Name: rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry
Uploaded: 2021-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Keir Neuman'a el yazını eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma NHLBI, NIH intramural programı tarafından desteklenmiştir.

1. Akış odalarını hazırlamak
<ol><li>Cam kapakları temizleyin<ol>
<li>Distile su, etanol ve izopropanol ile yıkama şişeleri kullanarak, aşağıdaki sırayla 24 mm x 50 mm kapakları durulayın: su, etanol, su, izopropanol, su. Kapakları temiz bir nitrojen akışı ile kurulayın. Örtüleri yukarıdan aşağıya doğru durulamak ve alt köşeyi yumuşak uçlu çelişlerle tutmak önemlidir. Coverslip'i, kirlenmenin çerterlerden akmasını önlemek için aynı yönde kurutun(Şekil 2A).<...

<ol>
	<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+antibody+directed+enzyme+prodrug+therapy+(ADEPT)+in+patients+with+advanced+colorectal+carcinoma+or+other+CEA+producing+tumours.">A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours.</a> British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).</li><li>van Dyck, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Amyloid-beta+Monoclonal+Antibodies+for+Alzheimer's+Disease:+Pitfalls+and+Promise.">Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise.</a> Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).</li><li>Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ramucirumab+in+the+treatment+of+cancer+-+A+review+of+literature.">Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature.</a> Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).</li><li>Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy:+past,+present+and+future.">Immunotherapy: past, present and future.</a> Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Rosenberg, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Analysis and Purification. , (2005).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+to+measure+the+binding+to+basic+proteins+by+surface+plasmon+resonance.">A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance.</a> Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).</li><li>Lofgren, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+assessing+clinical+immunogenicity+of+panitumumab.">Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li></ol>

Burada özetlenen Toplu Fotometri tabanlı protokol antijen-antikor bağlayıcı yakınlıkları ölçme hızlı ve doğru bir yöntem sağlar. MP analizi çok az miktarda malzeme kullanır ve stokiyometri, oliomerizasyon ve saflık da dahil olmak üzere ek bilgiler aynı verilerden değerlendirilebilir(Şekil 5). Modifikasyonlar olmadan, bu yöntem yaklaşık 5 nM ila 500 nM aralığındaki dissosilasyon sabitlerinin ölçümleri ve moleküler kütlesi yaklaşık 20 kDa veya daha büyük ol...

