Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

نعترف بمشروع MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)، #34_IITB المشروع إلى مرفق SS و MASSFIITB في IIT Bombay بدعم من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR13114/INF/22/206/2015) لإجراء جميع التجارب المتعلقة بالتصلب المتعدد.

وقد استعرضت هذه الدراسة ووافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية ولجنة الأخلاقيات التابعة للمعهد الهندي للتكنولوجيا بومباي (IITB-IEC/2016/026). قدم المرضى / المشاركون موافقتهم الخطية للمشاركة في هذه الدراسة.
1. إعداد lysate الأنسجة
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التال?...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

بروتيوم الأنسجة من العينات البيولوجية تمكننا من استكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة الجديدة المرتبطة بمراحل مختلفة من تطور المرض. كما يشرح آلية الإشارات والمسارات المرتبطة بتطور المرض. يوفر البروتوكول الموصوف لتحليل البروتيوم الكمي للأنسجة بيانات تغطية جيدة قابلة للاستنساخ. وقد تم تكيي?...

تقنيات البروتيوميات لديها القدرة على تمكين تحديد وتحديد كمي من علامات المرشح المحتملة التي يمكن أن تساعد في الكشف عن المرضوتكهناته 1. وقد عجلت التطورات الأخيرة في مجال قياس الطيف الكتلي البحوث السريرية على مستوى البروتين. يحاول الباحثون التصدي لتحدي علم الأحياء المرضية المعقد للعديد من الأمراض باستخدام البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي ، والتي توفر الآن حساسية متزايدة لتحديد البروتين وتحديد كميته2. قياس دقيق كمي للبروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم التعاون الديناميكي والمكاني بين البروتينات في الأفراد الأصحاء والمرضى3; ومع ذلك ، فإن مثل هذا التحليل على نطاق واسع البروتيوم ليس سهلا.
أحد القيود الرئيسية للتنميط البروتيني للعينات السريرية هو تعقيد العينات البيولوجية. وقد تم التحقيق في العديد من أنواع مختلفة من العينات لدراسة البروتيوم المرض، مثل خطوط الخلايا والبلازما والأنسجة4،5. وتستخدم خطوط الخلايا على نطاق واسع كنماذج في التجارب المختبرية لمحاكاة مراحل مختلفة من تطور المرض. ومع ذلك, أحد القيود الرئيسية مع خطوط الخلية هو أنها تكتسب بسهولة genotypic والتغيرات phenotypic أثناء عملية زراعة الخلايا6. يمكن أن تكون سوائل الجسم مثل البلازما مصدرا جذابا لاكتشاف العلامات الحيوية؛ ومع ذلك ، نظرا للبروتينات وفيرة للغاية ومجموعة ديناميكية من تركيز البروتين ، البلازما بروتيوميات قليلا أكثر تحديا7. هنا، الببتيدات نشأت من البروتينات الأكثر وفرة يمكن قمع تلك المستمدة من البروتينات وفيرة منخفضة حتى لو كانت نسبة الكتلة / تهمة هو نفسه6. على الرغم من أن هناك تقدما في تقنيات الاستنفاد والتفكك في السنوات القليلة الماضية ، والحصول على تغطية جيدة لا يزال قيدا رئيسيا من بروتيوم البلازما8،9. ويفضل استخدام الأنسجة للتحقيق proteomic من بيولوجيا المرض وعينات الأنسجة هي الأكثر قريبة من مواقع المرض وتقديم معلومات فسيولوجية ومرضية عالية لتوفير رؤى أفضل في بيولوجيا المرض10،11.
في هذه المخطوطة، قدمنا بروتوكولا مبسطا لعلم البروتينات الكمي لعينات الأنسجة. لقد استخدمنا عازلة تحتوي على 8 M اليوريا لإعداد الأنسجة lysate كما هذا العازلة متوافقة مع التحقيقات القائمة على قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك ، فإنه إلزامي لتنظيف الببتيدات لإزالة الأملاح قبل حقنها في مطياف الكتلة. نقطة واحدة مهمة أن نتذكر هو تقليل تركيز اليوريا إلى أقل من 1 M قبل إضافة التريبسين لهضم البروتين كما يظهر تريبسين نشاط منخفض في تركيز اليوريا 8 M. لقد شرحنا نهجين من البروتيات العالمية الكمية: القياس الكمي القائم على التسمية باستخدام iTRAQ (علامات إيسوباك للقياس الكمي النسبي والمطلق) والتحديد الكمي الخالي من الملصقات (LFQ). يستخدم البروتيوم الكمي القائم على iTRAQ بشكل رئيسي لمقارنة عينات متعددة تختلف في حالتها البيولوجية (على سبيل المثال ، طبيعي مقابل المرض أو عينات المعالجة). يستخدم هذا النهج الكواشف الإسوباريك لتسمية الأمينات الأولية N-المحطة من الببتيدات12. تحتوي كاشفات iTRAQ على مجموعة مراسل N-methyl piperazine ، ومجموعة موازنة ، ومجموعة إستر N-hydroxy succinimide التي تتفاعل مع الأمينات الأولية N-terminal من الببتيدات13. يتم تسمية الببتيدات المهضومة من كل حالة مع كاشف iTRAQ معين. بعد وضع العلامات ، يتم إيقاف رد الفعل ويتم تجميع الببتيدات المسماة من ظروف مختلفة في أنبوب واحد. يتم تحليل خليط العينة المشترك هذا بواسطة مطياف الكتلة لتحديده وتحديد كمي. بعد تحليل MS / MS ، يتم إنشاء شظايا أيون المراسل ذات الكتل الجزيئية المنخفضة وتستخدم كثافة أيونات المراسل هذه للقياس الكمي للبروتينات.
وثمة نهج آخر، وهو القياس الكمي الخالي من الملصقات، يستخدم لتحديد العدد النسبي للبروتينات في العينات المعقدة دون وضع علامات على الببتيدات ذات النظائر المستقرة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

