Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
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私たちは、原稿の彼の批判的な読書のためにキール・ノイマンに感謝します。この研究は、NIHのNHLBIの壁内プログラムによって支えられた。

1. 流れチャンバを準備する
<ol><li>ガラスカバーリップをクリーニングする<ol>
<li>蒸留水、エタノール、イソプロパノールを含む洗浄ボトルを使用して、水、エタノール、水、イソプロパノール、水の順序で24 mm x 50 mmのカバーリップを洗い流します。きれいな窒素の流れでカバースリップを乾燥させます。下の角を柔らかい先端の鉗子で押さえて、カバーリップを上から下にすすい込むのが?...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

ここで概説するマスフォトメトリーベースのプロトコルは、抗原抗体結合親和性を迅速かつ正確に測定する方法を提供します。MP分析では、非常に少量の材料を使用し、同じデータから、ストイチオメトリー、オリゴマー化、純度などの追加情報を評価できます(図5)。改質なしの場合、この方法は約5nM~500nMの範囲での解離定数の測定、および約20kDa以上の分子質量を有す...

抗体は分子生物学のユビキタスツールとなり、医学と研究の両方の用途で広く使用されています。医学では、診断において非常に重要であるが、治療用途も拡大しており、新しい抗体ベースの治療法は常に1、2、3、4を開発されている。抗体の科学的応用には、免疫蛍光5、免疫沈降6、フローサイトメトリー7、ELISA、およびウェスタンブロッティングなどの多くの不可欠な実験室技術が含まれる。これらのアプリケーションのそれぞれについて、結合親和性や特異性を含む抗体の結合特性の正確な測定を得ることは非常に重要です。
1990年に初の市販表面プラズモン共鳴(SPR)装置が導入されて以来、光学バイオセンサーは抗体特性の「ゴールドスタンダード」となっているが、ELISAを含む他の技術も抗体親和性8,9を測定するために日常的に使用されている。これらの方法は、通常、分析された分子の固定化または標識を必要とし、潜在的に関心のある相互作用に影響を与える可能性がある。また、データ分析のために結果を収集する前に複数のアッセイステップを含む比較的遅いです。最近開発された単一分子法である質量光測定法(MP)は、顕微鏡カバースリップ10,11の表面に着地したときに溶液中の分子を直接検出する。MPが採用する光散乱ベースの光学検出では、タンパク質の標識や修飾は必要ありません。個々のタンパク質分子は、画像に現れる暗い斑点として干渉散乱顕微鏡によって記録され(図1D)、そして1分間のデータ取得12の間に数千個の分子が検出できる。個々のパーティクルによって生成される信号が定量化され、そのコントラスト値(相対暗さ)が計算されます。干渉的なコントラスト値はタンパク質の分子質量に比例し、抗原抗体混合物中の結合種と遊離種の同定を可能にする。同時に、分子着陸事象を数えることによって、MPは種の個体数を直接測定する。これにより、MP ベースのメソッドは、複数の結合部位の親和性を個別に定量化する独自の機能を提供します。
抗原(Ag)分子のインタクト抗体の2つの結合部位(Ab)への結合は、以下のように記述できます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> 平衡関連定数Ka1 およびKa2は次のように定義されています。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> ここで、ciと f iはそれぞれ成分iの濃度と分数を表します。総抗原濃度(cAg)トットは以下のように表現できます。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
抗体(cAb)トットと抗原(cAg)トットの全濃度が知られているので、この式を用いてMP測定から得られた分画を直接適合させ、平衡関連定数Ka1およびKa2を計算することができる(補足情報を参照)。
MPデータは、2つの抗体結合部位11間の協同率を推定するためにも使用できる。同一微視的結合定数を有する2つの抗体パラトープについて、Abの集団の過程を記述する統計的因子 ·アグとアブ·Ag2複合体は、見かけの巨視平衡定数Ka1とKa2は数値的に等しくないことを指示し、Ka1= 4Ka2。 従って、Ka1< 4Ka2の実験値は、2つの抗体結合部位間の正の協同性を示す。同様に、Ka1 > 4Ka2は負の協同率を示す。
抗原抗体結合親和性のMP測定は速く、少量の材料を必要とする。平衡定数計算に使用されるMP質量分布は、サンプル特性に関する追加情報を提供し、サンプルの純度、オリゴマー化、および凝集を1回の実験で評価できるようにします。同じ方法を使用して高親和性タンパク質-タンパク質結合を測定することができ、MPは、多価タンパク質相互作用の研究に特に有用である。多タンパク質複合体は通常、MP検出に最適な分子量が大きく、一分子データを使用して、ストイチオメトリーを測定し、複数の結合部位の親和性を同時に計算することができます。この情報は、通常、バルク ベースのメソッドを使用して取得するのが困難です。
改変無しの現在のプロトコルは、20kDa以上の分子質量の抗原との比較的高親和性、サブマイクロモル相互作用の測定に適しています。最適な結果を得るには、タンパク質ストックは高純度である必要がありますが、特定のバッファー要件はありません。MPを用いることによって、抗原抗体結合は5分未満で評価することができる。正確なKd計算に必要なデータ収集と分析は、30分以内に実行できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

