Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

We erkennen MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), project #34_IITB SS en MASSFIITB Facility in IIT Bombay ondersteund door het Department of Biotechnology (BT / PR13114 / INF / 22/206/2015) om alle MS-gerelateerde experimenten uit te voeren.

Deze studie werd beoordeeld en goedgekeurd door institutionele review boards en de ethische commissie van het Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). De patiënten/deelnemers hebben hun schriftelijke toestemming gegeven om deel te nemen aan dit onderzoek.
1. Weefsellysaatpreparaat
OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit op het ijs om de proteasen inactief te houden. Zorg ervoor dat de scalpels en eventuele gebruikte buizen steriel...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

Weefselproteomica van biologische monsters stelt ons in staat om nieuwe potentiële biomarkers te verkennen die verband houden met verschillende stadia van ziekteprogressie. Het verklaart ook het mechanisme van signalering en routes geassocieerd met ziekteprogressie. Het beschreven protocol voor weefsel kwantitatieve proteomics analyse biedt reproduceerbare goede dekkingsgegevens. De meeste stappen zijn aangepast aan de instructies van de fabrikant. Om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen, zijn de volgende stappen h...

Proteomics-technologieën hebben het potentieel om de identificatie en kwantificering van potentiële kandidaat-markers mogelijk te maken die kunnen helpen bij de detectie en voorspelling van de ziekte1. Recente ontwikkelingen op het gebied van massaspectrometrie hebben het klinisch onderzoek op eiwitniveau versneld. Onderzoekers proberen de uitdaging van gecompliceerde pathobiologie van verschillende ziekten aan te pakken met behulp van op massaspectrometrie gebaseerde proteomica, die nu een verhoogde gevoeligheid biedt voor eiwitidentificatie en kwantificering2. Nauwkeurige kwantitatieve meting van eiwitten is cruciaal om de dynamische en ruimtelijke samenwerking tussen eiwitten bij gezonde en zieke individuen tebegrijpen 3; een dergelijke analyse op proteoombrede schaal is echter niet eenvoudig.
Een belangrijke beperking van proteomische profilering van klinische monsters is de complexiteit van biologische monsters. Veel verschillende soorten monsters zijn onderzocht om de ziekte proteoom te bestuderen, zoals cellijnen, plasma en weefsels4,5. Cellijnen worden veel gebruikt als modellen in in vitro experimenten om verschillende stadia van ziekteprogressie na te bootsen. Een belangrijke beperking met cellijnen is echter dat ze gemakkelijk genotypische en fenotypische veranderingen krijgen tijdens het proces van celkweek6. Lichaamsvloeistoffen zoals plasma kunnen een aantrekkelijke bron zijn voor de ontdekking van biomarkers; vanwege de zeer overvloedige eiwitten en het dynamische bereik van eiwitconcentratie is plasmaproteomics echter een beetje uitdagender7. Hier kunnen peptiden afkomstig van de meest voorkomende eiwitten die zijn afgeleid van de weinig voorkomende eiwitten onderdrukken, zelfs als de massa / ladingsverhouding hetzelfde is6. Hoewel er de afgelopen jaren vooruitgang is geboekt in de uitputtings- en fractioneringstechnologieën, blijft het verkrijgen van een goede dekking nog steeds een belangrijke beperking van plasmaproteomics8,9. Het gebruik van weefsels voor proteomisch onderzoek van ziektebiologie heeft de voorkeur omdat weefselmonsters het meest proximaal zijn voor de ziekteplaatsen en hoge fysiologische en pathologische informatie bieden om betere inzichten in de ziektebiologie te bieden10,11.