وقد أدت التطورات الأخيرة في قياس الطيف الكتلي إلى تحليل بروتيومي عميق إلى جانب توليد مجموعات بيانات قوية وقابلة للاستنساخ. ومع ذلك ، على الرغم من التقدم التقني الكبير ، فإن إعداد العينة من البكبيمنات الحيوية مثل دم المريض ، CSF ، والأنسجة لا يزال يشكل تحديات كبيرة. لتحديد المؤشرات الحيوية، غالبا ما يوفر بروتيوم الأنسجة مصدر عينة جذاب لترجمة نتائج البحث من مقاعد البدلاء إلى العيادة. يمكن أن تكشف عن المؤشرات الحيوية المرشح المحتملة للتشخيص المبكر للسرطان والأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر، ومرض باركنسون، الخ. تنتج بروتينات الأنسجة أيضا ثروة من المعلومات النظامية استنادا إلى وفرة البروتينات وتساعد على معالجة الأسئلة البيولوجية المثيرة للاهتمام.
يمكن تجميع التحليل الكمي للبروتيوميات في فئتين واسعتين: نهج قائم على التسمية ونهج خال من التسميات. في النهج القائم على التسمية، يتم تسمية البروتينات أو الببتيدات باستخدام نظائر مستقرة مثل SILAC (وضع علامات النظائر المستقرة مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا) أو عن طريق العلامات الكيميائية مثل ICAT (علامات التقارب المرمزة بالنظائر)، TMT (علامة الكتلة جنبا إلى جنب) أو iTRAQ (علامة النظائر للكمية النسبية والمطلقة). النهج القائمة على التسمية لديها ميزة كمية أكثر دقة من البروتينات واستخدام تسميات isobaric، يمكن تحليل عينات متعددة في تجربة واحدة. ويوفر النهج الخالي من الملصقات بديلا فعالا من حيث التكلفة للنهج القائمة على الملصقات. يمكن تحليل مئات عينات المرضى المنتمين إلى مجموعة معينة ومقارنتها بالأفواج الأخرى استنادا إلى الميزات السريرية. هنا ، وصفنا سير عمل البروتيوم الكمي الأمثل لعينات الأنسجة باستخدام طرق التنميط البروتيوم الخالية من الملصقات والقائمة على التسمية ، وهو أمر بالغ الأهمية للتطبيقات في علوم الحياة ، وخاصة المشاريع القائمة على اكتشاف العلامات الحيوية.