抗原と抗体相互作用の特異性と親和性の測定は、医学および研究用途にとって極めて重要です。このプロトコルでは、この目的のために新しい単一分子技術、質量光測定(MP)の実装について説明する。MPは、抗体および抗原抗体複合体の分子質量および集団を単一分子レベルで検出し、定量化する、標識および固定化を含まない技術です。MPは数分以内に抗原抗体サンプルを分析し、結合親和性の正確な決定を可能にし、同時にタンパク質のストイキオメトリーとオリゴマー状態に関する情報を提供します。これは、タンパク質のピコモール量と高価な消耗品を必要としないシンプルで簡単な技術です。同じ手順を使用して、50 kDaを超える分子量を持つタンパク質に対するタンパク質結合を研究することができます。多価タンパク質相互作用の場合、複数の結合部位の親和性を単一の測定で得ることができる。しかし、測定の単一分子モードと標識の欠如は、いくつかの実験的な制限を課します。この方法は、サブマイクロモル相互作用親和性、20kDa以上の分子質量を持つ抗原、および比較的純粋なタンパク質サンプルの測定に適用すると最良の結果を与えます。また、基本的なデータ解析ソフトを用いて、必要なフィッティング・計算手順を実行する手順についても説明します。

我々は、MPベースアッセイ11を用いてヒトα-トロンビン(HT)とマウスモノクローナル抗ヒトトロンビン抗体(AHT)の相互作用を以前に調べた。HTの分子質量(37kDa)は40kDa検出限界以下であるため、最大サンプル濃度は、質量分布の分解能に悪影響を及ぼすことなく、50nMの濃度制限を超えることができます。実験は、AHT抗体を固定25nM濃度で、HT濃度は7.5nM、15nM、30nM、60nM、120nMの滴定?...

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Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

質量光計測(MP)を用いた抗原抗体親和性測定に対する単一分子アプローチについて述べています。MPベースのプロトコルは、高速で正確で、非常に少量の材料を使用し、タンパク質の改変を必要としません。