In dit manuscript hebben we een vereenvoudigd protocol gegeven voor de kwantitatieve proteomics van weefselmonsters. We hebben een buffer met 8 M ureum gebruikt voor het weefsellysaatpreparaat, omdat deze buffer compatibel is met op massaspectrometrie gebaseerd onderzoek. Het is echter verplicht om de peptiden te reinigen om zouten te verwijderen voordat ze in de massaspectrometer worden geïnjecteerd. Een belangrijk punt om te onthouden is om de ureumconcentratie te verlagen tot minder dan 1 M voordat trypsine wordt toegevoegd voor eiwitvertering, omdat trypsine een lage activiteit vertoont bij een ureumconcentratie van 8 M. We hebben twee benaderingen van kwantitatieve wereldwijde proteomics uitgelegd: labelgebaseerde kwantificering met behulp van iTRAQ (isobare tags voor relatieve en absolute kwantificering) en labelvrije kwantificering (LFQ). De op iTRAQ gebaseerde kwantitatieve proteomics wordt voornamelijk gebruikt voor het vergelijken van meerdere monsters die variëren in hun biologische toestand (bijv. Normale versus ziekte of behandelde monsters). De aanpak maakt gebruik van isobare reagentia om de N-terminale primaire amines van peptiden te labelen12. De iTRAQ-reagentia bevatten één N-methyl piperazine reportergroep, een balancergroep en één N-hydroxy succinimide-estergroep die reageert met N-terminale primaire amines van peptiden13. Verteerde peptiden van elke aandoening worden gelabeld met een bepaald iTRAQ-reagens. Na de etikettering wordt de reactie gestopt en worden gelabelde peptiden uit verschillende omstandigheden samengevoegd in een enkele buis. Dit gecombineerde monstermengsel wordt geanalyseerd met een massaspectrometer voor identificatie en kwantificering. Na de MS/MS-analyse worden reporter-ionfragmenten met lage moleculaire massa's gegenereerd en worden de ionenintensiteiten van deze reporterionen gebruikt voor de kwantificering van de eiwitten.
Een andere benadering, labelvrije kwantificering, wordt gebruikt om het relatieve aantal eiwitten in complexe monsters te bepalen zonder peptiden te labelen met stabiele isotopen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie hebben geresulteerd in diepe proteomische analyse samen met het genereren van robuuste en reproduceerbare datasets. Ondanks de aanzienlijke technische vooruitgang vormt de monstervoorbereiding van biospecimens zoals patiëntenbloed, csf en weefsel echter nog steeds aanzienlijke uitdagingen. Voor het identificeren van biomarkers biedt weefselproteomics vaak een aantrekkelijke monsterbron om de onderzoeksresultaten van de bank naar de kliniek te vertalen. Het kan potentiële kandidaat-biomarkers onthullen voor vroege diagnose van kanker en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, enz. Weefselproteomics levert ook een schat aan systemische informatie op basis van de overvloed aan eiwitten en helpt om interessante biologische vragen aan te pakken.
Kwantitatieve proteomics-analyse kan worden gegroepeerd in twee brede categorieën: een labelgebaseerde en een labelvrije aanpak. In de labelgebaseerde benadering worden eiwitten of peptiden gelabeld met behulp van stabiele isotopen zoals SILAC (stabiele isotoopetikettering met aminozuren in celkweek) of door chemische tags zoals ICAT (isotoopgecodeerde affiniteitstags), TMT (tandem mass tag) of iTRAQ (isobare tag voor relatieve en absolute kwantificering). Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten en met behulp van isobare labels kunnen meerdere monsters in één experiment worden geanalyseerd. De labelvrije aanpak biedt een kosteneffectief alternatief voor labelgebaseerde benaderingen. Honderden patiëntmonsters die tot een bepaald cohort behoren, kunnen worden geanalyseerd en vergeleken met andere cohorten op basis van klinische kenmerken. Hier hebben we een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-workflow beschreven voor weefselmonsters met behulp van labelvrije en labelgebaseerde proteoomprofileringsmethoden, wat cruciaal is voor toepassingen in de biowetenschappen, met name op biomarkerontdekking gebaseerde projecten.

