Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Vi takker Keir Neuman for hans kritiske lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av det intramurale programmet til NHLBI, NIH.

1. Klargjør strømningskamrene
<ol><li>Rengjør glassdekslene<ol>
<li>Bruk vaskeflasker med destillert vann, etanol og isopropanol, skyll de 24 mm x 50 mm dekkslepper i følgende rekkefølge: vann, etanol, vann, isopropanol, vann. Tørk dekkglassene med en strøm av rent nitrogen. Det er viktig å skylle dekkglassene fra topp til bunn, og holder nederste hjørne med myktippet tang. Tørk dekkglasset i samme retning for å unngå å overføre kontaminering fra tangen (figur 2A).</li>
		<li...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

Den Mass Photometry basert protokoll skissert her gir en rask og nøyaktig metode for å måle antigen-antistoff bindende affiniteter. MP-analyse bruker en svært liten mengde materiale, og tilleggsinformasjon , inkludert stoichiometry, oligomerization og renhet - kan vurderes fra de samme dataene (figur 5). Uten modifikasjoner gjelder denne metoden for målinger av dissosiasjonskonstanter i ca. 5 nM til 500 nM-området, og for ligandmolekyler med molekylær masse på ca. 20 kDa eller størr...

Antistoffer har blitt allestedsnærværende verktøy for molekylærbiologi og brukes mye i både medisinske og forskningsapplikasjoner. I medisin er de kritisk viktige i diagnostikk, men deres terapeutiske applikasjoner utvides også og nye antistoffbaserte terapier utviklesstadig 1,2,3,4. De vitenskapelige anvendelsene av antistoffer inkluderer mange uunnværlige laboratorieteknikker som immunofluorescence5,immunoprecipitation6,flow cytometri7,ELISA og vestlig blotting. For hver av disse programmene er det avgjørende å oppnå nøyaktige målinger av antistoffets bindende egenskaper, inkludert bindende affinitet og spesifisitet.
Siden det første kommersielle overflateplasmonresonansinstrumentet (SPR) ble introdusert i 1990, har optiske biosensorer blitt "gullstandarden" for antistoffkarakterisering, men andre teknikker, inkludert ELISA, brukes også rutinemessig til å måle antistoffaffiniteter8,9. Disse metodene krever vanligvis immobilisering eller merking av de analyserte molekylene, noe som potensielt kan påvirke samspillet av interesse. De er også relativt trege, og involverer flere analysetrinn før resultatene kan samles inn for dataanalyse. En nylig utviklet enkeltmolekylmetode, massemetri (MP), oppdager molekyler direkte i løsningen når de lander på overflaten av mikroskopet dekker10,11. Den lysspappende optiske deteksjonen som MP bruker, krever ikke proteinmerking eller modifikasjon. Individuelle proteinmolekyler registreres av det interferometriske spredningsmikroskopet som mørke flekker som vises i bildet (figur 1D), og flere tusen molekyler kan oppdages i løpet av ett minutts datainnsamling12. Signalet som genereres av hver enkelt partikkel kvantifiseres, og kontrastverdien (relativ mørke) beregnes. De interferometriske kontrastverdiene er proporsjonale med proteinenes molekylære masser, noe som gjør det mulig å identifisere bundne og frie arter i antigenantistoffblandingen. Samtidig, ved å telle molekylære landingshendelser, måler MP direkte artsbestandene. Dette gir MP-baserte metoder en unik evne til selvstendig å kvantifisere affiniteter av flere bindende nettsteder.
Binding av antigen (Ag) molekyler til de to bindende stedene i det intakte antistoffet (Ab) kan beskrives som: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> med likevektsforeningen konstanter Ka1 og Ka2 definert som: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> der ci og f i representerer konsentrasjon og brøkdel av komponenten i, henholdsvis. Den totale antigenkonsentrasjonen (cAg)tot kan uttrykkes som: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Siden de totale konsentrasjonene av antistoffet (cAb)tot og antigen (cAg)tot er kjent, kan denne ligningen brukes til å passe direkte til de eksperimentelle komponentfraksjonene hentet fra MP-målingene og beregne likevektsforeningen konstanter Ka1 og Ka2 (se tilleggsinformasjon).
MP-dataene kan også brukes til å estimere samarbeid mellom de to antistoffbindingsstedene11. For to antistoffparatoper med identiske mikroskopiske bindende konstanter, er de statistiske faktorene som beskriver prosessen med populasjonen av Ab· Ag og Ab· Ag2 komplekser tilsier at den tilsynelatende makroskopiske likevekt konstanter Ka1 og Ka2 ikke vil være numerisk lik, og Ka1 = 4Ka2. De eksperimentelle verdiene til Ka1 < 4Ka2 indikerer derfor positiv samarbeid mellom de to antistoffbindingsstedene. Tilsvarende indikerer Ka1 > 4Ka2 negativ cooperativity.
MP målinger av antigen-antistoff binding affinitet er rask og krever en liten mengde materiale. MP massedistribusjoner som brukes for likevekt konstant beregninger gir tilleggsinformasjon om prøveegenskapene og aktiverer vurderingen av prøve renhet, oligomerisering, og aggregering i ett enkelt eksperiment. Den samme metoden kan brukes til å måle høy affinitet protein-protein binding, og MP er spesielt nyttig for studier av multi-valent protein interaksjoner. Multi-protein komplekser har vanligvis store molekylære masser, optimal for MP deteksjon, og enkeltmolekyldata kan brukes til å måle stoichiometry og beregne affiniteter av flere bindende steder samtidig. Denne informasjonen er vanligvis vanskelig å få tak i ved hjelp av bulkbaserte metoder.
Uten modifikasjoner er den nåværende protokollen egnet for målinger av relativt høy affinitet, submikrolarinteraksjoner med antigener av en molekylær masse på 20 kDa eller større. For optimale resultater bør proteinlagrene være av høy renhet, men det er ingen spesifikke bufferkrav. Ved hjelp av MP kan antigen-antistoffbindingen vurderes på mindre enn fem minutter. Datainnsamlingen og analysen som kreves for nøyaktige Kd-beregninger kan utføres innen 30 minutter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