Antikorlar moleküler biyolojinin her yerde bulunan araçları haline gelmiştir ve hem tıbbi hem de araştırma uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Tıpta, onlar kritik tanı önemlidir, ama onların terapötik uygulamaları da genişletiyor ve yeni antikor tabanlı tedaviler sürekligeliştirilmektedir 1,2,3,4. Antikorların bilimsel uygulamaları arasında immünoresans5,immünopredikasyon6,akış sitometrisi7, ELISA ve batı lekelenme gibi birçok vazgeçilmez laboratuvar tekniği bulunmaktadır. Bu uygulamaların her biri için, bağlanma yakınlığı ve özgüllüğü de dahil olmak üzere antikor bağlayıcı özelliklerinin doğru ölçümlerinin alınması çok önemlidir.
İlk ticari yüzey plazmon rezonans (SPR) cihazı 1990 yılında tanıtıldı bu yana, optik biyosensörler antikor karakterizasyonu "altın standart" haline gelmiştir, ancak Diğer teknikler, ELISA dahil olmak üzere, aynı zamanda rutin antikor yakınlıkları ölçmek için kullanılır8,9. Bu yöntemler genellikle immobilizasyon veya potansiyel ilgi etkileşimi etkileyebilir analiz moleküllerinin etiketleme gerektirir. Sonuçlar veri analizi için toplanmadan önce birden çok tahlil adımı içeren nispeten yavaşlardır. Yakın zamanda geliştirilen tek moleküllü bir yöntem olan kütle fotometrisi (MP), mikroskop kapağının yüzeyine indiklerinde molekülleri doğrudan çözeltide algılar10,11. MP'nin kullandığı ışık saçılımı tabanlı optik algılama protein etiketlemeveya modifikasyon gerektirmez. Bireysel protein molekülleri, görüntüde görünen koyu noktalar olarak interferometrik saçılma mikroskobu tarafından kaydedilir(Şekil 1D), ve birkaç bin molekül bir dakikalık veri toplama sırasında tespit edilebilir12. Her bir parçacık tarafından oluşturulan sinyal ölçülür ve kontrast değeri (göreli karanlık) hesaplanır. İnterferometrik kontrast değerleri proteinlerin moleküler kütleleri ile orantılıdır, bu da antijen-antikor karışımındaki bağlı ve serbest türlerin tanımlanmasına olanak sağlar. Aynı zamanda, moleküler iniş olayları sayarak, MP doğrudan tür popülasyonları ölçer. Bu, MP tabanlı yöntemlere birden çok bağlama alanının benzerliklerini bağımsız olarak ölçmek için benzersiz bir yetenek sağlar.
Antijen(Ag)moleküllerinin bozulmamış antikor(Ab)iki bağlayıcı siteye bağlanması şu şekilde tanımlanabilir: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ01v2.jpg"> denge ilişkisi sabitleri K a1 ve Ka2 olarak tanımlanır: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ02v5.jpg"> ci ve fi bileşenininkonsantrasyonu ve fraksiyonu temsil nerede , sırasıyla. Toplam antijen konsantrasyonu (cAg)tot olarak ifade edilebilir: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61784/61784equ03v3.jpg">
Antikor(cAb)tot ve antijen(cAg)tot toplam konsantrasyonları bilindiğinden, bu denklem doğrudan MP ölçümleri elde edilen deneysel bileşen fraksiyonları sığdırmak ve denge ilişkilendirme sabitleri Ka1 ve Ka2 hesaplamak için kullanılabilir (Ek Bilgibakınız).
MP verileri ayrıca iki antikor bağlama siteleri11arasındaki işbirliği tahmin etmek için kullanılabilir. Aynı mikroskobik bağlama sabitlerine sahip iki antikor paratopiniçin Ab popülasyon sürecini açıklayan istatistiksel faktörler · Ag ve Ab· Ag2 kompleksleri görünür makroskopik denge sabitleri Ka1 ve Ka2 sayısal eşit olmaz ve Ka1 = 4Ka2dikte . Bu nedenle, Ka1 < 4Ka2'nin deneysel değerleri iki antikor bağlama alanı arasında pozitif cooperativity gösterir. Benzer şekilde, Ka1 > 4Ka2 negatif cooperativity gösterir.
Antijen-antikor bağlayıcı afinite MP ölçümleri hızlı ve malzeme küçük bir miktar gerektirir. Denge sabit hesaplamaları için kullanılan MP kütle dağılımları örnek özellikleri hakkında ek bilgi sağlar ve tek bir deneyde örnek saflığı, oliomerizasyon ve toplamanın değerlendirilmesini sağlar. Aynı yöntem yüksek afinite protein-protein bağlanmasını ölçmek için kullanılabilir ve MP özellikle çok valent protein etkileşimleri çalışmaları için yararlıdır. Çoklu protein kompleksleri genellikle büyük moleküler kitlelere sahiptir, MP tespiti için optimal, ve tek moleküllü veri stokiyometri ölçmek ve aynı anda birden fazla bağlama sitelerinin afinitelerini hesaplamak için kullanılabilir. Bu bilgileri genellikle toplu tabanlı yöntemler kullanarak elde etmek zordur.
Modifikasyonlar olmadan, mevcut protokol nispeten yüksek afinite, 20 kDa veya daha büyük bir moleküler kütle antijenleri ile alt mikromolar etkileşimleri ölçümleri için uygundur. Optimal sonuçlar için, protein stokları yüksek saflıkta olmalıdır, ancak belirli bir tampon gereksinimleri vardır. MP kullanılarak, antijen-antikor bağlama az beş dakika içinde değerlendirilebilir. Doğru Kd hesaplamaları için gerekli veri toplama ve analiz 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AcquireMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>AHT-5020</td>
			<td>RRID: AB_2864302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CTA10</td>
			<td>cotton optical swabs for lens cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1405-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiscoverMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>MP data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78080-CF</td>
			<td>soft-tipped forceps for coverslips handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human &#945;-thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MOIL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td>Mass Photometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>scientific graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>10x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGSR33SS</td>
			<td>buffer and sample filtering</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry

Antijen-antikor etkileşimlerinin özgüllüğü ve yakınlığının ölçüleri tıbbi ve araştırma uygulamaları için kritik öneme bağlıdır. Bu protokolde, bu amaçla yeni bir tek molekültekniği olan kütle fotometrisinin (MP) uygulanmasını açıklıyoruz. MP, moleküler kütleleri ve antikor ve antikor komplekslerinin popülasyonlarını tek moleküllü düzeyde algılayan ve ölçen etiket ve hareketsiz bir tekniktir. MP birkaç dakika içinde antijen-antikor örneğini analiz eder, bağlayıcı afinite kesin belirlenmesi için izin ve aynı anda stokiyometri ve proteinlerin oligomerik durumu hakkında bilgi sağlayan. Bu protein ve hiçbir pahalı sarf malzemeleri sadece pikomol miktarları gerektiren basit ve basit bir tekniktir. Aynı prosedür, moleküler kütlesi 50 kDa'dan büyük olan proteinler için protein-protein bağlanmasını incelemek için de kullanılabilir. Çok valent protein etkileşimleri için, birden fazla bağlama sitelerinin yakınlıkları tek bir ölçümde elde edilebilir. Ancak, tek moleküllü ölçüm modu ve etiketleme eksikliği bazı deneysel sınırlamalar getirir. Bu yöntem, alt mikromolar etkileşim yakınlıklarının, moleküler kütleli 20 kDa veya daha büyük antijenlerin ve nispeten saf protein örneklerinin ölçümlerine uygulandığında en iyi sonuçları verir. Ayrıca, temel veri analizi yazılımını kullanarak gerekli montaj ve hesaplama adımlarını gerçekleştirme prosedürünü de açıklarız.

Daha önce insan α trombin (HT) ve fare monoklonal anti-insan antimbin antikor (AHT) MP tabanlı test11kullanarak etkileşiminceledik. HT'nin moleküler kütlesi (37 kDa) 40 kDa algılama limitinin altında olduğundan, maksimum numune konsantrasyonu kütle dağılımlarının çözünürlüğünü olumsuz etkilemeden 50 nM MP konsantrasyon sınırlamasını aşabilir. Deney, SABIT 25 nM konsantrasyonda AHT antikorlu titrasyon serisi ve 7.5 nM, 15 nM, 30 nM, 60 nM ve 120 nM konsantrasyonlarda HT ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry at JoVE.com

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Biz kitle fotometri (MP) kullanarak antijen-antikor afinite ölçümleri için tek moleküllü bir yaklaşım açıklar. MP tabanlı protokol hızlı, doğru, malzeme çok az miktarda kullanır ve protein modifikasyonu gerektirmez.

