Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
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我们承认MHRD-UAY项目（UCHHATAR AVISHKAR YOJANA），该项目#34_IITB在生物技术部的支持下，在孟买国际信息技术研究所（BT/PR13114/INF/206/206/2015）进行所有MS相关实验。

这项研究得到了孟买印度理工学院（IITB-IEC/2016/026）机构审查委员会和道德委员会的审查和批准。患者/参与者表示书面同意参加本研究。
1. 组织解解剂制备
注意：在冰上执行以下所有步骤，以保持蛋白酶处于非活动状态。确保手术刀和使用的任何管子是无菌的，以避免任何交叉污染。
<ol><li>在珠子跳动管中加入 +30 毫克组织，加入 200 微升 ...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

生物样本的组织蛋白解学使我们能够探索与疾病进展的不同阶段相关的新的潜在生物标志物。它还解释了信号和与疾病进展相关的通路机制。所述的组织定量蛋白学分析协议提供了可重复的良好覆盖数据。大部分步骤都根据制造商的说明进行了调整。为了获得高质量的数据，以下步骤最为关键。因此，在执行这些步骤时应给予额外的注意。
蛋白质的不完全消化和角蛋白的污?...

蛋白造物学技术具有潜力，能够识别和量化潜在的候选标记，可以帮助检测和预测疾病1。质谱学领域的最新进展加速了蛋白质水平的临床研究。研究人员正试图利用质谱学蛋白质组学来应对多种疾病复杂病理生物学的挑战，这些蛋白质组学现在提高了蛋白质识别和定量2的灵敏度。蛋白质的精确定量测量对于理解健康人和患病个体蛋白质之间的动态和空间合作至关重要。然而，这种对蛋白质组范围的分析并不容易。
临床标本的蛋白体分析的一个主要局限性是生物样本的复杂性。研究了许多不同类型的样本来研究这种疾病的蛋白质组，如细胞系、血浆和组织4，5。细胞系被广泛用作体外实验的模型，以模拟疾病进展的不同阶段。然而，细胞系的一个主要局限性是，它们很容易在细胞培养过程中获得基因型和表型变化。体液，如血浆，可能是生物标志物发现的吸引力来源;然而，由于蛋白质高度丰富和蛋白质浓度的动态范围，血浆蛋白质解质学是有点更具挑战性的7。在这里，肽源自最丰富的蛋白质可以抑制那些从低富含蛋白质，即使质量/电荷比是相同的6。虽然在过去几年中，在耗竭和分馏技术方面取得了进步，但获得良好的覆盖范围仍然是等离子体蛋白学8、9的主要限制。更倾向于使用组织进行疾病生物学的蛋白体研究，因为组织样本与疾病部位最接近，并提供高生理和病理信息，以便更好地了解疾病生物学10，11。
在这份手稿中，我们为组织样本的定量蛋白学提供了简化的协议。我们使用了含有8M尿素的缓冲器进行组织解质制备，因为该缓冲器与基于质谱的调查相容。但是，在将盐注入质谱仪之前，必须清洁肽以去除盐分。需要记住的一个重要点是将尿素浓度降低到1米以下，然后加入蛋白消化的试丁二辛，因为试丁二酯在8M尿素浓度下表现出低活性。我们解释了两种定量全球定性定性学方法：使用 iTRAQ（用于相对和绝对量化的同质标记）和无标签量化 （LFQ） 进行基于标签的量化。基于 iTRAQ 的定量蛋白术主要用于比较多种生物条件不同的样本（例如，正常与疾病或经过处理的样本）。该方法利用异位试剂标记肽12的N终端原胺。iTRAQ试剂含有一个N-甲基管道拉齐辛记者组，一个平衡组，和一个N-羟基苏奇尼米德酯组，与肽13的N终端初级胺反应。从每个条件中消化的肽都标有特定的 iTRAQ 试剂。标记后，停止反应，将不同条件下的多肽标记为单管。这种组合样品混合物通过质谱仪进行分析，以进行识别和量化。经过MS/MS分析，生成分子质量低的记者离子片段，并利用这些记者离子的离子强度进行蛋白质的定量。
另一种方法是，无标签量化用于确定复杂样品中蛋白质的相对数量，而无需用稳定的同位素标记肽。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

