Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Vi anerkender MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility på IIT Bombay støttet af Department of Biotechnology (BT/PR13114/INF/22/206/2015) til at udføre alle MS-relaterede eksperimenter.

Denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af institutionelle klagenævn og den etiske komité under Det Indiske Teknologiske Institut Bombay (IITB-IEC/2016/026). Patienterne/deltagerne gav deres skriftlige samtykke til at deltage i denne undersøgelse.
1. Væv lysat forberedelse
BEMÆRK: Udfør alle følgende trin på isen for at holde proteaserne inaktive. Sørg for, at skalpellerne og de anvendte rør er sterile for at undgå krydskontamineri...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

Væv proteomics af biologiske prøver gør det muligt for os at udforske nye potentielle biomarkører forbundet med forskellige stadier af sygdomsprogression. Det forklarer også mekanismen for signalering og veje forbundet med sygdomsprogression. Den beskrevne protokol for væv kvantitative proteomics analyse giver reproducerbare gode dækningsdata. De fleste af trinene er blevet tilpasset fra producentens anvisninger. For at opnå data af høj kvalitet er følgende trin mest afgørende. Derfor bør der udvises ekstra o...

Proteomics-teknologier har potentiale til at muliggøre identifikation og kvantificering af potentielle kandidatmarkører, der kan hjælpe med at opdage og forsmæde sygdommen1. Nylige fremskridt inden for massespektrometri har accelereret klinisk forskning på proteinniveau. Forskere forsøger at løse udfordringen med kompliceret patobiologi af flere sygdomme ved hjælp af massespektrometribaserede proteomics, som nu giver øget følsomhed for proteinidentifikation og kvantificering2. Nøjagtig kvantitativ måling af proteiner er afgørende for at forstå det dynamiske og rumlige samarbejde mellem proteiner hos raske og syge individer3; en sådan analyse i proteom-dækkende skala er dog ikke let.
En væsentlig begrænsning af proteomisk profilering af kliniske prøver er kompleksiteten af biologiske prøver. Mange forskellige typer prøver er blevet undersøgt for at studere sygdommen proteom, såsom cellelinjer, plasma og væv4,5. Cellelinjer er meget udbredt som modeller i in vitro eksperimenter til at efterligne forskellige stadier af sygdomsprogression. Men en stor begrænsning med cellelinjer er, at de let erhverve genotypic og fænotypiske ændringer i løbet af processen med cellekultur6. Kropsvæsker såsom plasma kan være en attraktiv kilde til opdagelse af biomarkører; men på grund af de meget rigelige proteiner og dynamikken i proteinkoncentrationen er plasmaproatomics lidt mere udfordrende7. Her kan peptider stammer fra de mest rigelige proteiner undertrykke dem, der stammer fra de lave rigelige proteiner, selvom masse / opladningsforholdet er det samme6. Selv om der har været fremskridt i udtømning og fraktionering teknologier i de sidste par år, at få god dækning stadig en stor begrænsning af plasma proteomics8,9. Brugen af væv til proteomisk undersøgelse af sygdomsbiologi foretrækkes, da vævsprøver er mest proksimale for sygdomsstederne og tilbyder høj fysiologisk og patologisk information for at give bedre indsigt i sygdomsbiologien10,11.
I dette manuskript har vi leveret en forenklet protokol for kvantitative proteomics af vævsprøver. Vi har brugt en buffer, der indeholder 8 M urinstof til vævslysetpræparatet, da denne buffer er kompatibel med massespektrometribaserede undersøgelser. Det er dog obligatorisk at rengøre peptider for at fjerne salte, før de injiceres i massespektrometeret. Et vigtigt punkt at huske er at reducere urinstofkoncentrationen til mindre end 1 M, før du tilføjer trypsin til proteinfordøjelse, da trypsin udviser lav aktivitet ved 8 M urinstofkoncentration. Vi har forklaret to tilgange til kvantitative globale proteomics: etiketbaseret kvantificering ved hjælp af iTRAQ (isobar tags til relativ og absolut kvantificering) og etiketfri kvantificering (LFQ). De iTRAQ-baserede kvantitative proteomics anvendes hovedsageligt til sammenligning af flere prøver, der varierer i deres biologiske tilstand (f.eks. normal versus sygdom eller behandlede prøver). Tilgangen udnytter isobar reagenser til at mærke N-terminal primære aminer af peptider12. ITRAQ reagenser indeholder en N-methyl piperazin reporter gruppe, en balancer gruppe, og en N-hydroxy kortfattet ester gruppe, der reagerer med N-terminal primære aminer af peptider13. Fordøjede peptider fra hver tilstand er mærket med et bestemt iTRAQ reagens. Efter mærkningen stoppes reaktionen, og mærkede peptider fra forskellige forhold samles i et enkelt rør. Denne kombinerede prøveblanding analyseres med massespektrometer til identifikation og kvantificering. Efter MS/MS-analysen genereres der reporterefragmenter med lave molekylære masser, og disse reporteres ionintensitet anvendes til kvantificering af proteinerne.
En anden tilgang, etiketfri kvantificering bruges til at bestemme det relative antal proteiner i komplekse prøver uden at mærke peptider med stabile isotoper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