Målinger av spesifisitet og affinitet av antigen-antistoff interaksjoner er kritisk viktig for medisinske og forskningsapplikasjoner. I denne protokollen beskriver vi implementeringen av en ny enkeltmolekylteknikk, massefotometri (MP), for dette formålet. MP er en etikett- og immobiliseringsfri teknikk som oppdager og kvantifiserer molekylære masser og populasjoner av antistoffer og antigen-antistoffkomplekser på et enkeltmolekylnivå. MP analyserer antigen-antistoffprøven i løpet av minutter, noe som gir nøyaktig bestemmelse av bindingsaffinitet og samtidig gir informasjon om stoichiometry og den oligomeriske tilstanden til proteinene. Dette er en enkel og grei teknikk som krever bare picomolemengder protein og ingen dyre forbruksvarer. Den samme prosedyren kan brukes til å studere protein-proteinbinding for proteiner med en molekylær masse større enn 50 kDa. For multivalente proteininteraksjoner kan affinitetene til flere bindingssteder oppnås i en enkelt måling. Imidlertid pålegger enkeltmolekylet målemåte og mangel på merking noen eksperimentelle begrensninger. Denne metoden gir de beste resultatene når den brukes på målinger av submikrolar interaksjonsaffiniteter, antigener med en molekylær masse på 20 kDa eller større, og relativt rene proteinprøver. Vi beskriver også fremgangsmåten for å utføre de nødvendige tilpasnings- og beregningstrinnene ved hjelp av grunnleggende dataanalyseprogramvare.

Vi har tidligere undersøkt samspillet mellom humant α-trombin (HT) og mus monoklonalt anti-humant trombin antistoff (AHT) ved hjelp av MP-basert analyse11. Siden den molekylære massen av HT (37 kDa) er under 40 kDa-deteksjonsgrensen, kan maksimal prøvekonsentrasjon overskride 50 nM MP konsentrasjonsbegrensning uten å påvirke oppløsningen av massedistribusjoner negativt. Eksperimentet ble planlagt som en titreringsserie med AHT-antistoffet ved en fast 25 nM konsentrasjon, og HT ved konsentra...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Vi beskriver en enkeltmolekyltilnærming til antigen-antistoff affinitet målinger ved hjelp av massemetri (MP). Den MP-baserte protokollen er rask, nøyaktig, bruker en svært liten mengde materiale, og krever ikke proteinmodifisering.

