Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
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Agradecemos a Keir Neuman por su lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el programa intramuros de la NHLBI, NIH.

1. Prepare las cámaras de flujo
<ol><li>Limpie los cubreobjetos de vidrio<ol>
<li>Usando botellas de lavado con agua destilada, etanol e isopropanol, enjuague los cubreobjetos de 24 mm x 50 mm en el siguiente orden: agua, etanol, agua, isopropanol, agua. Seque los cubreobjetos con una corriente de nitrógeno limpio. Es importante enjuagar los cubreobjetos de arriba a abajo, sosteniendo la esquina inferior con fórceps de punta suave. Seque el cubreobjetos en la misma dirección para evitar la transferencia de contamin...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

El protocolo basado en fotometría de masas descrito aquí proporciona un método rápido y preciso para medir las afinidades de unión de anticuerpos antigen. El análisis de MP utiliza una cantidad muy pequeña de material, y la información adicional, incluida la estequiometría, la oligomerización y la pureza, se puede evaluar a partir de los mismos datos (Figura 5). Sin modificaciones, este método es aplicable a las mediciones de constantes de disociación en el rango de aproximadamen...

Los anticuerpos se han convertido en herramientas omnipresentes de la biología molecular y se utilizan ampliamente en aplicaciones médicas y de investigación. En medicina, son de vital importancia en el diagnóstico, pero sus aplicaciones terapéuticas también se están expandiendo y constantemente se desarrollan nuevas terapias basadas en anticuerpos1,2,3,4. Las aplicaciones científicas de los anticuerpos incluyen muchas técnicas de laboratorio indispensables como la inmunofluorescencia5,la inmunoprecipitación6,la citometría de flujo7,ELISA e hinchazón occidental. Para cada una de estas aplicaciones, es de crucial importancia obtener mediciones precisas de las propiedades de unión del anticuerpo, incluida la afinidad y especificidad de unión.
Desde que se introdujo el primer instrumento de resonancia de plasmon de superficie comercial (SPR) en 1990, los biosensores ópticos se han convertido en el "estándar de oro" de caracterización de anticuerpos, pero otras técnicas, incluyendo ELISA, también se utilizan rutinariamente para medir las afinidades de anticuerpos8,9. Estos métodos generalmente requieren inmovilización o etiquetado de las moléculas analizadas, lo que puede afectar potencialmente la interacción de interés. También son relativamente lentos, lo que implica varios pasos de ensayo antes de que los resultados se puedan recopilar para el análisis de datos. Un método de una sola molécula desarrollado recientemente, la fotometría de masas (MP), detecta moléculas directamente en la solución cuando aterrizan en la superficie del microscopio cubrep10,11. La detección óptica basada en dispersión de luz que emplea MP no requiere etiquetado o modificación de proteínas. Las moléculas de proteínas individuales se registran mediante el microscopio de dispersión interferométrico como manchas oscuras que aparecen en la imagen(Figura 1D),y varios miles de moléculas se pueden detectar durante la adquisición de datos de un minuto12. La señal generada por cada partícula individual se cuantifica y se calcula su valor de contraste (oscuridad relativa). Los valores de contraste interferométrico son proporcionales a las masas moleculares de las proteínas, lo que permite la identificación de especies unidas y libres en la mezcla antígeno-anticuerpo. Al mismo tiempo, contando los eventos de aterrizaje molecular, MP mide directamente las poblaciones de especies. Esto proporciona a los métodos basados en MP una capacidad única para cuantificar de forma independiente las afines de varios sitios de enlace.
La unión de las moléculas de antígeno (Ag) a los dos sitios de unión del anticuerpo intacto (Ab) se puede describir como: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> con las constantes de asociación de equilibrio Ka1 y Ka2 definidas como: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> donde ci y fi representan la concentración y fracción del componente i, respectivamente. La concentración total de antígenos (cAg)tot puede expresarse como: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Dado que se conocen las concentraciones totales del anticuerpo (cAb)tot y antígeno (cAg)tot, esta ecuación se puede utilizar para ajustar directamente las fracciones de componentes experimentales obtenidas de las mediciones MP y calcular las constantes de asociación de equilibrio Ka1 y Ka2 (ver Información complementaria).
Los datos MP también se pueden utilizar para estimar la cooperatividad entre los dos sitios de unión de anticuerpos11. Para dos paratopos de anticuerpos con constantes de unión microscópicas idénticas, los factores estadísticos que describen el proceso de población de la Ab Ag y Ab? Loscomplejos Ag2 dictan que las constantes de equilibrio macroscópicas aparentes Ka1 y Ka2 no serán numéricamente iguales, y Ka1 a 4Ka2. Por lo tanto, los valores experimentales de Ka1 < 4Ka2 indican una cooperación positiva entre los dos sitios de unión de anticuerpos. Del mismo modo, Ka1 > 4Ka2 indica una cooperación negativa.
Las mediciones MP de la afinidad de unión antígeno-anticuerpo son rápidas y requieren una pequeña cantidad de material. Las distribuciones de masa MP utilizadas para los cálculos constantes de equilibrio proporcionan información adicional sobre las propiedades de la muestra y permiten la evaluación de la pureza, la oligomerización y la agregación de la muestra en un solo experimento. El mismo método se puede utilizar para medir la unión entre proteínas y proteínas de alta afinidad, y MP es particularmente útil para estudios de interacciones multi-variables de proteínas. Los complejos multi proteico suelen tener grandes masas moleculares, óptimas para la detección de MP, y los datos de una sola molécula se pueden utilizar para medir la estequiometría y calcular las afinidades de múltiples sitios de unión simultáneamente. Esta información suele ser difícil de obtener mediante métodos basados en masa.
Sin modificaciones, el protocolo actual es adecuado para mediciones de interacciones submicromolares de relativamente alta afinidad con antígenos de una masa molecular de 20 kDa o más. Para obtener resultados óptimos, las existencias de proteínas deben ser de alta pureza, pero no hay requisitos específicos de amortiguación. Mediante el uso de MP, la unión antígeno-anticuerpos se puede evaluar en menos de cinco minutos. La recopilación y el análisis de datos necesarios para cálculos Kd precisos se pueden realizar en un plazo de 30 minutos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