質量光測定による抗体-抗原アフィニティーの迅速な測定

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

抗体は、実験室の技術で日常的に使用され、それらの治療および診断アプリケーションは急速に拡大しています。迅速かつ正確な抗原抗体結合特性は、これらのアプリケーションにとって非常に重要です。質量フォトメトリーは、非常に少量の材料を使用して結合親和性を迅速に測定します。標識や固定化は不要で、同じ実験からタンパク質オリゴマー化と純度に関する情報を得ることができます。このプロトコルは、抗体の研究だけでなく、50キロダルトンを超える分子質量を持つタンパク質の強力なタンパク質タンパク質結合を測定するためにも使用できます。まず、ソフトチップ鉗子と洗浄ボトルを使用して、蒸留水、エタノール、蒸留水、イソプロパノール、蒸留水で上から下まで24%50ミリメートルのカバーリップを順次洗い流します。最後の洗浄後、同じ方向にきれいな窒素の流れでカバースリップを乾燥させて、鉗子からの汚染を移動させないようにします。24を24ミリメートルのカバーリップに蒸留水とエタノールを示すように洗い流し、続いてきれいな窒素の流れを乾燥させる。乾燥後、24 x 24ミリメートルのカバースリップをアルミホイルの上に置き、両面テープのストリップをカバースリップに置きます。その後、ホイルから24ミリメートルのカバースリップで24ミリメートルをカットし、穏やかに24の作業側にホイルを50ミリメートルカバースリップ押し出します。アフィニティー測定用の抗体抗原サンプルを調製するには、0.22ミクロンのシリンジフィルターを介して少なくとも2ミリリットルのPBSを濾過し、ほこり粒子および凝集体を除去し、対象の抗体および抗原ストックを遠心分離する。抗体および抗原ストックの280ナノメートルのUV吸収を測定して実際の濃度を決定し、サンプル当たり50マイクロリットルの最終体積で適切な範囲の抗原濃度で抗体抗原混合物の滴定シリーズを調製します。次に、抗原抗体混合物を室温で約10分間インキュベートし、結合反応が化学平衡に達することを可能にする。質量光測定による抗体抗原親和性を評価するには、顕微鏡浸漬油を器具の目的に塗布し、流れチャンバーを顕微鏡のステージに置きます。フローチャンバチャネルの一端に10マイクロリットルの濾過済みPBSを加えます。バッファは毛管の作用によってチャネルに入ります。データ収集ソフトウェアのフォーカス制御タブで、粗いステージの移動上下ボタンを使用して初期調整を行い、シャープネスをクリックしてシャープネス信号の読み出しを表示します。細かい上下調整ボタンを使用してシャープネスの値を最大化し、フォーカスとロックフォーカスを設定してフォーカス追跡機能を有効にします。きれいなスライドの画像は、示されているように、第1の抗体抗原サンプルの20マイクロリットルを0.05%以下のシグナル値にし、小さなブロッティングペーパーで他方の端から液体を吸い込む必要があります。ロード直後にレコードをクリックして、100 秒のデータに相当する適切なフレーム数を取得します。データ収集期間の終了時に、データのファイル名を入力し、「OK」をクリックしてからサンプルをサンプルで保存します。質量フォトメトリーデータを解析するには、対象ファイルを開いて[解析]をクリックします。[load]をクリックしてキャリブレーション機能をロードし、ファイルをクリックして結果を保存して、解析したデータを保存します。サンプル中の各種の相対濃度を求めるには、適合したイベントを開く。csv ファイルを使用して、列 M のデータを適切なプロットおよび解析ソフトウェアにコピーし、プロット統計ヒストグラム関数を使用して分子質量分布をプロットします。ヒストグラムをダブルクリックしてプロットプロパティウィンドウを開き、自動ビン分割を無効にして、2.5 キロダルトンのビンサイズを選択します。ビンの中心とカウント データを作成するには、[適用] をクリックして移動します。ヒストグラムをガウス関数に合わせるには、ビンの中心とカウント列を選択し、解析ピークとベースラインの複数のピークフィットメニュー機能をクリックします。分布プロットのピーク位置をダブルクリックして示し、[オープン NL フィット]をクリックします。XCピークセンターの固定チェックボックスをチェックし、その値をフリー抗体および単一および二重抗原抗体複合体の予想される分子質量に設定します。幅パラメータの共有オプションをオンにして、[フィット]をクリックします。ガウス成分の適合ピーク高さの値は、サンプル中の各種の相対的な濃度を表します。次に、この式を使用して、各種の濃度分率をピーク高さの値から計算します。スプレッドシートプログラムを使用して平衡定数を計算するには、解離定数計算を開きます。xlsx ワークシート。このワークシートでは、行 1 から 10 の黄色で強調表示されたセル値を変更して平衡定数計算を実行できます。ナノモル単位の解離定数値を細胞B1およびB2に入力します。推定解離定数値が不明な場合は、セル B1 および B2 のデフォルト値は変更しないでください。ナノモル単位の抗体および全抗原濃度を細胞D2およびE2に入力し、各種の計算された分数値を細胞F2、G2、およびH2に入力します。滴定のグローバル分析を実行する場合は、適切なデータ分数値を行 2 ~ 10 に追加します。ソルバ パラメータ ウィンドウで、設定した目的ボックスにセル B15 を選択し、変数セル ボックスを変更して、セル B1 から B2 を選択します。[to]オプションの[min]ボタンを選択し、[拘束されていない変数を負でないものにする]チェックボックスをオンにして、ソルバ法としてGRG非線形を選択し、[解決]をクリックします。最適解離定数値はセル B1 と B2 に表示されます。そして、二乗誤差の最終的な合計はセルB15に表示されます。本代表的実験では、抗ヒトトロンビン抗体を固定25ナノモル濃度と0、7.5、15、30、60、および120ナノモルヒトα-トロンビン濃度で滴定系列に行い、抗原抗体混合物と抗体のみを試料の分子質量分布を得た。ガウス成分の最適フィットピーク高さパラメータを正規化し、種濃度画分を得た。次に濃度画分値をグローバルに適合させ、抗原抗体結合親和性を得た。その後、遊離抗体、単一抗原抗体複合体、および二重抗原複合体の実験濃度画分およびグローバルフィット結果をプロットすることができた。正確なKD値を得るためには、すべての反応種を投入するためにタンパク質濃度を慎重に選択する必要があります。さまざまな抗原濃度を用いて滴定シリーズを用意することをお勧めします。データをフィッティングした後、誤差投影法を使用してフィッティング誤差を得ることができますが、実験を繰り返し、平均結合アフィニティー値の標準偏差を計算することをお試しください。

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