Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
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우리는 원고의 그의 비판적 독서에 대한 키어 노이만 감사합니다. 이 작품은 NHLBI, NIH의 교내 프로그램에 의해 지원되었다.

1. 유동 챔버 준비
<ol><li>유리 커버립 청소<ol>
<li>증류수, 에탄올, 이소프로판올이 있는 워시 병을 사용하여 물, 에탄올, 물, 이소프로판올, 물 등 24mm x 50mm 커버립을 다음 순서로 헹구세요. 깨끗한 질소의 스트림으로 커버립을 건조. 커버스립을 위에서 아래로 헹구고 하단 모서리를 부드러운 팁으로 잡고 헹구는 것이 중요합니다. 집게(도2A)로부터오염을 이송하지 않도록 커?...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

여기에 설명된 질량 광측정 기반 프로토콜은 항원-항체 결합 친화성을 측정하는 빠르고 정확한 방법을 제공한다. MP 분석은 매우 적은 양의 물질을 사용하며, 스토이치오메트리, 올리고머화 및 순도를 포함한 추가 정보는 동일한데이터(그림 5)로부터평가될 수 있다. 수정없이, 이 방법은 약 5 nM에서 500 nM 범위의 해리 상수의 측정에 적용되며, 약 20 kDa 이상의 분자 질량을 가진...

항체는 분자 생물학의 유비쿼터스 공구가 되고 의학 및 연구 응용 둘 다에서 광범위하게 이용됩니다. 의학에서는 진단에서 매우 중요하지만 치료 응용 분야도 확장되고 있으며 새로운 항체 기반 치료법은지속적으로 1,2,3,4로개발되고 있습니다. 항체의 과학적 적용은 면역형성5,면역 절전6, 유동 세포측정법7,ELISA 및 서부 블로팅과 같은 많은 필수 불가결한 실험실 기술을 포함한다. 이러한 각 응용 분야에 대해 결합 친화성 및 특이성을 포함한 항체의 결합 특성의 정확한 측정을 얻는 것이 매우 중요합니다.
1990년 최초의 상업용 표면 플라스몬 공명(SPR) 기기가 도입된 이래, 광학 바이오센서는 항체 특성화의 "금본위제"가 되었지만, ELISA를 포함한 다른 기술도 항체 친화성8,9를측정하는 데 일상적으로 사용되고 있다. 이 방법은 일반적으로 잠재적으로 관심의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있는 분석된 분자의 고정화 또는 표시를 요구합니다. 또한 데이터 분석을 위해 결과를 수집하기 전에 여러 분석 단계를 포함하는 비교적 느립니다. 최근에 개발된 단일 분자 방법, 질량 광측정법(MP)은 현미경 커버슬립10,11의표면에 착륙할 때 용액에서 직접 분자를 검출한다. MP가 사용하는 광 산란 기반 광학 검출은 단백질 라벨링 또는 변형이 필요하지 않습니다. 개별 단백질 분자는영상(도 1D)에나타나는 어두운 반점으로 간섭메트릭 산란 현미경에 의해 기록되며, 수천 개의 분자는 1분 데이터 수집12동안 검출될 수 있다. 각 개별 입자에 의해 생성된 신호는 정량화되고, 그 대비값(상대어둠)이 계산됩니다. 간섭 대비 값은 단백질의 분자 질량에 비례하여 항원-항체 혼합물에서 결합 및 자유 종의 식별을 가능하게 합니다. 동시에 분자 착륙 이벤트를 계산하여 MP는 종 인구를 직접 측정합니다. 이렇게 하면 MP 기반 메서드는 여러 바인딩 사이트의 친화성을 독립적으로 정량화할 수 있는 고유한 기능을 제공합니다.
항원(Ag)분자의 결합은 그대로항체(Ab)의2개의 결합 부위에 다음과 같이 설명될 수 있다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> 평형 협회 상수 Ka1 및 Ka2로 정의 : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> 여기서 ci와 f는 각각 성분 i의농도 와 분수를 나타낸다. 토트에 대한 총 항원농도(cAg)토트는 다음과 같이 발현될 수 있다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
항체(cAb)토트 및 항원(cAg)의총농도가 알려져 있기 때문에, 이 방정식은 MP 측정에서 얻은 실험 성분 분획에 직접 맞고 평형 협회 상수 K a1 및 K a2를 계산하는 데 사용될 수 있다(보충 정보참조).
MP 데이터는 또한 두 항체 결합부위(11)사이의 쿠퍼성성을 추정하는 데 사용될 수 있다. 동일한 현미경 결합 상수를 가진 2개의 항체 파라토원의 경우, Ab·의집단의 과정을 설명하는 통계적 인자 아그와 Ab· Ag2 복합체는 명백한 거시적 평형 상수 Ka1 및 Ka2가 수치적으로 동일하지 않으며 Ka1 = 4Ka2를 지시합니다. 따라서, Ka1&lt; 4K a2의 실험값은 두 항체 결합 부위 간의 양성 응고성을 나타낸다. 마찬가지로 Ka1 > 4Ka2는 부정적인 쿠퍼티를 나타냅니다.
항원-항체 결합 친화성의 MP 측정은 빠르며 소량의 물질이 필요합니다. 상량 계산에 사용되는 MP 질량 분포는 샘플 특성에 대한 추가 정보를 제공하고 단일 실험에서 샘플 순도, 올리고머화 및 집계의 평가를 가능하게 합니다. 동일한 방법은 높은 친화성 단백질 단백질 결합을 측정하는 데 사용할 수 있으며 MP는 다중 발렌트 단백질 상호 작용연구에 특히 유용합니다. 다중 단백질 복합체는 일반적으로 큰 분자 질량을 가지고 있으며, MP 검출에 최적이며, 단일 분자 데이터는 금식측정을 측정하고 동시에 다중 결합 부위의 친화성을 계산하는 데 사용될 수 있다. 이 정보는 일반적으로 대량 기반 방법을 사용하여 얻기가 어렵습니다.
수정없이, 현재 프로토콜은 20 kDa 이상의 분자 질량의 항원과의 상대적으로 높은 친화성, 하위 미세 몰라 상호 작용의 측정에 적합합니다. 최적의 결과를 위해 단백질 재고는 순도가 높어야 하지만 특정 완충 요건은 없습니다. MP를 사용하여, 항원-항체 결합은 5분 이내에 평가될 수 있다. 정확한 KD 계산에 필요한 데이터 수집 및 분석을 30분 이내에 수행할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