Las mediciones de la especificidad y afinidad de las interacciones antígeno-anticuerpos son de vital importancia para aplicaciones médicas y de investigación. En este protocolo, describimos la implementación de una nueva técnica de una sola molécula, la fotometría de masas (MP), para este propósito. MP es una técnica libre de etiquetas e inmovilización que detecta y cuantifica las masas moleculares y las poblaciones de anticuerpos y complejos antigen-anticuerpos a nivel de una sola molécula. MP analiza la muestra de antígeno-anticuerpo en cuestión de minutos, permitiendo la determinación precisa de la afinidad de unión y proporcionando simultáneamente información sobre la estequiometría y el estado oligomérico de las proteínas. Esta es una técnica simple y directa que requiere sólo cantidades de picomole de proteína y no consumibles caros. El mismo procedimiento se puede utilizar para estudiar la unión proteína-proteína para proteínas con una masa molecular superior a 50 kDa. Para las interacciones multivalentes de proteínas, las afinidades de múltiples sitios de unión se pueden obtener en una sola medición. Sin embargo, el modo de medición de una sola molécula y la falta de etiquetado imponen algunas limitaciones experimentales. Este método da los mejores resultados cuando se aplica a mediciones de affinidades de interacción submicromolar, antígenos con una masa molecular de 20 kDa o más grandes, y muestras de proteínas relativamente puras. También describimos el procedimiento para realizar los pasos de ajuste y cálculo necesarios utilizando el software básico de análisis de datos.

Hemos examinado previamente la interacción del α-trombina humana (HT) y del anticuerpo monoclonal antihumano de ratón (AHT) utilizando el ensayo basado en MP11. Dado que la masa molecular del HT (37 kDa) está por debajo del límite de detección de 40 kDa, la concentración máxima de la muestra puede superar la limitación de concentración de MP de 50 nM sin afectar negativamente a la resolución de distribuciones de masas. El experimento se planeó como una serie de valoración con el antic...