质谱学的最新进展导致深度蛋白石分析以及可生成的可靠和可重复的数据集的生成。然而，尽管技术取得了相当大的进步，但来自生物物种（如患者血液、CSF 和组织）的样品制备仍构成相当大的挑战。为了识别生物标志物，组织蛋白学通常提供一个有吸引力的样本来源，将研究结果从长凳翻译到诊所。它可以揭示癌症早期诊断和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病等）的潜在候选生物标志物。组织蛋白质解毒学还根据蛋白质的丰富性产生丰富的系统信息，并有助于解决有趣的生物学问题。
定量蛋白学分析可分为两大类：基于标签的方法和无标签的方法。在基于标签的方法中，蛋白质或肽使用稳定的同位素（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）或化学标签（如 ICAT（同位素编码亲和力标签）、TMT（串联质量标签）或 iTRAQ（用于相对和绝对定量的同质标记）进行标记。基于标签的方法具有更精确的蛋白质定量和使用同位素标签的优势，可以在一个实验中分析多个样本。无标签方法提供了基于标签的方法的具有成本效益的替代方案。根据临床特征，可以分析和比较属于特定组群的数百个患者样本，并与其他组别进行比较。在这里，我们描述了使用无标签和基于标签的蛋白质组分析方法为组织样本优化定量蛋白质组学工作流程，这对生命科学的应用至关重要，尤其是基于生物标志物的发现项目。

我们使用两种不同的方法来发现蛋白学：无标签和基于标签的蛋白造物学方法。SDS-PAGE上组织样本的蛋白质特征显示了完整的蛋白质，可以考虑进行蛋白质组分析（图2A）。仪器的质量控制检查通过系统适宜性软件进行监控，并显示仪器性能的日变化（图2B）。我们在 LC 梯度 （图 2C）的 30 分钟内观察到 BSA 样本的 91% 序列覆...

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Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

所述协议使用两种方法对组织样本进行优化定量蛋白学分析：基于标签和无标签量化。基于标签的方法具有更精确的蛋白质量化优势，而无标签方法更具成本效益，用于分析数百个组位样本。