항원-항체 상호 작용의 특이성 및 친화성의 측정은 의학 및 연구 응용 분야에서 매우 중요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 이 목적을 위해 새로운 단 하나 분자 기술, 질량 광측정법 (MP)의 구현을 설명합니다. MP는 단일 분자 수준에서 항체 및 항원 항체 복합체의 분자 질량 및 인구를 감지하고 정량화하는 라벨 및 고정되지 않은 기술입니다. MP는 몇 분 안에 항원 항체 샘플을 분석하여 결합 친화성의 정확한 측정을 허용하고 동시에 단백질의 스토이치오메트리 및 올리고메릭 상태에 대한 정보를 제공한다. 이것은 단백질의 피코몰 양과 고가의 소모품만을 필요로 하는 간단하고 간단한 기술입니다. 동일한 절차는 50 kDa보다 큰 분자 질량을 가진 단백질을 위한 단백질 단백질 결합을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 다발성 단백질 상호 작용을 위해, 다중 결합 부위의 친화력은 단일 측정에서 얻을 수 있다. 그러나 단일 분자 측정 모드와 라벨링부족은 몇 가지 실험적 한계를 가중시합니다. 이 방법은 서브 마이크로몰라 상호 작용 친화성, 20 kDa 이상의 분자 질량을 가진 항원 및 상대적으로 순수한 단백질 샘플의 측정에 적용될 때 최상의 결과를 제공합니다. 또한 기본 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 필요한 피팅 및 계산 단계를 수행하는 절차에 대해서도 설명합니다.

우리는 이전에 MP 기반분석(11)을사용하여 인간 α-혈전(HT) 및 마우스 단일클론 항인간 혈전 항체(AHT)의 상호작용을 조사하였다. HT(37 kDa)의 분자 질량은 40kDa 검출 한계 이하이기 때문에, 질량 분포의 분해능에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 최대 시료 농도가 50nM MP 농도 제한을 초과할 수 있다. 이 실험은 고정된 25nM 농도에서 AHT 항체를 장착한 적정계로 계획되었으며, HT는 7.5nM, ...