Rask bestemmelse av antistoff-antigen affinitet av masse fotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Antistoffer brukes rutinemessig i laboratorieteknikker, og deres terapeutiske og diagnostiske applikasjoner ekspanderer raskt. Rask og nøyaktig antigen-antistoff binding karakterisering er kritisk viktig for disse programmene. Massefotometri måler raskt bindende affiniteter ved hjelp av ekstremt små mengder materiale.Ingen merking eller immobilisering er nødvendig, og informasjon om protein oligomerisering og renhet kan fås fra samme eksperiment. Denne protokollen kan brukes ikke bare til å studere antistoffer, men også for å måle sterke proteinproteinbindinger for proteiner med en molekylær masse større enn 50 kilodaltonn. Begynn med å bruke soft-tip tang og vaske flasker for å sekvensielt skylle 24 med 50 millimeter dekkerlips fra topp til bunn med destillert vann, etanol, destillert vann, isopropanol og destillert vann.Etter siste vask tørker du dekkslipsene med en strøm av rent nitrogen i samme retning for å unngå å overføre forurensning fra tangene. Skyll 24 med 24 millimeter deksler med destillert vann og etanol som vist, etterfulgt av tørking med en strøm av rent nitrogen. Etter tørking, plasser en 24 med 24 millimeter deksler på et stykke aluminiumsfolie og legg strimler med dobbeltsidig tape på dekkslippen.Klipp deretter 24 med 24 millimeter deksler ut av folien og trykk forsiktig folien på arbeidssiden av 24 med 50 millimeter dekkslips. For å forberede antistoff-antigenprøver for affinitetsmålingene, filtrer minst to milliliter PBS gjennom et 0,22 mikron sprøytefilter for å fjerne støvpartikler og aggregater, og sentrifugere antistoff- og antigenlagrene av interesse. Mål 280 nanometer UV absorbans av antistoff og antigen bestander for å bestemme sine faktiske konsentrasjoner, og forberede en titrering serie av antistoff-antigen blandinger på riktig område av antigenkonsentrasjoner i et endelig volum på 50 mikroliter per prøve.Inkuber deretter antigen-antistoffblandingene i ca. 10 minutter ved romtemperatur for å tillate bindingsreaksjonen å nå kjemisk likevekt. For å vurdere antistoff-antigenaffinitet ved massefotometri, bruk en dråpe mikroskop nedsenking olje til instrumentet objektiv og plassere strømningskammeret på scenen av mikroskopet. Tilsett 10 mikroliter filtrert PBS i den ene enden av strømningskammerkanalen.Bufferen kommer inn i kanalen ved kapillærhandling. I fokuskontrollfanen i datainnsamlingsprogramvaren bruker du de grove stadiebevegelsesknappene opp og ned til å foreta de første justeringene og klikke skarphet for å vise skarphetssignalavlesningen. Bruk fine opp- og nedjusteringsknappene for å maksimere skarphetsverdien og klikk sett fokus og låsefokus for å aktivere fokussporingsfunksjonen.Et bilde av et rent lysbilde bør ha en signalverdi lik eller under 0,05%Last 20 mikroliter av den første antistoff-antigenprøven som vist, og blotting væsken fra den andre enden med et lite stykke blotting papir. Umiddelbart etter lasting klikker du post for å hente riktig antall rammer tilsvarende 100 sekunder med data. På slutten av datainnsamlingsperioden skriver du inn et filnavn for dataene og klikker OK, og deretter eksempel på å lagre filen.Hvis du vil analysere massefotometridataene, åpner du filen av interesse og klikker analyser. Klikk last inn for å laste inn kalibreringsfunksjonen og klikke fil og lagre resultater som for å lagre de analyserte dataene. For å oppnå de relative konsentrasjonene til hver art i prøven, åpne hendelsene som er utstyrt.csv-fil, kopier dataene i kolonne M til riktig plotting og analyse programvare, og bruke plottet statistikk histogrammet funksjon for å plotte molekylær massedistribusjon. Dobbeltklikk på histogrammet for å åpne vinduet for tegneegenskaper, deaktivere automatisk