Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Agradecemos a Keir Neuman por sua leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo programa intramuros da NHLBI, NIH.

1. Prepare as câmaras de fluxo
<ol><li>Limpe as tampas de vidro<ol>
<li>Utilizando garrafas de lavagem com água destilada, etanol e isopropanol, enxágue as tampas de 24 mm x 50 mm na seguinte ordem: água, etanol, água, isopropanol, água. Seque as tampas com um fluxo de nitrogênio limpo. É importante enxaguar as tampas de cima para baixo, segurando o canto inferior com fórceps de ponta macia. Seque a tampa na mesma direção para evitar a transferência de contaminação das fórceps(Figura...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

O protocolo baseado em Fotometria em Massa descrito aqui fornece um método rápido e preciso de medir afinidades de ligação de anticorpos de antígeno. A análise de MP usa uma quantidade muito pequena de material e informações adicionais — incluindo estequiometria, oligomerização e pureza — podem ser avaliadas a partir dos mesmos dados(Figura 5). Sem modificações, este método é aplicável às medições de constantes de dissociação na faixa de aproximadamente 5 nM a 500 nM,...

Os anticorpos tornaram-se ferramentas onipresentes da biologia molecular e são usados extensivamente em aplicações médicas e de pesquisa. Na medicina, eles são criticamente importantes em diagnósticos, mas suas aplicações terapêuticas também estão se expandindo e novas terapias baseadas em anticorpos estão sendo constantemente desenvolvidas1,2,3,4. As aplicações científicas dos anticorpos incluem muitas técnicas laboratoriais indispensáveis, como a imunofluorescência5,a imunoprecipitação6,a citometria de fluxo7,a ELISA e a mancha ocidental. Para cada uma dessas aplicações, obter medidas precisas das propriedades vinculantes do anticorpo, incluindo afinidade e especificidade vinculantes, é de importância crucial.
Desde que o primeiro instrumento de ressonância de plasmon de superfície comercial (SPR) foi introduzido em 1990, os biosensores ópticos tornaram-se o "padrão ouro" da caracterização de anticorpos, mas outras técnicas, incluindo a ELISA, também são rotineiramente utilizadas para medir afinidades de anticorpos8,9. Esses métodos geralmente requerem imobilização ou rotulagem das moléculas analisadas, o que pode afetar potencialmente a interação de interesse. Eles também são relativamente lentos, envolvendo múltiplas etapas de ensaio antes que os resultados possam ser coletados para análise de dados. Um método de molécula única recentemente desenvolvido, a fotometria em massa (MP), detecta moléculas diretamente na solução quando pousam na superfície do microscópio, o deslizamento10,11. A detecção óptica baseada em dispersão de luz que a MP emprega não requer rotulagem ou modificação de proteínas. Moléculas proteicas individuais são registradas pelo microscópio de dispersão interferométrica à medida que manchas escuras aparecem na imagem (Figura 1D), e várias milhares de moléculas podem ser detectadas durante a aquisição de dados de um minuto12. O sinal gerado por cada partícula individual é quantificado, e seu valor de contraste (escuridão relativa) é calculado. Os valores de contraste interferométrico são proporcionais às massas moleculares das proteínas, o que permite a identificação de espécies ligadas e livres na mistura antígeno-anticorpo. Ao mesmo tempo, contando eventos de pouso molecular, a MP mede diretamente as populações de espécies. Isso dá aos métodos baseados em MP uma capacidade única de quantificar independentemente as afinidades de vários sites de vinculação.
A ligação das moléculas de antígeno(Ag)aos dois locais de ligação do anticorpo intacto(Ab)pode ser descrita como: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> com as constantes de associação de equilíbrio Ka1 e Ka2 definidas como: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> onde ci e f i representam concentração e fração do componente i,respectivamente. A concentração total de antígeno(cAg)pode ser expressa como: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Uma vez que são conhecidas as concentrações totais do anticorpo (cAb)tot e antígeno(cAg),esta equação pode ser usada para se encaixar diretamente nas frações de componentes experimentais obtidas das medições de MP e calcular as constantes de associação de equilíbrio Ka1 e Ka2 (ver Informações Complementares).
Os dados da MP também podem ser usados para estimar a cooperatividade entre os dois locais de ligação de anticorpos11. Para dois paratopos de anticorpos com constantes microscópicas idênticas, os fatores estatísticos que descrevem o processo populacional do Ab· Ag e Ab· Oscomplexos Ag2 ditam que as aparentes constantes de equilíbrio macroscópico Ka1 e Ka2 não serão numericamente iguais, e Ka1 = 4Ka2. Portanto, os valores experimentais de Ka1 < 4Ka2 indicam cooperatividade positiva entre os dois locais de ligação de anticorpos. Da mesma forma, Ka1 > 4Ka2 indica cooperatividade negativa.
As medidas mp da afinidade de ligação antígeno-anticorpo são rápidas e requerem uma pequena quantidade de material. As distribuições de massa mp utilizadas para cálculos constantes de equilíbrio fornecem informações adicionais sobre as propriedades da amostra e permitem a avaliação da pureza da amostra, oligomerização e agregação em um único experimento. O mesmo método pode ser usado para medir a ligação proteína-proteína de alta afinidade, e a MP é particularmente útil para estudos de interações proteicas multi-valentes. Complexos multi-proteínas geralmente têm grandes massas moleculares, ótimas para detecção de MP, e dados de molécula única podem ser usados para medir a estequiometria e calcular afinidades de múltiplos locais de ligação simultaneamente. Essas informações geralmente são difíceis de obter usando métodos baseados em massa.
Sem modificações, o protocolo atual é adequado para medições de interações submicrlares relativamente altas e submicrílares com antígenos de uma massa molecular de 20 kDa ou maior. Para obter resultados ótimos, os estoques de proteínas devem ser de alta pureza, mas não há requisitos específicos de buffer. Usando MP, a ligação antígeno-anticorpo pode ser avaliada em menos de cinco minutos. A coleta e análise de dados necessárias para cálculos Kd precisos podem ser realizadas dentro de 30 minutos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

