Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Vi tackar Keir Neuman för hans kritiska läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av det intramural programmet av NHLBI, NIH.

1. Förbered flödeskamrarna
<ol><li>Rengör glasskyddsslipsen<ol>
<li>Använda tvättflaskor med destillerat vatten, etanol, och isopropanol, skölj 24 mm x 50 mm täckslip i följande ordning: vatten, etanol, vatten, isopropanol, vatten. Torka täckskydden med en ström av rent kväve. Det är viktigt att skölja täcken uppifrån och ner, hålla det nedre hörnet med mjuk-tippade tyckor. Torka täckslipet i samma riktning för att undvika att överföra kontamination från tentsarna (Figur 2A</s...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

Mass Photometry baserade protokollet beskrivs här ger en snabb och korrekt metod för att mäta antigen-antikropp bindande affiniteter. MP-analys använder en mycket liten mängd material, och ytterligare information—inklusive stökiometri, oligomerisering och renhet—kan bedömas utifrån samma data (Bild 5). Utan ändringar är denna metod tillämplig på mätningarna av dissociationskonstanter i det cirka 5 nM till 500 nM-området, och för ligandmolekyler med molekylmassa på ca 20 k...

Antikroppar har blivit allestädes närvarande verktyg för molekylärbiologi och används i stor utsträckning i både medicinska och forskningsapplikationer. Inom medicinen är de kritiskt viktiga inom diagnostiken, men deras terapeutiska tillämpningar expanderar också och nya antikroppsbaserade terapier utvecklasständigt 1,2,3,4. De vetenskapliga tillämpningarna av antikroppar omfattar många oumbärliga laboratorietekniker som immunofluorescens5, immunoprecipitation6, flödescytometri7, ELISA och western blotting. För var och en av dessa tillämpningar är det av avgörande betydelse att få exakta mätningar av antikroppens bindningsegenskaper, inklusive bindningstillhörighet och specificitet.
Sedan det första kommersiella instrumentet för ytplasmonresonans (SPR) infördes 1990 har optiska biosensorer blivit "guldmyntfoten" av antikroppskarakterisering, men andra tekniker, inklusive ELISA, används också rutinmässigt för att mäta antikroppsaffiniteter8,9. Dessa metoder kräver vanligtvis immobilisering eller märkning av de analyserade molekylerna, som potentiellt kan påverka interaktionen av intresse. De är också relativt långsamma, vilket innebär flera analyssteg innan resultaten kan samlas in för dataanalys. En nyligen utvecklad enmolekylmetod, massfotometri (MP), detekterar molekyler direkt i lösning när de landar på ytan av mikroskopet coverslip10,11. Den ljusspridningsbaserade optiska detektion som MP använder kräver inte proteinmärkning eller modifiering. Enskilda proteinmolekyler registreras av det interferometriskt spridningsmikroskopet som mörka fläckar som förekommer i bilden (Figur 1D), och flera tusen molekyler kan detekteras under enminutsdatainhämtningen12. Signalen som genereras av varje enskild partikel kvantifieras, och dess kontrastvärde (relativt mörker) beräknas. De interferometriska kontrastvärdena är proportionella mot de molekylära massorna av proteinerna, vilket möjliggör identifiering av bundna och fria arter i antigen-antikroppsblandningen. Samtidigt, genom att räkna molekylära landningshändelser, mäter MP direkt artpopulationerna. Detta ger MP baserade metoder en unik förmåga att självständigt kvantifiera tillhörighet av flera bindningsplatser.
Bindning av antigenen (Ag) molekyler till de två bindningsställena för den intakta antikroppen (Ab) kan beskrivas som: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> med jämviktsassociationen konstanter Ka1 och Ka2 definierat som: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> där ci respektive fi representerar koncentration och fraktion av komponenten i, respektive. Den totala antigenkoncentrationen (cAg)tot kan uttryckas som: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Eftersom de totala koncentrationerna av antikroppen (cAb)tot och antigen (cAg) tot ärkända, kan denna ekvation användas för att direkt passa de experimentella komponentfraktioner som erhållits från MP-mätningarna och beräkna jämviktssamorganisationens konstanter Ka1 och Ka2 (se Kompletterande information).
MP-uppgifterna kan också användas för att uppskatta samarbets- och samarbetsiteten mellan de två antikroppsbindningsställena11. För två antikroppsparatoper med identiska mikroskopiska bindningskonstanter, de statistiska faktorer som beskriver processen för populationen av Ab· Ag och Ab· Ag2 komplex diktera att den skenbara makroskopiska jämvikten konstanter Ka1 och Ka2 inte kommer att vara numeriskt lika, och Ka1 = 4Ka2. Därför indikerar de experimentella värdena för Ka1 < 4Ka2 positiv samarbetsitet mellan de två antikroppsbindningsställena. Lika lite indikerar Ka1 > 4Ka2 negativ samarbetsitet.
MP-mätningar av antigenbindningsbindningsaffiniteten är snabba och kräver en liten mängd material. De MP-massfördelningar som används för equilibrium-konstantberäkningar ger ytterligare information om exempelegenskaperna och möjliggör bedömning av provrenhet, oligomerisering och aggregering i ett enda experiment. Samma metod kan användas för att mäta protein-proteinbindning med hög affinitet, och MP är särskilt användbart för studier av multi-valent protein interaktioner. Multi-protein komplex har vanligtvis stora molekylmassor, optimal för MP upptäckt, och enmolekyldata kan användas för att mäta stökiometri och beräkna tillhörighet av flera bindningsställen samtidigt. Denna information är vanligtvis svår att få med hjälp av bulkbaserade metoder.
Utan modifieringar är det aktuella protokollet lämpligt för mätningar av relativt hög-affinitet, sub-mikromolar interaktioner med antigener av en molekylmassa på 20 kDa eller större. För optimala resultat bör proteinlager ha hög renhet, men det finns inga specifika buffertkrav. Genom att använda MP kan antigen-antikroppsbindningen bedömas på mindre än fem minuter. Den datainsamling och analys som krävs för noggranna Kd-beräkningar kan utföras inom 30 minuter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