لقد استخدمنا نهجين مختلفين لاكتشاف بروتيوميات: نهج البروتيوميات الخالية من الملصقات والقائمة على التسمية. وأظهرت ملامح البروتين من عينات الأنسجة على SDS-PAGE البروتينات سليمة ويمكن النظر للتحليل بروتيوميك(الشكل 2A). مراقبة الجودة فحص الصك تم رصدها عن طريق نظام ملاءمة ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

يوفر البروتوكول الموصوف تحليلا كميا محسنا لعينات الأنسجة باستخدام نهجين: الكمية الخالية من التسميات والملصقات. وتستند النهج القائمة على التسمية إلى ميزة كمية أكثر دقة من البروتينات، في حين أن النهج الخالي من الملصقات أكثر فعالية من حيث التكلفة ويستخدم لتحليل مئات العينات من الفوج.

سير عمل شامل من Mass Spectrometry القائم على بروتيوميات بندقية من عينات الأنسجة

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

القياسات الكمية الدقيقة للبروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم التعاون الديناميكي والمكاني بين البروتينات لفهم المرض مرة أخرى إلى علم الأحياء. والهدف العام لهذه التجربة هو توفير سير عمل بروتيومي كمي متكامل لعينات الأنسجة، يجمع بين التنميط البروتيني الخالي من الملصقات والقائم على التسمية لاكتشاف العلامات الحيوية. في هذه الدراسة، استخدمنا أداة Orbitrap Fusion لتحديد البروتينات باستخدام نهج قائمة على التسمية وخالية من التسمية.تحلل الأنسجة هو واحد من أهم الخطوات لنجاح تجربة LC-MS-MS. تأخذ 30 ملغ من الأنسجة في أنبوب حبة الضرب. بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني، إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل اليوريا التي تحتوي على ثمانية اليوريا الضرس، تريس، NaCl وMgCl2.باستخدام سونيكاتور التحقيق، lyse محتويات الأنسجة. كرر هذا لدورة أخرى. إذا لاحظت أي نسيج سليم في الجزء السفلي من الأنبوب ، فأضف حبات الزركونيوم إلى الأنبوب وتجانس الأنسجة باستخدام مضرب حبة لمدة 90 ثانية ، مع حضانة لمدة خمس دقائق على الجليد.طرد مركزي العينات حول 6000 G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية لفصل حطام الخلية من supernatant. جمع supernatant في أنبوب جديد وخلط الحل بشكل موحد. تحديد تركيز البروتين في الأنسجة lysate باستخدام كاشف برادفورد.لهذا، قياس OD من العينة في 595 نانومتر واستقراء باستخدام الرسم البياني القياسية كما هو مبين على هذه الشاشة. بعد تحديد كمية البروتين، قم بتشغيل 10 ميكروغرام من lysate الأنسجة على هلام 12٪ SDS-PAGE للتحقق من جودة اللسات. الخطوة الأولى في عملية الهضم في حل ينطوي على الحد من السندات ثنائي الكبريتيد، وذلك باستخدام TCEP.بعد إضافة TCEP، احتضان محتويات الأنبوب لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. وينطوي الخطوة التالية على الألكيل لمنع إعادة تشكيل سندات ثاني كبريتيد مخفضة. إضافة عامل الألكيل مثل iodoacetamide واحتضان الأنبوب في الظلام لمدة 10 دقائق.بعد الحضانة ، خفض التركيز النهائي لليوريا إلى أقل من ضرس واحد عن طريق التخفيف مع أربعة إلى ثمانية مجلدات من العازلة المخفف. عند هذه النقطة، فإنه من المستحسن للتحقق من درجة الحموضة. الخطوة التالية تنطوي على إضافة التريبسين إلى الأنبوب، واحتضان الأنبوب بين عشية وضحاها لعملية الهضم الفعالة.في اليوم التالي، وتجفيف الببتيدات المهضومة في تركيز فراغ، والمضي قدما لخطوة تحلية. لأداء تحلية الببتيدات، استخدم نصائح المرحلة C18. تنشيط تلميح المرحلة C18 بإضافة 50 ميكرولتر من الميثانول، والطرد المركزي تلميح في 1000 G لمدة دقيقتين.