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Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

우리는 질량 광합성(MP)을 사용하여 항원-항체 친화성 측정에 대한 단일 분자 접근법을 기술합니다. MP 기반 프로토콜은 빠르고 정확하며 매우 적은 양의 재료를 사용하며 단백질 변형이 필요하지 않습니다.

질량 광합성에 의한 항체 항원 선호도의 신속한 결정

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

항체는 실험실 기술에 일상적으로 사용되며 치료 및 진단 응용 분야는 빠르게 확장되고 있습니다. 빠르고 정확한 항원-항체 결합 특성화는 이러한 응용 분야에서 매우 중요합니다. 질량 광측정은 매우 적은 양의 재료를 사용하여 바인딩 친화성을 신속하게 측정합니다.라벨이나 고정이 필요하지 않으며 단백질 올리고머화 및 순도에 대한 정보는 동일한 실험에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 항체를 연구할 뿐만 아니라 50킬로달톤보다 큰 분자 질량을 가진 단백질에 대한 강력한 단백질 단백질 결합을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 소프트 팁 집게와 세척 병을 사용하여 증류수, 에탄올, 증류수, 이소프로판올 및 증류수로 위에서 아래로 24~ 50mm 커버립을 순차적으로 헹구는 것으로 시작합니다.마지막 세척 후, 집게에서 오염을 전송하지 않도록 같은 방향으로 깨끗한 질소의 스트림으로 커버립을 건조. 24- 24밀리미터 커버립을 증류수와 에탄올로 헹구고 깨끗한 질소를 건조시합니다. 건조 후 24 mm 24mm 커버슬립을 알루미늄 호일 조각에 놓고 양면 테이프 스트립을 커버슬립에 놓습니다.그런 다음 24mm에서 24mm 커버슬립을 호일에서 잘라 내고 호일을 24mm 50mm 커버슬립의 작업 측에 부드럽게 누릅니다. 친화성 측정을 위한 항체 항원 시료를 제조하기 위해 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 PBS의 적어도 2밀리리터를 걸러내고, 먼지 입자와 골재를 제거하고, 원심분리하여 항체 및 항원주에 관심이 있다. 항체 및 항원 주식의 280 나노미터 UV 흡광도를 측정하여 실제 농도를 결정하고, 시료당 50 마이크로리터의 최종 부피에서 적절한 범위의 항원 농도에서 항체-항원 혼합물의 적정계를 준비한다.그런 다음 항원-항체 혼합물을 실온에서 약 10분 동안 배양하여 결합 반응이 화학적 평형에 도달할 수 있도록 한다. 질량 광측정에 의한 항체-항원 선호도를 평가하기 위해, 현미경 침지 오일 한 방울을 계측기 목표에 적용하고 현미경의 단계에 유동 챔버를 배치한다. 유량 챔버 채널의 한쪽 끝에 여과된 PBS 10 마이크로리터를 추가합니다.버퍼는 모세관 동작으로 채널을 입력합니다. 데이터 수집 소프트웨어의 포커스 컨트롤 탭에서 거친 스테이지 이동 버튼을 위아래로 사용하여 초기 조정을 하고 선명도를 클릭하여 선명도 신호 판독을 봅니다. 미세한 위아래로 조정 버튼을 사용하여 선명도 값을 최대화하고 초점 설정 및 잠금 포커스를 클릭하여 포커스 추적 기능을 활성화합니다.클린 슬라이드의 이미지는 첫 번째 항체 항원 시료의 0.05% Load 20 마이크로리터와 동일한 신호 값을 가져야 하며, 다른 쪽 끝에서 작은 블로팅 용지로 액체를 얼룩져야 합니다. 로드 즉시 레코드를 클릭하여 100초에 해당하는 적절한 수의 데이터를 수집합니다. 