Kitle Fotometrisi ile Antikor-Antijen Affinitesinin Hızlı Tayini

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Antikorlar rutin olarak laboratuvar tekniklerinde kullanılır ve tedavi ve tanı uygulamaları hızla genişlemektedir. Hızlı ve doğru antijen-antikor bağlama karakterizasyonu bu uygulamalar için kritik öneme yöneliktir. Kitle fotometrisi, son derece az miktarda malzeme kullanarak bağlayıcı yakınlıkları hızla ölçer.Etiketleme veya immobilizasyon gerekmez ve aynı deneyden protein oliomerizasyonu ve saflığı hakkında bilgi elde edilebilir. Bu protokol sadece antikorları incelemek için değil, aynı zamanda 50 kilodaltondan daha büyük moleküler kütlesi olan proteinler için güçlü protein-protein bağlarını ölçmek için de kullanılabilir. Yumuşak uçlu forceps kullanarak başlayın ve sırayla damıtılmış su, etanol, distile su, izopropanol ve distile su ile yukarıdan aşağıya 24 tarafından 50 milimetre kapakları durulayın şişeleri yıkayın.Son yıkamadan sonra, coverplardan kontaminasyonakmasını önlemek için kapakları aynı yönde temiz bir azot akışı ile kurulayın. 24 by 24 milimetrelik kapakları, gösterildiği gibi distile su ve etanol ile durulayın ve ardından temiz bir azot akışı ile kurutun. Kuruduktan sonra, alüminyum folyo bir parça üzerine 24 tarafından 24 milimetrelik coverslip yerleştirin ve coverslip üzerine çift taraflı bant şeritler yerleştirin.Daha sonra 24'ü folyodan 24 milimetrelik kapak kesip 24'ün 50 milimetrelik kapak lının çalışma tarafına hafifçe bastırın. Afinite ölçümleri için antikor-antijen örnekleri hazırlamak için, toz partiküllerini ve agregalarını temizlemek için 0,22 mikron luk şırınga filtresinden en az iki mililitre PBS filtre uygulayın ve antikor ve antijen stoklarını santrifüj edin. Gerçek konsantrasyonlarını belirlemek için antikor ve antijen stoklarının 280 nanometre UV emiciliğini ölçün ve numune başına 50 mikrolitrelik son hacimde uygun antijen konsantrasyonları aralığında antikor-antijen karışımları bir titrasyon serisi hazırlayın.Daha sonra antijen-antikor karışımlarını oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika kuluçkaya yatırarak bağlayıcı reaksiyonun kimyasal dengeye ulaşmasını sağlar. Antikor-antijen afinitesini kitle fotometrisi ile değerlendirmek için, alet hedefine bir damla mikroskop daldırma yağı uygulayın ve akış odasını mikroskop aşamasına yerleştirin. Akış odası kanalının bir ucuna 10 mikrolitre filtrelenmiş PBS ekleyin.Arabellek kapiller eylem ile kanala girer. Veri toplama yazılımının odak denetim sekmesinde, ilk ayarlamaları yapmak için kaba sahne hareketini yukarı ve aşağı düğmelerini kullanın ve netlik sinyali okumasını görüntülemek için netliği tıklatın. Netlik değerini en üst düzeye çıkarmak için ince yukarı ve aşağı ayarlama düğmelerini kullanın ve odak izleme işlevini etkinleştirmek için odak ve kilit odağı'nı tıklatın.Temiz bir slayt görüntüsü, gösterildiği gibi ilk antikor-antijen örneğinin %0,05'ine eşit veya altında bir sinyal değerine sahip olmalıdır ve sıvıyı küçük bir parça leke kağıdıyla diğer uçtan blotlamalıdır. Yüklemeden hemen sonra, 100 saniyelik verilere eşdeğer uygun kare sayısını elde etmek için kaydı tıklatın. Veri toplama döneminin sonunda, veriler için bir dosya adı girin ve Tamam'ı tıklatın, ardından dosyayı kaydetmek için örnek alın.Kitle fotometri verilerini analiz etmek için ilgi dosyasını açın ve analiz et'i tıklatın. Kalibrasyon işlevini yüklemek için yükle'yi tıklatın ve analiz edilen verileri kaydetmek için dosyayı tıklatın ve sonuçları kaydedin. Örnekteki her türün göreceli konsantrasyonlarını elde etmek için, uygun olayları açın.csv dosyası, uygun çizim ve analiz yazılımı içine Sütun M verileri kopyalamak ve moleküler kütle dağılımı arsa için çizim istatistikleri histogram fonksiyonu kullanın. Çizim özellikleri penceresini açmak, otomatik