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Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Describimos un enfoque de una sola molécula para las mediciones de afinidad antígeno-anticuerpo utilizando fotometría de masas (MP). El protocolo basado en MP es rápido, preciso, utiliza una cantidad muy pequeña de material y no requiere modificación de proteínas.

Determinación rápida de la afinidad anticuerpos-antígenos por fotometría de masas

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Los anticuerpos se utilizan habitualmente en técnicas de laboratorio y sus aplicaciones terapéuticas y diagnósticas se están expandiendo rápidamente. La caracterización rápida y precisa de la unión antígeno-anticuerpo es de vital importancia para estas aplicaciones. La fotometría de masas mide rápidamente las afinidades de unión utilizando cantidades extremadamente pequeñas de material.No se requiere etiquetado o inmovilización y se puede obtener información sobre la oligomerización y pureza de las proteínas del mismo experimento. Este protocolo se puede utilizar no sólo para estudiar anticuerpos, sino también para medir fuertes unión proteína-proteína para proteínas con una masa molecular superior a 50 kilodaltons. Comience usando fórceps de punta suave y lave las botellas para enjuagar secuencialmente los cubreobjetos de 24 por 50 milímetros de arriba a abajo con agua destilada, etanol, agua destilada, isopropanol y agua destilada.Después del último lavado, seque los cubreobjetos con una corriente de nitrógeno limpio en la misma dirección para evitar transferir la contaminación de los fórceps. Enjuague los cubreobjetos de 24 por 24 milímetros con agua destilada y etanol como se demuestra, seguido de secado con una corriente de nitrógeno limpio. Después del secado, coloque un cubreobjetos de 24 por 24 milímetros en un pedazo de papel de aluminio y coloque tiras de cinta adhesiva de doble cara en el cubreobjetos.A continuación, corte el cubreobjetos de 24 por 24 milímetros de la lámina y presione suavemente la lámina en el lado de trabajo del cubreobjetos de 24 por 50 milímetros. Para preparar muestras de anticuerpos y antígenos para las mediciones de afinidad, filtre al menos dos mililitros de PBS a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras para eliminar partículas de polvo y agregados, y centrifugar las reservas de anticuerpos y antígenos de interés. Mida la absorbancia UV de 280 nanómetros de las poblaciones de anticuerpos y antígenos para determinar sus concentraciones reales y prepare una serie de valoración de mezclas de anticuerpos y antígenos en el rango adecuado de concentraciones de antígenos en un volumen final de 50 microlitros por muestra.A continuación, incubar las mezclas de antígeno-anticuerpo durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que la reacción de unión alcance el equilibrio químico. Para evaluar la afinidad anticuerpo-antígeno por fotometría de masas, aplique una gota de aceite de inmersión del microscopio al objetivo del instrumento y coloque la cámara de flujo en la etapa del microscopio. Agregue 10 microlitros de PBS filtrados a un extremo del canal de la cámara de flujo.El búfer entrará en el canal por acción capilar. En la pestaña de control de enfoque del software de recopilación de datos, utilice los botones de movimiento de etapa grueso hacia arriba y hacia abajo para realizar los ajustes iniciales y haga clic en nitidez para ver la lectura de la señal de nitidez. Utilice los botones de ajuste finos hacia arriba y hacia abajo para maximizar el valor de nitidez y haga clic en establecer el enfoque y el enfoque de bloqueo para activar la función de seguimiento de enfoque.Una imagen de una diapositiva limpia debe tener un valor de señal igual o inferior al 0,05% Cargar 20 microlitros de la primera muestra de anticuerpos y antígenos como se ha demostrado, hinchando el líquido del otro extremo con un pequeño trozo de papel hinchado. Inmediatamente después de la carga, haga clic en registro para adquirir el número adecuado de fotogramas equivalente a 100 segundos de datos. Al final del período de recopilación de datos, escriba un nombre de archivo para los datos y haga clic en Aceptar y, a continuación, muestree para guardar el archivo.Para analizar los datos de fotometría de masas, abra el archivo de interés y haga clic en Analizar. Haga clic en