As medidas da especificidade e afinidade das interações antígeno-anticorpos são criticamente importantes para aplicações médicas e de pesquisa. Neste protocolo, descrevemos a implementação de uma nova técnica de molécula única, fotometria em massa (MP), para este fim. MP é uma técnica livre de rótulos e imobilização que detecta e quantifica massas moleculares e populações de anticorpos e complexos de anticorpos de antígeno em um nível de molécula única. Mp analisa a amostra de anticorpos de antígeno em poucos minutos, permitindo a determinação precisa da afinidade vinculante e simultaneamente fornecendo informações sobre a estequiometria e o estado oligomérico das proteínas. Trata-se de uma técnica simples e simples que requer apenas quantidades de picomole de proteína e sem consumíveis caros. O mesmo procedimento pode ser usado para estudar a ligação proteína-proteína para proteínas com uma massa molecular maior que 50 kDa. Para interações proteicas multivalentes, as afinidades de múltiplos locais de ligação podem ser obtidas em uma única medição. No entanto, o modo de medição de molécula única e a falta de rotulagem impõem algumas limitações experimentais. Este método dá os melhores resultados quando aplicado às medições de afinidades de interação submicílar, antígenos com uma massa molecular de 20 kDa ou maiores, e amostras relativamente puras de proteína. Descrevemos também o procedimento para a realização das etapas necessárias de montagem e cálculo usando o software básico de análise de dados.

Examinamos anteriormente a interação do humano α-trombina (HT) e do anticorpo anti-trombina monoclonal (AHT) usando o ensaio baseado em MP11. Uma vez que a massa molecular do HT (37 kDa) está abaixo do limite de detecção de 40 kDa, a concentração máxima da amostra pode exceder a limitação de concentração de 50 nM MP sem afetar negativamente a resolução das distribuições de massa. O experimento foi planejado como uma série de titulação com o anticorpo AHT em uma concentração f...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Descrevemos uma abordagem de molécula única para medições de afinidade antígeno-anticorpos usando fotometria em massa (MP). O protocolo baseado em MP é rápido, preciso, usa uma quantidade muito pequena de material, e não requer modificação de proteína.