Nylige fremskridt inden for massespektrometri har resulteret i dyb proteomisk analyse sammen med generering af robuste og reproducerbare datasæt. Men på trods af de betydelige tekniske fremskridt, prøve forberedelse fra biospecimens såsom patientblod, CSF, og væv stadig udgør betydelige udfordringer. Til identifikation af biomarkører giver vævsproolics ofte en attraktiv prøvekilde til at oversætte forskningsresultaterne fra bænken til klinikken. Det kan afsløre potentielle kandidat biomarkører for tidlig diagnosticering af kræft og neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, osv. Væv proteomics giver også et væld af systemiske oplysninger baseret på overflod af proteiner og hjælper med at løse interessante biologiske spørgsmål.
Kvantitativ proteomics analyse kan grupperes i to brede kategorier: en etiketbaseret og en etiketfri tilgang. I den etiketbaserede tilgang mærkes proteiner eller peptider ved hjælp af stabile isotoper som SILAC (stabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur) eller ved kemiske tags som ICAT (isotopkodede affinitetsmærker), TMT (tandem mass tag) eller iTRAQ (isoobar tag for relativ og absolut kvantitet). Etiketbaserede tilgange har den fordel, at proteiner kvantificeres mere præcist, og ved hjælp af isobariske etiketter kan flere prøver analyseres i et enkelt eksperiment. Den etiketfrie tilgang er et omkostningseffektivt alternativ til etiketbaserede tilgange. Hundredvis af patientprøver, der tilhører en bestemt kohorte, kan analyseres og sammenlignes med andre kohorter baseret på kliniske træk. Her har vi beskrevet en optimeret kvantitativ proteomics workflow for vævsprøver ved hjælp af etiketfri og etiketbaserede proteomprofileringsmetoder, som er afgørende for anvendelser inden for biovidenskab, især biomarkøropdagelsesbaserede projekter.

Vi har brugt to forskellige tilgange til opdagelse proteomics: label-fri og label-baserede proteomics tilgange. Proteinprofilen af vævsprøver på SDS-PAGE viste de intakte proteiner og kunne komme i betragtning til proteomisk analyse (Figur 2A). Kvalitetskontrol af instrumentet blev overvåget via systemegnet software, og det viste den daglige variation i instrumentets ydeevne (figur 2B). Vi observerede 91% sekvensdækning af BSA-prøven i 30 min LC g...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Den beskrevne protokol giver en optimeret kvantitativ proteomics analyse af vævsprøver ved hjælp af to tilgange: etiket-baseret og etiket fri kvantitet. Etiketbaserede tilgange har den fordel, at proteiner kvantificeres mere præcist, mens en etiketfri tilgang er mere omkostningseffektiv og bruges til at analysere hundredvis af prøver af en kohorte.

Omfattende arbejdsgang af massespektrometri-baserede Shotgun Proteomics af vævsprøver