데이터 수집 기간이 끝나면 데이터에 대한 파일 이름을 입력하고 확인을 클릭한 다음 샘플을 클릭하여 파일을 저장합니다.대량 광측정 데이터를 분석하려면 관심 파일을 열고 분석을 클릭합니다. 부하를 클릭하여 교정 기능을 로드하고 파일을 클릭하고 분석된 데이터를 저장하기 위해 결과를 저장합니다. 샘플에서 각 종의 상대적 농도를 얻으려면 장착 된 이벤트를 엽니 다.csv 파일은 열 M의 데이터를 적절한 플롯 및 분석 소프트웨어로 복사하고 플롯 통계 히스토그램 기능을 사용하여 분자 질량 분포를 플롯합니다. 히스토그램을 두 번 클릭하여 플롯 속성 창을 열고 자동 비닝을 사용하지 않도록 설정하고 2.5킬로달톤의 빈 크기를 선택합니다. 빈 센터를 만들고 데이터를 계산하려면 적용을 클릭하고 이동합니다.히스토그램에 가우시안 함수에 맞게 하려면 빈 센터를 선택하고 열을 계산하고 분석 피크와 여러 피크 핏 메뉴 함수를 클릭합니다. 두 번 클릭하여 배포 플롯에서 대략적인 피크 위치를 나타내고 NL 맞춤 열기를 클릭합니다. XC 피크 센터에 대한 고정 확인란을 확인하고 자유 항체 및 단일 및 이중 항원 항체 복합체의 예상 분자 질량에 값을 설정합니다.너비 매개 변수에 대한 공유 옵션을 확인하고 맞춤을 클릭합니다. 가우시안 성분의 장착된 피크 높이 값은 시료의 각 종의 상대적 농도를 나타냅니다. 그런 다음 방정식을 사용하여 피크 높이 값에서 각 종의 농도 분수를 계산합니다.스프레드시트 프로그램을 사용하여 평형 상수를 계산하려면 해리상수 계산을 엽니다. xlsx 워크 시트. 이 워크시트에서 1~10개의 노란색 강조 표시된 셀 값을 수정하여 평형 상수 계산을 수행할 수 있습니다.나노몰러 단위로 추정된 해리 상수 값을 세포 B1 및 B2로 입력한다. 예상 해리 상수 값을 알 수 없는 경우 셀 B1 및 B2의 기본 값을 변경하지 않은 상태로 둡니다. 나노몰러 단위로 전체 항체 및 총 항원 농도를 세포 D2 및 E2로 입력하고 세포 F2, G2 및 H2로 각 종에 대한 계산된 분획 값을 입력합니다. 적정에 대한 글로벌 분석을 수행할 때 적절한 데이터 분획 값을 행 2에서 10까지 행에 추가합니다. 솔버 매개 변수 창에서, 가변 셀 박스를 변경하여 설정 된 목표 상자 및 셀 B1에 대한 셀 B15를 선택합니다.to 옵션에 대한 최소 버튼을 선택하고 구속되지 않은 변수가 음수 가변이 아닌 확인란을 확인한 다음 해결 방법으로 GRG 비선형을 선택하고 해결 방법을 클릭합니다. 가장 적합한 해리 상수 값은 셀 B1 및 B2에 표시됩니다. 그리고 제곱 된 오류의 최종 합계는 셀 B15에 표시됩니다. 본 대표적인 실험에서, 고정된 25나노몰러 농도에서 항인간 혈전 항체를 가진 적정계는 0, 7.5, 15, 30, 60 및 120 나노몰라 인간 알파-트롬빈 농도를 실시하여 항원-항체 혼합물 및 항체 샘플의 분자 질량 분포를 얻기 위해 수행되었다.가우시안 성분의 피크 높이 파라미터에 가장 잘 맞는 피크 포미터가 정규화되어 종 농도 분획을 얻었다. 농도 분획 값은 항원-항체 결합 친화성을 얻기 위해 전 세계적으로 적합하였다. 실험농도 분획 및 자유항체, 단일 항원 항체 복합체 및 이중 항원 복합체에 대한 전 세계적 적합성 결과를 플롯할 수 있다.정확한 KD 값을 얻으려면 모든 반응 종을 채우기 위해 단백질 농도를 신중하게 선택해야 합니다. 다양한 항원 농도를 사용하여 적정 계열을 준비하는 것이 좋습니다. 데이터를 피팅한 후 오류 프로젝션 방법을 사용하여 피팅 오류를 얻을 수 있지만 실험을 반복하고 평균 바인딩 선호도 값의 표준 편차를 계산하는 것이 좋습니다.

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