Determinação rápida da afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Os anticorpos são rotineiramente usados em técnicas de laboratório e suas aplicações terapêuticas e diagnósticas estão se expandindo rapidamente. A caracterização de ligação de antígeno e anticorpos rápido e preciso é criticamente importante para essas aplicações. A fotometria em massa mede rapidamente afinidades de ligação usando quantidades extremamente pequenas de material.Não é necessária rotulagem ou imobilização e informações sobre oligomerização e pureza proteica podem ser obtidas a partir do mesmo experimento. Este protocolo pode ser usado não só para estudar anticorpos, mas também para medir fortes ligações proteína-proteína para proteínas com uma massa molecular maior que 50 kilodaltons. Comece usando fórceps de ponta macia e lave garrafas para enxaguar sequencialmente 24 por 50 milímetros de coberturas de cima a baixo com água destilada, etanol, água destilada, isopropanol e água destilada.Após a última lavagem, seque as tampas com um fluxo de nitrogênio limpo na mesma direção para evitar a transferência de contaminação dos fórceps. Enxágüe 24 por 24 milímetros com água destilada e etanol como demonstrado, seguido de secagem com um fluxo de nitrogênio limpo. Após a secagem, coloque uma tampa de 24 por 24 milímetros sobre um pedaço de papel alumínio e coloque tiras de fita dupla face no deslizamento de tampas.Em seguida, corte o deslizamento de cobertura de 24 por 24 milímetros para fora da folha e pressione suavemente a folha para o lado de trabalho do deslizamento de cobertura de 24 por 50 milímetros. Para preparar amostras de anticorpos-antígenos para as medidas de afinidade, filtre pelo menos dois mililitros de PBS através de um filtro de seringa de 0,22 mícrons para remover partículas e agregados de poeira, e centrifugar os estoques de anticorpos e antígenos de interesse. Meça a absorção UV de 280 nanômetros dos estoques de anticorpos e antígenos para determinar suas concentrações reais, e prepare uma série de misturas de anticorpos e antígenos na faixa apropriada de concentrações de antígeno em um volume final de 50 microliters por amostra.Em seguida, incubar as misturas de anticorpos de antígeno por aproximadamente 10 minutos à temperatura ambiente para permitir que a reação de ligação atinja o equilíbrio químico. Para avaliar a afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa, aplique uma gota de óleo de imersão de microscópio ao objetivo do instrumento e coloque a câmara de fluxo no estágio do microscópio. Adicione 10 microliters de PBS filtrado a uma extremidade do canal da câmara de fluxo.O buffer entrará no canal por ação capilar. Na guia de controle de foco do software de coleta de dados, use os botões de movimento de estágio grosseiro para cima e para baixo para fazer os ajustes iniciais e clicar em nitidez para ver a leitura do sinal de nitidez. Use os botões de ajuste finos para cima e para baixo para maximizar o valor de nitidez e clique em definir foco e foco de bloqueio para ativar a função de rastreamento de foco.Uma imagem de um slide limpo deve ter um valor de sinal igual ou inferior a 0,05% Carregar 20 microliters da primeira amostra de anticorpos-antígenos como demonstrado, manchando o líquido da outra extremidade com um pequeno pedaço de papel manchador. Imediatamente após o carregamento, clique em gravar para adquirir o número apropriado de quadros equivalente a 100 segundos de dados. No final do período de coleta de dados, digite um nome de arquivo para os dados e clique em OK e, em seguida, amostra para salvar o arquivo.Para analisar os dados de fotometria em massa, abra o arquivo de interesse e clique em analisar. Clique em carregar a função de calibração e clique em arquivo e salve resultados para salvar os dados analisados. Para obter as concentrações relativas de cada espécie na amostra, abra os eventos adaptados.arquivo csv, copie os dados na coluna M no software de plotagem e análise apropriado e use a função histograma de estatísticas de plotagem para traçar a distribuição de massa molecular. Clique duas vezes no histograma para abrir a janela de propriedades do lote, desativar o binning automático e selecionar um tamanho de caixa de 2,5 kilodaltons. Para criar os bin centers e os dados da contagem, clique em aplicar e ir.Para