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Nøjagtige kvantitative målinger af proteiner er afgørende for at forstå det dynamiske og rumlige samarbejde mellem proteiner for at forstå sygdommen tilbage til biologien. Det overordnede mål med dette eksperiment er at tilvejebringe en integreret kvantitativ proteomics workflow for vævsprøver, der kombinerer etiketfri og etiketbaseret proteinprofilering til opdagelse af biomarkører. I denne undersøgelse har vi brugt instrumentet Orbitrap Fusion til at kvantificere proteinerne ved hjælp af etiketbaserede og etiketfrie tilgange.Tissue lysis er et af de mest afgørende skridt for succes for en LC-MS-MS eksperiment. Tag 30 mg væv i en perle slå rør. Efter vask med PBS tilsættes 300 mikroliter urinstof lysis buffer indeholdende otte molar urea, Tris, NaCl og MgCl2.Brug en sonde sonicator, lyse indholdet af vævet. Gentag dette for en anden cyklus. Hvis du observerer intakt væv i bunden af røret, tilsæt zirconiumperler til røret og homogeniser vævet ved hjælp af en perle tæppebanker i 90 sekunder, med fem minutters inkubation på is.Centrifuge prøverne omkring 6000 G i 15 minutter ved fire grader Celsius for at adskille cellerester fra supernatanten. Saml supernatanten i et frisk rør og bland opløsningen ensartet. Kvantificer proteinkoncentrationen i vævslyset ved hjælp af Bradford reagens.Til dette formål måles OD for prøven ved 595 nanometer og ekstrapolerer den ved hjælp af en standardgraf som vist på denne skærm. Efter proteinkvantificeringen skal du køre 10 mikrogram vævslyt på 12% SDS-PAGE gel for at kontrollere kvaliteten af lysater. Det første skridt i fordøjelsen i opløsning indebærer reduktion af disulfidbindinger ved hjælp af TCEP.Efter tilsætning af TCEP inkuberes indholdet af røret i en time ved 37 grader Celsius. Det næste skridt indebærer alkylation for at forhindre de reducerede disulfidbindinger i at blive dannet igen. Tilsæt et alkylerende middel som iodoacetamid og inkuber røret i mørke i 10 minutter.Efter inkubation sænkes den endelige koncentration af urinstof til mindre end en molar ved fortynding med fire til otte volumener fortyndingsbuffer. På dette tidspunkt er det tilrådeligt at kontrollere pH. Det næste skridt indebærer tilsætning af trypsin til røret og inkubation af røret natten over for effektiv fordøjelse.På den næste dag tørres de fordøjede peptider i en vakuumkoncentrator og fortsæt til afsaltningstrin. For at udføre afsaltning af peptider, skal du bruge C18 fase tips. Aktivér C18-trinspidsen ved at tilsætte 50 mikroliter methanol, centrifuge spidsen ved 1000 G i to minutter.Nu tilsættes 50 mikroliter acetonitrile i 0,1% myresyre til at vaske fase tip, og igen, centrifuge spidsen. Rekonstruere de tørrede fordøjede peptider i 50 mikroliter af 0,1% myresyre. Tilsæt de rekonstituerede peptider i den aktiverede scenespids.Gentag dette trin mindst fire gange. Hvis du vil vaske prøven, tilsættes 50 mikroliter på 0,1% myresyre, og centrifugeringstrinnet gentages. Til fortynding af peptider tilsættes 50 mikroliter af 40% ACN i 0,1% myresyre, og før den gennem fasespidsen ved centrifugering.Gentag dette trin med 50% og 60% ACN i 0,1% myresyre og opsamle filtratet i et frisk rør. Tør de afsaltede peptider ved hjælp af en vakuumkoncentrator. Før LC-MS-MS-run skal du kvantificere peptider ved hjælp af metoden Scopes.Til dette skal du indlæse to mikroliter rekonstitueret prøve i brønden af en mikrodråbeplade og måle absorbansen ved 205 nanometer og 280 nanometer. Beregn koncentrationen ud fra den formel, der er beskrevet på dette dias. Når de afsaltede peptider er tørret, er de klar til etiketbaseret kvantificering.Ved iTRAQ-mærkning skal de tørrede peptider rekonstitueres i 20 mikroliter opløsningsbuffer, der er angivet i iTRAQ-mærkningssættet. Rekonstruer etiketterne ved at tilsætte ethanol fra hætteglasset i sættet, og bland grundigt. Det er tilrådeligt, at alle trin udføres i henhold til producentens anvisninger.Tilsæt de homogent blandede iTRAQ-etiketter til deres respektive rør, og lad mærkningsreaktionen finde sted. Ved slutningen af reaktionen skal du slukke overskydende ubundet etiket i røret ved at tilsætte MS-kvalitet vand og inkubere i en halv time til en time. Overfør nu alt det mærkede indhold til et enkelt rør og tør de mærkede peptider.Efter rekonstituering af prøverne i 0,1% myresyre, skal du åbne autosampleren af NanoLC og placere prøverne inde i autosampleren. Når prøverne er placeret i autosampleren, er det vigtigt at indstille de rigtige parametre for flydende kromatografi og massespektrometri. Her beskriver vi parametrene for både etiketfri kvantificering og iTRAQ-baseret kvantificering ved hjælp af LC-MS.I tilfælde af etiketfri kvantitet er der anvendt en 120 minutters stigningsgrad, da der injiceres en enkelt ikke-fraktioneret prøve. Denne varighed kan øges eller reduceres baseret på stikprøvens kompleksitet. I