binning og velge en hyllestørrelse på 2,5 kilodaltonn. Hvis du vil opprette hyllesentrene og teller data, klikker du Bruk og gå.Hvis du vil tilpasse histogrammet med gaussiske funksjoner, merker du hyllesentrene og teller kolonner og klikker analysetoppene og menyfunksjonen med flere topptilpassinger med grunnlinje. Dobbeltklikk for å angi omtrentlige toppposisjoner på distribusjonsplottet og klikk åpne NL-tilpasning. Sjekk de faste avmerkingsboksene for XC peak sentre og sette sine verdier til de forventede molekylære massene av gratis antistoff og enkelt og dobbel antigen-antistoff komplekser.Merk av for delingsalternativet for breddeparameterne, og klikk på Tilpass. De monterte topphøydeverdiene til de gaussiske komponentene representerer den relative konsentrasjonen av hver art i prøven. Bruk deretter ligningen til å beregne konsentrasjonsfraksjonen av hver art fra topphøydeverdiene.Hvis du vil beregne likevektskonstanter ved hjelp av et regnearkprogram, åpner du dissosiasjonskonsenksjonen. xlsx regneark. I dette regnearket kan de gule uthevede celleverdiene i rad 1 til 10 endres for å utføre likevektskonstantberegningene.Angi de estimerte dissosiasjonskonstantverdiene i nanomlarenheter i cellene B1 og B2. Hvis de estimerte dissosiasjonskonstantverdiene ikke er kjent, lar du standardverdiene i cellene B1 og B2 være uendret. Skriv inn det totale antistoffet og de totale antigenkonsentrasjonene i nanomærenheter i cellene D2 og E2, og skriv inn de beregnede brøkverdiene for hver art i cellene F2, G2 og H2. Når du utfører global analyse av titreringen, legger du til de riktige datafraksjonsverdiene i rad 2 til 10. I vinduet problemløserparametere velger du celle B15 for den angitte målboksen og cellene B1 til B2 for boksen ved å endre variabelceller.Velg min-knappen for alternativet til og merk av for gjør ubegrensede variabler ikke-negative, og velg deretter GRG nonlinear som løsningsmetode og klikk løs. De beste passformdissosiasjonskonstantverdiene vises i cellene B1 og B2. Og den endelige summen av de kvadrerte feilene vil bli vist i celle B15. I dette representative eksperimentet ble det utført en titreringsserie med det antimenneskende trombinantistoffet ved en fast 25 nanomolarkonsentrasjon og 0, 7,5, 15, 30, 60 og 120 nanomolar humane alfa-trombinkonsentrasjoner for å oppnå molekylære massefordelinger av antigenantistoffblandingene og antistoffet bare prøven.Beste passform topp høyde parametere av gaussiske komponenter ble normalisert for å oppnå arter konsentrasjonsfraksjoner. Konsentrasjonsfraksjonsverdiene ble deretter egnet globalt for å oppnå antigen-antistoffbindende affiniteter. De eksperimentelle konsentrasjonsfraksjonene og de globale tilpasningsresultatene for det frie antistoffet, enkeltantigenantistoffkomplekset og dobbelt antigenkompleks kan deretter plottes.For å oppnå nøyaktige KD-verdier må proteinkonsentrasjoner nøye velges for å fylle alle reaksjonsartene. Vi anbefaler at du forbereder en titreringsserie ved hjelp av en rekke antigenkonsentrasjoner. Etter montering av dataene kan feilprojeksjonsmetoden brukes til å oppnå tilpasningsfeilen, men det er bedre å gjenta eksperimentet og beregne standardavvikene for de gjennomsnittlige bindingsaffinitetsverdiene.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Arter Bestemmelse og kvantifisering i blandinger Bruke MRM massespektrometri av Peptider Applied til Meat Authentication

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

En Rapid Laser Sondering Metode Forenkler Non-invasiv og berøringsfri Fastsettelse av Leaf termiske egenskaper

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktivert tverrbundet Agarose for den raske utviklingen av affinitet kromatografi harpikser-antistoff fangst som en Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...