineare come metodo di risoluzione e fare clic su risolvi. I valori costanti di dissociazione più adatti saranno mostrati nelle celle B1 e B2. E la somma finale degli errori al quadrato verrà mostrata nella cella B15. In questo esperimento rappresentativo, una serie di titolazione con l'anticorpo anti-umano trombina ad una concentrazione fissa di 25 nanomolare e 0, 7,5, 15, 30, 60 e 120 concentrazioni di alfa-trombina umana nanomolare sono state eseguite per ottenere le distribuzioni di massa molecolare delle miscele antigene-anticorpo e del campione solo anticorpale.I parametri di altezza di picco più adatti dei componenti gaussiani sono stati normalizzati per ottenere frazioni di concentrazione delle specie. I valori della frazione di concentrazione sono stati quindi idonei a livello globale per ottenere le affinità di legame antigene-anticorpo. Le frazioni sperimentali di concentrazione e i risultati di adattamento globale per l'anticorpo libero, il singolo complesso antigene-anticorpo e il doppio complesso di antigeni potrebbero quindi essere tracciati.Per ottenere valori KD accurati, le concentrazioni proteiche devono essere accuratamente selezionate per popolare tutte le specie di reazione. Si consiglia di preparare una serie di titolazione utilizzando una gamma di concentrazioni di antigeni. Dopo aver raccordo i dati, il metodo di proiezione degli errori può essere utilizzato per ottenere l'errore di raccordo, ma è meglio ripetere l'esperimento e calcolare le deviazioni standard dei valori medi di affinità di associazione.

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