الآن, إضافة 50 ميكرولتر من أسيتونيتريل في 0.1٪ حمض الفورميك لغسل طرف المرحلة, ومرة أخرى, الطرد المركزي غيض. إعادة تشكيل الببتيدات المجففة المهضومة في 50 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪. إضافة الببتيدات المعاد تشكيلها في تلميح المرحلة المنشطة.كرر هذه الخطوة أربع مرات على الأقل. لغسل العينة، أضف 50 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1٪، وكرر خطوة الطرد المركزي. ل elution من الببتيدات، إضافة 50 ميكرولتر من 40٪ ACN في حمض الفورميك 0.1٪، وتمريره من خلال تلميح المرحلة عن طريق الطرد المركزي.كرر هذه الخطوة مع 50٪ و 60٪ ACN في حمض الفورميك 0.1٪وجمع filtrate في أنبوب جديد. جفف الببتيدات المجففة باستخدام مكثف فراغ. قبل تشغيل LC-MS-MS، قم بقياس الببتيدات باستخدام طريقة Scopes.لهذا، تحميل اثنين من ميكرولتر من عينة المعاد تشكيلها في بئر لوحة ميكرودروب، وقياس الامتصاص في 205 نانومتر و 280 نانومتر. حساب التركيز من الصيغة الموضحة على هذه الشريحة. بمجرد تجفيف الببتيدات المجففة ، فهي جاهزة للقياس الكمي القائم على التسمية.بالنسبة لعلامات iTRAQ ، يجب إعادة تشكيل الببتيدات المجففة في 20 ميكرولتر من العازلة للحل ، المقدمة في مجموعة وضع العلامات iTRAQ. إعادة تشكيل التسميات عن طريق إضافة الإيثانول من القارورة المقدمة في عدة، وتخلط جيدا. من المستحسن أن يتم تنفيذ جميع الخطوات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.أضف ملصقات iTRAQ المختلطة بشكل متجانس إلى أنابيبها الخاصة بها والسماح لتفاعل وضع العلامات بالانخاض. في نهاية رد الفعل، أطفئ أي ملصق غير مقيد زائد في الأنبوب عن طريق إضافة ماء من درجة MS، واحتضانه لمدة نصف ساعة إلى ساعة واحدة. الآن، نقل جميع المحتويات المسماة في أنبوب واحد وتجفيف الببتيدات المسمى.بعد إعادة تشكيل العينات في حمض الفورميك 0.1٪، افتح الاختام التلقائي ل NanoLC، ووضع العينات داخل autosampler. بمجرد وضع العينات في الاختام التلقائي ، من المهم تعيين المعلمات الصحيحة للكروماتوغرافيا السائلة وقياس الطيف الكتلي. هنا، نقوم بوصف معلمات كل من الكمية الخالية من التسمية والتحديد الكمي القائم على iTRAQ باستخدام LC-MS.في حالة الكمية الخالية من التسمية، تم استخدام تدرج لمدة 120 دقيقة كعينة واحدة غير مكسرة يتم حقنها. يمكن زيادة هذه المدة أو تقليلها استنادا إلى تعقيد العينة. في هذه التجربة، تم تعيين تدفق 300 نانولتر في الدقيقة الواحدة مع التدرج التالي للحل B، وهو 80٪ أسيتونيتريل في حمض الفورميك 1٪، في هذه الحالة.وبنفس الطريقة، يمكننا تعيين تدرج لتجربة iTRAQ. وبما أن العينات غير مكسرة، فقد استخدم تدرج مدته 90 دقيقة. يمكن رؤية معلمات MS لكل من القياس الكمي الخالي من التسمية ، وكذلك القياس الكمي القائم على تسمية iTRAQ ، هنا.تتضمن الخطوة الأولى إعداد وضع التطبيق بالنقر فوق المعلمات العمومية. حدد وضع الببتيد، وحدد مدة الأسلوب وفقا لتدرج LC المستخدم. حدد معلمات المسح الضوئي للتجربة.عند النقر فوق الخيار MS-OT المعلمات تصبح مرئية. يتم تعيين نوع الكاشف قيد الاستخدام إلى Orbitrap. الخيار الآخر المتاح على هذا الصك يتضمن فخ أيون.تم تعيين الدقة إلى 60,000، ويمكن للمرء الاختيار بين الخيارات المختلفة المتاحة، اعتمادا على الحاجة ونوع التجربة. نطاق الكتلة طبيعي، ويتم تعيين نطاق المسح الضوئي من 375 إلى 1700. المعلمات الأخرى افتراضية لتطبيق MS.تم تعيين عتبة الكثافة، وتعيين حالة الشحن في نطاق من اثنين إلى ستة. تم تعيين الاستبعاد الديناميكي إلى 40 ثانية ، وتم الاحتفاظ بالتسامح الجماعي إلى 10. تتضمن المجموعة التالية من المعلمات المعلمات MS-MS.