Mätningar av antigen-antikroppsinteraktioners specificitet och affinitet är av avgörande betydelse för medicinska tillämpningar och forskningstillämpningar. I detta protokoll beskriver vi genomförandet av en ny single-molecule teknik, massfotometri (MP), för detta ändamål. MP är en etikett- och immobiliseringsfri teknik som detekterar och kvantifierar molekylära massor och populationer av antikroppar och antigen-antikroppskomplex på en enmolekylsnivå. MP analyserar antigen-antikroppsprovet inom några minuter, vilket möjliggör exakt bestämning av bindningsaffiniteten och samtidigt ger information om stökiometri och proteiners oligomeriska tillstånd. Detta är en enkel och okomplicerad teknik som kräver endast picomole mängder av protein och inga dyra förbrukningsvaror. Samma procedur kan användas för att studera protein-proteinbindning för proteiner med en molekylmassa som är större än 50 kDa. För multivalenta proteininteraktioner kan affiniteterna för flera bindningsställen erhållas i en enda mätning. Men den enda molekylen mätsätt och bristen på märkning medför vissa experimentella begränsningar. Denna metod ger bäst resultat när den tillämpas på mätningar av sub-mikromolar interaktionsaffiniteter, antigener med en molekylmassa på 20 kDa eller större, och relativt rena proteinprover. Vi beskriver också proceduren för att utföra de obligatoriska monterings- och beräkningsstegen med hjälp av grundläggande dataanalysprogramvara.

Vi har tidigare undersökt samspelet mellan human α-trombin (HT) och mus monoklonal anti-human trombin antikropp (AHT) med hjälp av MP baserade assay11. Eftersom molekylmassan för HT (37 kDa) ligger under detekteringsgränsen på 40 kDa kan den maximala provkoncentrationen överskrida begränsningen av 50 nM MP-koncentration utan att det påverkar upplösningen av massfördelningar negativt. Försöket planerades som en titreringsserie med AHT-antikroppen vid en fast 25 nM-koncentration, och HT...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Vi beskriver en enda molekyl strategi för antigen-antikropp affinitet mätningar med hjälp av massa photometry (MP). Mp-baserade protokollet är snabb, korrekt, använder en mycket liten mängd material, och kräver inte protein modifiering.