encaixar o histograma com as funções gaussianas, selecione os centros de lixo e as colunas de contagem e clique nos picos de análise e na função de menu de ajuste de pico múltiplo da linha de base. Clique duas vezes para indicar as posições de pico aproximadas no gráfico de distribuição e clique em abrir o AJUSTE NL. Verifique as caixas de seleção fixas para os centros de pico XC e defina seus valores para as massas moleculares esperadas do anticorpo livre e dos complexos de anticorpos de antígeno único e duplo.Verifique a opção de compartilhamento para os parâmetros de largura e clique em encaixar. Os valores de altura máxima dos componentes gaussianos representam a concentração relativa de cada espécie na amostra. Em seguida, use a equação para calcular a fração de concentração de cada espécie a partir dos valores de altura máxima.Para calcular as constantes de equilíbrio usando um programa de planilha, abra o cálculo de dissociação. planilha xlsx. Nesta planilha, os valores de células destacadas amarelas nas linhas 1 a 10 podem ser modificados para realizar os cálculos constantes de equilíbrio.Digite os valores constantes de dissociação estimados em unidades nanomolares nas células B1 e B2. Se os valores constantes de dissociação estimados não forem conhecidos, deixe os valores padrão nas células B1 e B2 inalterados. Insira o total de anticorpos e concentrações totais de antígeno em unidades nanomolares nas células D2 e E2 e insira os valores de fração calculados para cada espécie nas células F2, G2 e H2. Ao realizar a análise global da titulação, adicione os valores de fração de dados apropriados nas linhas 2 a 10. Na janela de parâmetros do solucionador, selecione a célula B15 para a caixa objetiva definida e as células B1 a B2 para a caixa de células variáveis.Selecione o botão min para a opção a to e verifique a caixa de seleção de variáveis não-negativas, selecione GRG não linear como o método de resolução e clique em resolver. Os valores constantes de dissociação mais adequados serão mostrados nas células B1 e B2. E a soma final dos erros quadrados será mostrada na célula B15. Neste experimento representativo, uma série de titulação com o anticorpo trombina anti-humana em uma concentração fixa de 25 nanomolares e 0, 7,5, 15, 30, 60 e 120 concentrações de alfa-trombina humana nanomolar foram realizadas para obter as distribuições moleculares de massa das misturas de anticorpos de antígeno e apenas anticorpos.Os parâmetros de altura máxima mais adequados dos componentes gaussianos foram normalizados para obter frações de concentração de espécies. Os valores da fração de concentração foram então adequados globalmente para obter as afinidades de ligação antígeno-anticorpo. As frações de concentração experimental e os resultados globais de ajuste para o anticorpo livre, complexo de anticorpos monogênicos e complexo de antígeno duplo poderiam então ser plotados.Para obter valores de KD precisos, as concentrações proteicas devem ser cuidadosamente selecionadas para povoar todas as espécies de reação. Recomendamos preparar uma série de titulação usando uma série de concentrações de antígeno. Após a montagem dos dados, o método de projeção de erro pode ser usado para obter o erro de montagem, mas é melhor repetir o experimento e calcular os desvios padrão dos valores médios de afinidade de ligação.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Determinação das espécies e quantificação de misturas utilizando MRM Espectrometria de Massa de peptídeos Aplicada à autenticação Meat

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Bioquímica

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

A Laser rápida Sondagem Método facilita a determinação não invasiva e sem contato das propriedades térmicas da folha

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio Cinética de ligação utilizando quatro plataformas Biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometria de massa folha Spray: Uma técnica de ionização ambiente rápida para avaliar diretamente a metabolitos de tecidos vegetais

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Agarose reticulada ativada para o rápido desenvolvimento de resinas de cromatografia de afinidade-captura de anticorpos como um estudo de caso

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...