dette eksperiment er der indstillet en strøm på 300 nanoliter i minuttet med følgende gradient for opløsning B, som er 80% acetonitril i 1% myresyre, i dette tilfælde.På samme måde kan vi indstille en gradient for et iTRAQ-eksperiment. Da prøverne er ikke fraktioneret, er der anvendt en 90-minutters gradient. MS-parametrene for både etiketfri kvantificering samt iTRAQ-etiketbaseret kvantificering kan ses her.Det første trin indebærer indstilling af programtilstand ved at klikke på de globale parametre. Vælg peptidtilstanden, og angiv metodens varighed pr. det LC-forløb, der bruges. Definer scanningsparametrene for eksperimentet.Når du klikker på MS-OT-indstillingen, bliver parametrene synlige. Den detektortype, der er i brug, er indstillet til Orbitrap. Den anden mulighed, der er tilgængelig på dette instrument, omfatter en ionfælde.Opløsningen er indstillet til 60.000, og man kan vælge mellem forskellige tilgængelige indstillinger, afhængigt af eksperimentets behov og type. Masseområdet er normalt, og scanningsområdet er indstillet fra 375 til 1700. De andre parametre er standard for MS-programmet.Intensitetstærsklen er sat, og opladningstilstanden er indstillet i intervallet to til seks. Dynamisk udelukkelse er sat til 40 sekunder, og massetolerancen er blevet holdt til 10. Det næste sæt parametre omfatter MS-MS-parametrene.Isolationstilstanden er valgt med firdobbelt, isolationsvindue sat til to, isolationsforskydning er sat til at slukke, og aktiveringstypen er normalt HCD til proteomics-eksperimentet. Kollisionsenergi kan enten repareres, eller den kan hjælpes. Mærkede prøver kræver højere kollisionsenergier, og derfor er det tilrådeligt, at kollisionsenergien indstilles til 35, mens den for LFQ-eksperimenter kan indstilles til 30.Den detektortype, der bruges her, er Orbitrap. Scanningsområdetilstand vil være automatisk. De andre parametre er standard for iTRAQ-eksperimenter og etiketfrit kvantitativt eksperiment.Hvis du klikker på resuméet vil give et overblik over alle de LC og MS parametre, der anvendes til eksperimentet. Du kan se på hver eneste parameter og udføre korrekturlæsningen. Når det er gjort, skal du klikke på filen og gemme den som en metodefil.Når du gemmer, kan du køre metoden, og du får de rå filer. Og så kan disse rå filer analyseres ved hjælp af Proteome Discoverer-software. Dette tal viser rækkefølgen dækning af BSA i tre tekniske replikationer, som er 91% i de tre replikationer.Dette indikerer instrumentets reproducerbarhed. Nu viser denne figur ensartetheden i antallet af peptidspektrale, peptider og proteiner identificeret i tre forskellige biologiske prøver, hvilket igen giver en idé om instrumentets reproducerbarhed. Her repræsenterer Venn-diagrammet de almindelige og eksklusive proteiner, der er identificeret i tre forskellige prøver i etiketfrit eksperiment og etiketbaseret eksperiment.Disse bar grafer viser antallet af peptid spektrale kampe, peptid grupper, samlede proteiner, proteingrupper, og protein nummer efter 1% FDR, identificeret i LFQ og iTRAQ eksperiment. Væv proteomics af biologiske prøver gør det muligt for os at udforske nye potentielle biomarkører forbundet med forskellige stadier af sygdomsprogression. Den beskrevne protokol for vævs kvantitative proteomanalyse giver reproducerbare gode dækningsdata.Brug af tekniske replikater sikrer god reproducerbarhed, selvom prøverne køres på forskellige tidspunkter. Her har vi vist analysen af vævsprøver ved hjælp af to kvantificeringsmetoder: etiketfri og etiketbaseret proteomics. Udvælgelsen af kvantitative proteomiske teknikker kan afhænge af antallet af prøver, tilgængeligheden af MS-platforme og biologisk spørgsmål, der skal behandles.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomiske Prøveforberedelse fra formalin Faste og Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol som en matrix til Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisering Imaging på en Fourier Transform-cyklotron resonans Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up og Shotgun Proteomics at identificere en omfattende Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound massespektrometri - Et kraftfuldt værktøj til at identificere nye C-di-GMP effektorproteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Ikke-enzymatisk, Serumfrit Tissue Culture of Pre-invasive brystlæsioner til spontane generation af Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Valgt Reaktion Overvågning massespektrometri for Absolute Protein Kvantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Berigelse af ekstracellulære matrixproteiner fra væv og fordøjelse til peptider for massespektrometri Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Omfattende arbejdsgang for Genome-wide identifikation og udtryk Meta-analyse af ATL E3 Ubiquitin Ligase gen familie i Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...