cargar para cargar la función de calibración y haga clic en el archivo y guarde los resultados para guardar los datos analizados. Para obtener las concentraciones relativas de cada especie en la muestra, abra los eventosfitted.csv, copie los datos de la columna M en el software de trazado y análisis adecuado y utilice la función histograma de estadísticas de trazado para trazar la distribución de masa molecular. Haga doble clic en el histograma para abrir la ventana de propiedades de trazado, deshabilitar el binning automático y seleccionar un tamaño de bin de 2,5 kilodaltons. Para crear los centros de ubicación y los datos de recuentos, haga clic en Aplicar y listo.Para ajustar el histograma con funciones gaussianas, seleccione las columnas de centros de ubicación y recuentos y haga clic en los picos de análisis y la función de menú de ajuste de pico múltiple de línea base. Haga doble clic para indicar las posiciones de pico aproximadas en la gráfica de distribución y haga clic en Abrir ajuste NL. Marque las casillas de verificación fijas para los centros de pico XC y establezca sus valores en las masas moleculares esperadas del anticuerpo libre y los complejos de anticuerpos antigenos simples y dobles.Marque la opción de compartir para los parámetros de anchura y haga clic en ajustar. Los valores de altura máxima ajustados de los componentes gaussianos representan la concentración relativa de cada especie en la muestra. A continuación, utilice la ecuación para calcular la fracción de concentración de cada especie a partir de los valores de altura máxima.Para calcular constantes de equilibrio mediante un programa de hoja de cálculo, abra la restricción de disociación. hoja de trabajo xlsx. En esta hoja de trabajo, los valores de celda resaltados en amarillo en las filas 1 a 10 se pueden modificar para realizar los cálculos constantes de equilibrio.Introduzca los valores constantes estimados de disociación en unidades nanomolares en las células B1 y B2. Si no se conocen los valores constantes de disociación estimados, deje los valores predeterminados en las celdas B1 y B2 sin cambios. Ingrese las concentraciones totales de anticuerpos y antígenos totales en unidades nanomolares en las células D2 y E2 e ingrese los valores de fracción calculados para cada especie en las células F2, G2 y H2. Al realizar un análisis global de la valoración, agregue los valores de fracción de datos adecuados en las filas 2 a 10. En la ventana de parámetros del solucionador, seleccione la celda B15 para el cuadro objetivo establecido y las celdas B1 a B2 para el cuadro de celdas variables cambiando.Seleccione el botón min para la opción to y marque la casilla de verificación make unconstrained variables non-negative, luego seleccione GRG nonlineal como método de resolución y haga clic en solve. Los valores constantes de disociación de mejor ajuste se mostrarán en las celdas B1 y B2. Y la suma final de los errores al cuadrado se mostrará en la celda B15. En este experimento representativo, se realizó una serie de valoración con el anticuerpo antihumano trombina a una concentración fija de 25 nanomolares y 0, 7,5, 15, 30, 60 y 120 concentraciones nanomolares de alfa-trombbina humana para obtener las distribuciones de masa molecular de las mezclas de antígenos-anticuerpos y la muestra de anticuerpos únicamente.Los parámetros de altura máxima de mejor ajuste de los componentes gaussianos se normalizaron para obtener fracciones de concentración de especies. Los valores de la fracción de concentración se ajustaron globalmente para obtener las afinidades de unión antígeno-anticuerpo. Las fracciones de concentración experimental y los resultados de ajuste global para el anticuerpo libre, el complejo de anticuerpos antigenos individuales y el complejo de doble antígeno podrían entonces ser trazados.Para obtener valores de KD precisos, las concentraciones de proteínas deben seleccionarse cuidadosamente para poblar todas las especies de reacción. Recomendamos preparar una serie de valoración utilizando una serie de concentraciones de antígenos. Después de ajustar los datos, el método de proyección de error se puede utilizar para obtener el error de ajuste, pero es mejor repetir el experimento y calcular las desviaciones estándar de los valores de afinidad de enlace promedio.

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