组织样品质谱基猎枪蛋白造影学的综合工作流程

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

对蛋白质的精确定量测量对于理解蛋白质之间的动态和空间合作，以了解这种疾病回到生物学中至关重要。本实验的总体目标是为组织样本提供综合定量蛋白质解学工作流程，结合无标签和基于标签的蛋白质分析，以发现生物标志物。在这项研究中，我们使用仪器轨道疗法融合来量化蛋白质使用基于标签和无标签的方法。组织裂解是LC-MS-MS实验成功的关键步骤之一。在珠子跳动管中取30毫克的组织。使用 PBS 清洗后，加入 300 微升尿素裂解缓冲器，其中含有 8 个摩尔尿素、Tris、NaCl 和 MgCl2。使用探针声波器，解析组织的内容。重复此为另一个周期。如果您在管子底部观察到任何完整的组织，请在管子中加入硅珠，并使用珠子搅拌器使组织均质 90 秒，在冰上孵育 5 分钟。在摄氏4度下将样品离心约6000G，15分钟，将细胞碎片与超高纳特分离。将超纳特收集在新鲜的管子中，并均匀地混合溶液。使用布拉德福德试剂对组织解化物中的蛋白质浓度进行量化。为此，测量 595 纳米下样品的 OD，并使用此屏幕上显示的标准图形推断该示意器。蛋白质定量后，在12%SDS-PAGE凝胶上运行10微克组织解质，以检查解质的质量。解决方案消化的第一步是使用 TCEP 减少脱硫债券。加入 TCEP 后，在 37 摄氏度下孵育管内物品一小时。下一步涉及烷基化，以防止减少的脱硫债券重新形成。加入像碘酰胺这样的烷基化剂，在黑暗中孵育管子10分钟。孵化后，用四到八个量的稀释缓冲稀释尿素，将尿素的最终浓度降低到小于一摩尔。此时，建议检查 pH 值。下一步包括在管子中加入试丁二肌，并在一夜之间孵育管子以进行有效的消化。第二天，在真空浓缩器中干燥消化的肽，然后开始脱盐步骤。要执行肽的脱盐，请使用 C18 阶段提示。通过添加 50 微升甲醇来激活 C18 阶段尖端，在 1000 G 下离心两分钟。现在，在0.1%的富酸中加入50微升丙酮酸来清洗舞台尖端，然后再次离心尖端。在 50 微升 0.1% 的富酸中重新合成干燥消化的肽。将重组的肽添加到激活的阶段尖端。重复此步骤至少四次。要清洗样品，加入50微升0.1%的福糖酸，并重复离心步骤。对于多肽的消解，在0.1%的原酸中加入40%ACN的50微升，并通过离心通过舞台尖端。重复此步骤与 50% 和 60% ACN 在 0.1% 的原酸，并收集在新鲜管过滤液。使用真空浓缩器干燥脱盐肽。在 LC-MS-MS 运行之前，使用示波器方法量化肽。为此，将两个微升重构样品装载到微滴板井中，测量 205 纳米和 280 纳米的吸气量。计算此幻灯片上描述的公式的浓度。干燥后，脱盐肽就已准备好进行基于标签的量化。对于 iTRAQ 标签，必须在 iTRAQ 标签套件中提供的 20 微升溶解缓冲器中重新构用干肽。通过添加套件中提供的小瓶中的乙醇来重组标签，并彻底混合。建议所有步骤都根据制造商的说明执行。将同质混合的 iTRAQ 标签添加到各自的管子中，并允许发生标签反应。反应结束时，通过添加MS级水来淬火管中多余的未绑定标签，并孵育半小时至一小时。现在，将所有标记的内容转移到一个管子中，并干燥标记的肽。在将样品重新制造成0.1%的富酸后，打开NanoLC的自动采样器，并将样品放入自动采样器内。样品一旦放入自动采样器中，就必须为液相色谱和质谱设置正确的参数。在这里，我们使用 LC-MS 描述无标签量化和基于 iTRAQ 的量化参数。在无标签量化的情况下，120 分钟的梯度被用作正在注射的单个未违规样品。根据样本的复杂性，可以增加或减少此持续时间。在这个实验中，每分钟300纳罗利特的流量被设置为解决方案B的以下梯度，在这种情况下，1%的甲基丙酮酸为80%。同样，我们可以为 iTRAQ 实验设置梯度。由于样品未违规，已使用 90 分钟的梯度。可在此处看到无标签量化以及基于 iTRAQ 标签的量化的 MS 参数。第一步是通过单击全球参数来设置应用模式。选择肽模式，并根据使用的LC梯度设置方法持续时间。定义实验的扫描参数。单击 MS-OT 选项后，参数将变得可见。正在使用的探测器类型设置为轨道疗法。此仪器上可用的另一个选项包括离子陷阱。该分辨率已设定为 60，000，根据实验的需要和类型，人们可能会在可用的不同选项之间做出选择。质量范围正常，扫描范围设置为 375 到 1700。其他参数为 MS 应用程序默认值。强度阈值已设置，充电状态设置在 2 到 6 的范围。动态排除已设置为 40 秒，质量容差已保持为 10。下一组参数包括 MS-MS 参数。选择隔离模式时，选择四极，隔离窗口设置为2个，隔离偏移设置为关闭，激活类型通常是用于蛋白体学实验的HCD。碰撞能量可以修复，也可以辅助。标记的样品需要更高的碰撞能量，因此，对于 iTRAQ 实验，建议将碰撞能量设置为 35，而对于 LFQ 实验，则可设置为 30。此处使用的探测器类型是轨道疗法。扫描范围模式将是自动的。其他参数为 iTRAQ 实验和无标签定量实验的默认值。单击摘要将概述用于实验的所有 LC 和 MS 参数。您可以查看每个参数并进行校对。完成后，然后单击该文件并将其保存为方法文件。保存后，您可以运行该方法，并且将获取原始文件。然后，这些原始文件可以使用蛋白质组发现者软件进行分析。此图显示了 BSA 在三个技术复制中的序列覆盖率，在三个复制中为 91%。这表明仪器的可重复性。现在，这个数字显示了三种不同的生物样本中识别的肽光谱匹配、肽和蛋白质数量的均匀性，这再次说明了仪器的可重复性。在这里，Venn 图表示在无标签实验和基于标签的实验中在三个不同的样本中识别的常见和排他性蛋白质。这些条形图显示了在LFQ和iTRAQ实验中识别的1%FDR后肽光谱匹配数、肽组、总蛋白质、蛋白质组和蛋白质数。生物样本的组织蛋白解学使我们能够探索与疾病进展的不同阶段相关的新的潜在生物标志物。所述的组织定量蛋白体分析协议提供了可重复的良好覆盖数据。使用技术复制确保良好的可重复性，即使样品是在不同的时间点运行。在这里，我们展示了使用两种量化方法对组织样本的分析：无标签和基于标签的蛋白术。定量蛋白技术的选择可能取决于样本数量、MS平台的可用性和需要解决的生物问题。

Research

JoVE Journal

Biology

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