Snabb bestämning av antikropp-antigen affinitet genom Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Antikroppar används rutinmässigt i laboratorietekniker och deras terapeutiska och diagnostiska tillämpningar expanderar snabbt. Snabb och exakt antigen-antikroppsbindning karakterisering är kritiskt viktig för dessa tillämpningar. Massfotometri mäter snabbt bindande affiniteter med hjälp av extremt små mängder material.Ingen märkning eller immobilisering krävs och information om protein oligomerization och renhet kan erhållas från samma experiment. Detta protokoll kan användas inte bara för att studera antikroppar, utan också för att mäta starka protein-proteinbindningar för proteiner med en molekylmassa som är större än 50 kilodalton. Börja med att använda soft-tip-tlysträn och tvätta flaskor för att sekventiellt skölja 24 av 50 millimeters täckslips uppifrån och ned med destillerat vatten, etanol, destillerat vatten, isopropanol och destillerat vatten.Efter den sista tvätten torkar du täckskydden med en ström av rent kväve i samma riktning för att undvika att överföra kontaminering från tången. Skölj 24 med 24 millimeters täckslip med destillerat vatten och etanol som visats, följt av torkning med en ström av rent kväve. Efter torkning, placera en 24 av 24 millimeter coverslip på en bit aluminiumfolie och placera remsor av dubbelsidig tejp på täcket.Skär sedan 24 med 24 millimeters täckskydd ur folien och tryck försiktigt folien på arbetssidan av 24 med 50 millimeters täckplatta. För att förbereda antikropps-antigenprover för affinitetsmätningarna, filtrera minst två milliliter PBS genom ett 0,22 mikronsprutfilter för att avlägsna dammpartiklar och aggregat samt centrifug antikropps- och antigenlager av intresse. Mät antikroppens och antigenlagrens 280 nanometer UV-absorbans för att bestämma deras faktiska koncentrationer, och bered en titreringsserie av antikropps-antigenblandningar vid lämpligt intervall av antigenkoncentrationer i en slutvolym på 50 mikroliter per prov.Inkubera sedan antigen-antikroppsblandningarna i cirka 10 minuter vid rumstemperatur för att tillåta bindningsreaktionen att nå kemisk jämvikt. För att bedöma antikroppen-antigen affinitet genom massa fotometri, tillämpa en droppe mikroskop nedsänkning olja till instrumentet objektiv och placera flödeskammaren på scenen i mikroskopet. Lägg till 10 mikroliter av filtrerad PBS till ena änden av flödeskammarens kanal.Bufferten kommer in i kanalen genom kapillär åtgärd. I fokuskontroll fliken för datainsamlingen programvara, använd grov scenen rörelse upp och ner knapparna för att göra de inledande justeringarna och klicka skärpa för att visa skärpan signal avläsning. Använd fin upp och ner justeringsknapparna för att maximera skärpan värde och klicka på set fokus och lås fokus för att aktivera funktionen fokus spårning.En bild av en ren bild bör ha ett signalvärde som är lika med eller under 0,05%Belastning 20 mikroliter av det första antikropp-antigenprovet som det visas, och blotting vätskan från den andra änden med en liten bit blottingpapper. Omedelbart vid inläsning, klicka på post för att förvärva lämpligt antal ramar motsvarar 100 sekunder av data. I slutet av datainsamlingsperioden anger du ett filnamn för data och klickar på OK, sedan exempel för att spara filen.Om du vill analysera massfotometridata öppnar du filen av intresse och klickar på Analysera. Klicka på belastning för att läsa in kalibreringsfunktionen och klicka på fil och spara resultat som för att spara de analyserade data. För att få de relativa koncentrationerna av varje art i provet, öppna de händelser som är ansett.CSV-fil, kopiera data i kolumn M i lämplig plottning och analys programvara, och använda plot statistik histogram funktion för att rita den molekylära massfördelningen. Dubbelklicka på histogrammet för att öppna fönstret med tomtegenskaper, inaktivera den automatiska binningen och välja en biningsstorlek på 2,5 kilodalton. Om du vill skapa lagerplatscentren och räknar data klickar du på Verkställ och gå.Om du vill passa histogrammet med Gaussiska funktioner markerar du bin-centren och räknar kolumner