تم تحديد وضع العزل مع رباعية، نافذة العزل تعيين في اثنين، تم تعيين إزاحة العزل إلى إيقاف، ونوع التنشيط عادة ما يكون HCD لتجربة بروتيوميكس. يمكن إما إصلاح طاقة الاصطدام ، أو يمكن مساعدتها. تتطلب العينات الموسومة طاقات تصادم أعلى ، وبالتالي ، بالنسبة لتجارب iTRAQ ، من المستحسن تعيين طاقة الاصطدام إلى 35 ، في حين أنه بالنسبة لتجارب LFQ ، يمكن تعيينها إلى 30.نوع الكاشف المستخدم هنا هو أوربيراب. سيكون وضع نطاق المسح الضوئي تلقائيا. المعلمات الأخرى افتراضية لتجارب iTRAQ وتجربة كمية خالية من التسميات.سيؤدي النقر على الملخص إلى تقديم نظرة عامة على جميع معلمات LC وMS المستخدمة في التجربة. يمكنك إلقاء نظرة على كل معلمة والقيام التدقيق اللغوي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ثم انقر على الملف وحفظه كملف الأسلوب.بمجرد حفظ، ثم يمكنك تشغيل الأسلوب، وسوف تحصل على الملفات الخام. وبعد ذلك يمكن تحليل تلك الملفات الخام باستخدام برنامج Proteome Discoverer. يظهر هذا الرقم تغطية تسلسل BSA في ثلاث نسخ متماثلة تقنية ، وهي 91٪ في النسخ المتماثلة الثلاثة.وهذا يشير إلى إمكانية استنساخ الصك. الآن، يظهر هذا الرقم التوحيد في عدد المباريات الطيفية الببتيد، والببتيدات، والبروتينات التي تم تحديدها في ثلاث عينات بيولوجية مختلفة، والتي، مرة أخرى، يعطي فكرة عن استنساخ الصك. هنا، يمثل الرسم البياني Venn البروتينات الشائعة والحصرية التي تم تحديدها في ثلاث عينات مختلفة في تجربة خالية من الملصقات والتجربة القائمة على التسمية.تظهر هذه الرسوم البيانية الشريطية عدد المطابقات الطيفية للببتيد ومجموعات الببتيد ومجموع البروتينات ومجموعات البروتين وعدد البروتين بعد 1٪ FDR ، المحدد في تجربة LFQ و iTRAQ. بروتيوم الأنسجة من العينات البيولوجية تمكننا من استكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة الجديدة المرتبطة بمراحل مختلفة من تطور المرض. يوفر البروتوكول الموصوف للتحليل البروتي الكمي للأنسجة بيانات تغطية جيدة قابلة للاستنساخ.ويضمن استخدام النسخ المتماثلة التقنية إمكانية استنساخ جيدة، حتى لو تم تشغيل العينات في نقاط زمنية مختلفة. هنا ، أظهرنا تحليل عينات الأنسجة باستخدام طريقتين للكمية: البروتيوم الخالي من التسمية والقائم على التسمية. قد يعتمد اختيار التقنيات البروتيوميكية الكمية على عدد العينات وتوافر منصات MS والسؤال البيولوجي الذي سيتم تناوله.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

إعداد نموذج البروتين من الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من نسيج

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

أنثرالين كما مصفوفة لمصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين التصوير على تحويل فورييه ايون السيكلوترون الرنين مطياف الكتلة

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

من أسفل إلى أعلى وبندقية البروتيوميات من التعرف على القوقعة بروتيوم الشامل

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

التقاط الطيف الكتلي - أداة قوية لتحديد رواية ج-دي-GMP المستجيب البروتينات

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

غير الأنزيمية، خالية من مصل زراعة الأنسجة من آفات الثدي ما قبل الغازية لتوليد عفوية من Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

سير عمل شامل للتعرف على نطاق الجينوم والتحليل التلوي التعبير الأسرة الجينات ATL E3 Ubiquitin ليجاسى في الكرمة

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...