binning'i devre dışı bırakıp 2,5 kilodalton büyüklüğünde bir depo gözü seçmek için histograma çift tıklayın. Veri kutusu merkezlerini oluşturmak ve verileri saymak için uygula ve git'i tıklatın.Histogramı Gaussian işlevlerine sığdırmak için, depo gözü merkezlerini ve sütunları sayar ve analiz zirvelerini ve taban çizgisi çoklu tepe sığması menü işlevini tıklatın. Dağıtım çizimindeki yaklaşık tepe konumlarını belirtmek için çift tıklatın ve NL sığmasını açın'ı tıklatın. XC tepe merkezleri için sabit onay kutularını kontrol edin ve değerlerini serbest antikor ve tek ve çift antijen-antikor komplekslerinin beklenen moleküler kütlelerine ayarlayın.Genişlik parametreleri için paylaşım seçeneğini işaretleyin ve sığdır'ı tıklatın. Gaussian bileşenlerinin donatılmış tepe yükseklik değerleri, numunedeki her türün göreceli konsantrasyonunu temsil eder. Sonra en yüksek yükseklik değerlerinden her türün konsantrasyon fraksiyonu hesaplamak için denklemi kullanın.Elektronik tablolama programı kullanarak denge sabitlerini hesaplamak için dissociation constant calculation'ı açın. xlsx çalışma sayfası. Bu çalışma sayfasında, 1 ile 10 arasındaki satırlarda sarı vurgulanan hücre değerleri denge sabithesaplamaları gerçekleştirmek için değiştirilebilir.Nanomolar birimlerdeki tahmini dissosiasyon sabit değerlerini B1 ve B2 hücrelerine girin. Tahmini ayrışma sabit değerleri bilinmiyorsa, B1 ve B2 hücrelerindeki varsayılan değerleri değişmeden bırakın. Nanomolar birimlerdeki toplam antikor ve toplam antijen konsantrasyonlarını D2 ve E2 hücrelerine girin ve her tür için hesaplanan kesir değerlerini F2, G2 ve H2 hücrelerine girin. Titrasyonun genel analizini gerçekleştirirken, uygun veri fraksiyonu değerlerini 2 ile 10 satır arasında ekleyin. Çözücü parametreleri penceresinde, değişken hücre kutusunu değiştirerek ayarlanan hedef kutusu için B15 hücresini ve B1'den B2'ye kadar olan hücreleri seçin.Seçeneği için min düğmesini seçin ve negatif olmayan denetim kutusu ile sınırlandırılmamış değişkenleri yapınseçeneğini işaretleyin, ardından çözme yöntemi olarak GRG doğrusal olmayanı seçin ve çöz'e tıklayın. En uygun dissosyasyon sabit değerleri B1 ve B2 hücrelerinde gösterilir. Ve kare hataların son toplamı B15 hücresinde gösterilir. Bu temsili deneyde, antijen-antikor karışımlarının moleküler kütle dağılımlarını ve sadece antikor örneğini elde etmek için sabit 25 nanomolar konsantrasyonve 0, 7.5, 15, 30, 60 ve 120 nanomolar insan alfa-trombin konsantrasyonlarında anti-insan trombin antikor içeren bir titrasyon serisi yapılmıştır.Gaussian bileşenlerinin en uygun tepe yükseklik parametreleri tür konsantrasyon fraksiyonları elde etmek için normalleştirildi. Konsantrasyon fraksiyonu değerleri daha sonra antijen-antikor bağlayıcı afiyetleri elde etmek için küresel olarak uygun edildi. Deneysel konsantrasyon fraksiyonları ve serbest antikor için küresel uyum sonuçları, tek antijen-antikor kompleksi, ve çift antijen kompleksi daha sonra çizilmiş olabilir.Doğru KD değerlerini elde etmek için, protein konsantrasyonlarının tüm reaksiyon türlerini doldurmak için dikkatle seçilmesi gerekir. Bir dizi antijen konsantrasyonu kullanarak bir titrasyon serisi hazırlamanızı öneririz. Verileri donatttan sonra, hata yansıtma yöntemi montaj hatası elde etmek için kullanılabilir, ancak denemeyi yinelemek ve ortalama bağlama afinite değerlerinin standart sapmalarını hesaplamak daha iyidir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Et kimlik doğrulaması için peptidler Uygulanan MRM Kütle Spektrometresi kullanarak karışımlar türlerin belirlenmesi ve miktar tayini

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Bir Rapid Lazer Yöntemi Yaprak Termal Özelliklerinin non-invazif ve İletişim serbest Tayini kolaylaştırır Probing

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...