och klickar på analystopparna och baslinjens funktion för flera topppassningsmeny. Dubbelklicka för att ange de ungefärliga topppositionerna på fördelningsyten och klicka på öppna NL-passning. Kontrollera de fasta kryssrutorna för XC-toppcentren och ställ in deras värden på de förväntade molekylmassorna hos den fria antikroppen och de enkla och dubbla antigenantikroppskomplexen.Kontrollera aktiealternativet för breddparametrarna och klicka på passa. De monterade topphöjdsvärdena för de gaussiska komponenterna representerar den relativa koncentrationen av varje art i provet. Använd sedan ekvationen för att beräkna koncentrationsfraktionen för varje art från topphöjdsvärdena.Om du vill beräkna jämviktskonstanter med hjälp av ett kalkylprogram öppnar du dissociationskonstberäkningen. kalkylbladet XLSX. I det här kalkylbladet kan de gula markerade cellvärdena i raderna 1 till 10 ändras för att utföra equilibrium-konstantberäkningarna.Ange de uppskattade dissociationskonstantvärdena i nanomolarenheter i cellerna B1 och B2. Om de uppskattade konstantvärdena för dissociation inte är kända, lämnar du standardvärdena i cellerna B1 och B2 oförändrade. För in de totala antikroppskoncentrationerna och de totala antigenhalterna i nanomolarenheter i cellerna D2 och E2 och för in de beräknade fraktionsvärdena för varje art i cellerna F2, G2 och H2. När du utför global analys av titrering, lägga till lämpliga data fraktionsvärden i raderna 2 till 10. I fönstret för problemlösarparametrar väljer du cell B15 för rutan set objective och cellerna B1 till B2 för rutan genom att ändra variabelceller.Välj min-knappen för till alternativet och kontrollera göra okonslindade variabler icke-negativa checkbox, välj sedan GRG olinjär som lösningsmetod och klicka på lösa. De bästa inpassnings-dissociationskonstantvärdena kommer att visas i cellerna B1 och B2. Och den slutliga summan av de kvadratiska felen kommer att visas i cell B15. I detta representativa experiment utfördes en titreringsserie med anti-human trombinantikroppen vid en fast 25 nanomolarkoncentration och 0, 7,5, 15, 30, 60 och 120 nanomolar humana alfa-trombinkoncentrationer för att erhålla de molekylära massfördelningarna av antigen-antikroppsblandningarna och antikroppsprovet endast.Best fit peak höjd parametrar av de gaussiska komponenterna normaliserades för att få art koncentration fraktioner. Koncentrationsfraktionsvärdena var sedan vältränade globalt för att erhålla antigenbindningsbindningsaffiniteterna. De experimentella koncentrationsfraktionerna och de globala fitresultaten för det fria antikroppskomplexet, det enstaka antigenantikroppskomplexet och det dubbla antigenkomplexet kunde sedan ritas.För att få korrekta KD-värden måste proteinkoncentrationerna väljas noggrant för att befolka alla reaktionsarter. Vi rekommenderar att man förbereder en titreringsserie med hjälp av en rad antigenkoncentrationer. Efter att ha monterat datan kan felprojektionsmetoden användas för att erhålla passningsfelet, men det är bättre att upprepa experimentet och beräkna standardavvikelserna för de genomsnittliga bindningsaffinitetsvärdena.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Artbestämning och kvantifiering i blandningar Använda MRM masspektrometri av peptider som kött autentisering

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

En Rapid Laser Probing metod Underlättar Icke-invasiv och beröringsfri bestämning av Leaf Termiska egenskaper

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Fastställande av hög affinitet antikropp-antigenbindning Kinetics med fyra Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestämning av proteashämmare specificitet i mus vävnad extrakt av MALDI-TOF-masspektrometri: manipulera PH för att orsaka specificitet förändringar

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifiering av inositol fosfat eller fosfoinositid samverkande proteiner genom affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiverat tvärbunden Aguppstod för den snabba utvecklingen av affinitet Kromatografihartser-antikropps fångst som en fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...