We hebben twee verschillende benaderingen gebruikt voor ontdekkingsproteomics: labelvrije en labelgebaseerde proteomics-benaderingen. Het eiwitprofiel van weefselmonsters op SDS-PAGE toonde de intacte eiwitten en kon in aanmerking komen voor proteomische analyse(figuur 2A). De kwaliteitscontrole van het instrument werd gemonitord via systeemgeschiktheidssoftware en toonde de dagelijkse variatie in de instrumentprestaties(figuur 2B). We zagen 91% sequent...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Nauwkeurige kwantitatieve metingen van eiwitten zijn cruciaal om de dynamische en ruimtelijke samenwerking tussen eiwitten te begrijpen om de ziekte terug te begrijpen naar de biologie. Het algemene doel van dit experiment is om een geïntegreerde kwantitatieve proteomics-workflow voor weefselmonsters te bieden, waarbij labelvrije en labelgebaseerde eiwitprofilering wordt gecombineerd voor het ontdekken van biomarkers. In deze studie hebben we het instrument Orbitrap Fusion gebruikt om de eiwitten te kwantificeren met behulp van labelgebaseerde en labelvrije benaderingen.Weefsellysis is een van de meest cruciale stappen voor het succes van een LC-MS-MS experiment. Neem 30 mg weefsel in een kraal kloppende buis. Voeg na het wassen met de PBS 300 microliter ureumlysisbuffer toe met acht molair ureum, Tris, NaCl en MgCl2.Gebruik een sonde sonicator om de inhoud van het weefsel te lyseren. Herhaal dit voor een andere cyclus. Als u intact weefsel aan de onderkant van de buis waarneemt, voegt u zirkoniumparels toe aan de buis en homogeniseert u het weefsel met behulp van een kralenklopper gedurende 90 seconden, met vijf minuten incubatie op ijs.Centrifugeer de monsters ongeveer 6000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om het celafval van het supernatant te scheiden. Verzamel het supernatant in een verse buis en meng de oplossing gelijkmatig. Kwantificeer de eiwitconcentratie in het weefsellysaat met behulp van Bradford-reagens.Meet hiervoor de OD van het monster op 595 nanometer en extrapoleer het met behulp van een standaardgrafiek zoals weergegeven op dit scherm. Voer na de eiwitkwantificering 10 microgram weefsellysaat uit op 12% SDS-PAGE-gel om de kwaliteit van lysaten te controleren. De eerste stap in de vertering in oplossing omvat de vermindering van disulfidebindingen, met behulp van TCEP.Na de toevoeging van TCEP, incubeer de inhoud van de buis gedurende een uur bij 37 graden Celsius. De volgende stap omvat alkylering om te voorkomen dat de verminderde disulfidebindingen zich opnieuw vormen. Voeg een alkylerend middel zoals jodoacetamide toe en incubeer de tube in het donker gedurende 10 minuten.Verlaag na incubatie de uiteindelijke concentratie van ureum tot minder dan één kies door te verdunnen met vier tot acht volumes verdunningsbuffer. Op dit punt is het raadzaam om de pH te controleren. De volgende stap omvat de toevoeging van trypsine aan de buis en het 's nachts incuberen van de buis voor een efficiënte spijsvertering.Droog de volgende dag de verteerde peptiden in een vacuümconcentrator en ga verder met de ontsalingsstap. Om de ontsalting van peptiden uit te voeren, gebruikt u C18-fasetips. Activeer de C18-traptip door 50 microliter methanol toe te voegen, centrifugeer de tip gedurende twee minuten bij 1000 G.Voeg nu 50 microliter acetonitril toe in 0,1% mierenzuur om de podiumpunt te wassen en centrifugeer de punt opnieuw. Reconstitueer de gedroogde verteerde peptiden in 50 microliter van 0,1% mierenzuur. Voeg de gereconstitueerde peptiden toe aan de geactiveerde fasepunt.Herhaal deze stap minstens vier keer. Voeg om het monster te wassen 50 microliter 0,1% mierenzuur toe en herhaal de centrifugatiestap. Voeg voor de elutie van peptiden 50 microliter 40%ACN toe aan 0,1% mierenzuur en passeer het door de punt van het stadium door centrifugatie.Herhaal deze stap met 50% en 60% ACN in 0,1% mierenzuur en vangt het filtraat op in een verse tube. Droog de ontsalde peptiden met behulp van een vacuümconcentrator. Voordat LC-MS-MS wordt uitgevoerd, kwantificeert u de peptiden met behulp van de Scopes-methode.Laad hiervoor twee microliter gereconstitueerd monster in de put van een microdruppelplaat en meet de absorptie bij 205 nanometer en 280 nanometer. Bereken de concentratie met de formule die op deze dia wordt beschreven. Zodra de ontsalde peptiden zijn gedroogd, zijn ze klaar voor labelgebaseerde kwantificering.Voor iTRAQ-etikettering moeten de gedroogde peptiden worden gereconstitueerd in 20 microliter oplossingsbuffer, verstrekt in de iTRAQ-etiketteringskit. Reconstitueer de etiketten door ethanol uit de injectieflacon in de kit toe te voegen en meng grondig. Het is raadzaam dat alle stappen worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.Voeg de homogeen gemengde iTRAQ-labels toe aan hun respectievelijke buizen en laat de etiketteringsreactie plaatsvinden. Doof aan het einde van de reactie overtollig ongebonden label in de buis door water van MS-kwaliteit toe te voegen en incubeer gedurende een half uur tot een uur. Breng nu alle gelabelde inhoud over in een enkele buis en droog de gelabelde peptiden.Na het reconstitueren van de monsters in 0,1% mierenzuur, opent u de autosampler van NanoLC en plaatst u de monsters in de autosampler. Zodra de monsters in de autosampler zijn geplaatst, is het belangrijk om de juiste parameters in te stellen voor vloeistofchromatografie en massaspectrometrie. Hier beschrijven we de parameters voor zowel labelvrije kwantificering als iTRAQ-gebaseerde kwantificering met behulp van LC-MS.In het geval van labelvrije kwantificering is een gradiënt van 120 minuten gebruikt omdat een enkel ongefractioneerd monster wordt geïnjecteerd. Deze duur kan worden verhoogd of verlaagd op basis van de complexiteit van de steekproef. In dit experiment is een stroom van 300 nanoliter per minuut ingesteld met de volgende gradiënt voor oplossing B, in dit geval 80% acetonitril in 1% mierenzuur.Op dezelfde manier kunnen we een verloop instellen voor een iTRAQ-experiment. Omdat de monsters niet-gefractioneerd zijn, is een gradiënt van 90 minuten gebruikt. De MS-parameters voor zowel labelvrije kwantificering als iTRAQ-labelgebaseerde kwantificering zijn hier te zien.De eerste stap omvat het instellen van de toepassingsmodus door op de algemene parameters te klikken. Selecteer de peptidemodus en stel de duur van de methode in volgens de LC-gradiënt die wordt gebruikt. Definieer de scanparameters voor het experiment.Door op de MS-OT optie te klikken, worden de parameters zichtbaar. Het detectortype dat in gebruik is, is ingesteld op Orbitrap. De andere optie die op dit instrument beschikbaar is, omvat een ionenval.De resolutie is ingesteld op 60.000 en men kan kiezen tussen verschillende beschikbare opties, afhankelijk van de behoefte en het type van het experiment. Het massabereik is normaal en het scanbereik is ingesteld van 375 tot 1700. De andere parameters zijn standaard voor MS Application.De intensiteitsdrempel is ingesteld en de laadstatus is ingesteld in het bereik van twee tot zes. Dynamische uitsluiting is ingesteld op 40 seconden en de massatolerantie is teruggebracht tot 10. De volgende set parameters omvat de MS-MS-parameters.De isolatiemodus is geselecteerd met quadrupool, het isolatievenster is ingesteld op twee, de isolatieverschuiving is uitgeschakeld en het activeringstype is meestal HCD voor het proteomics-experiment. Botsingsenergie kan worden opgelost of worden ondersteund. Gelabelde monsters vereisen hogere botsingsenergieën, daarom is het voor iTRAQ-experimenten raadzaam dat de botsingsenergie wordt ingesteld op 35, terwijl deze voor LFQ-experimenten kan worden ingesteld op 30.Het detectortype dat hier wordt gebruikt, is Orbitrap. De scanbereikmodus is automatisch. De andere parameters zijn standaard voor iTRAQ-experimenten en labelvrije kwantitatieve experimenten.Als u op de samenvatting klikt, krijgt u een overzicht van alle LC- en MS-parameters die voor het experiment zijn gebruikt. U kunt elke parameter bekijken en de proeflezing uitvoeren. Zodra dat is gebeurd, klikt u op het bestand en slaat u het op als een methodebestand.Zodra u hebt opgeslagen, kunt u de methode uitvoeren en krijgt u de ONBEWERKT-bestanden. En dan kunnen die onbewerkte bestanden worden geanalyseerd met behulp van Proteome Discoverer-software. Deze figuur toont de sequentiedekking van BSA in drie technische replicaties, die 91% is in de drie replicaties.Dit geeft de reproduceerbaarheid van het instrument aan. Nu toont deze figuur de uniformiteit in het aantal peptide spectrale matches, peptiden en eiwitten geïdentificeerd in drie verschillende biologische monsters, wat opnieuw een idee geeft over de reproduceerbaarheid van het instrument. Hier vertegenwoordigt het Venn-diagram de gemeenschappelijke en exclusieve eiwitten die zijn geïdentificeerd in drie verschillende monsters in labelvrije experimenten en op labels gebaseerde experimenten.Deze staafdiagrammen tonen het aantal peptidespectrale matches, peptidegroepen, totale eiwitten, eiwitgroepen en eiwitaantal na 1% FDR, geïdentificeerd in LFQ- en iTRAQ-experiment. Weefselproteomica van biologische monsters stelt ons in staat om nieuwe potentiële biomarkers te verkennen die verband houden met verschillende stadia van ziekteprogressie. Het beschreven protocol voor kwantitatieve proteomische analyse van weefsel biedt reproduceerbare goede dekkingsgegevens.Het gebruik van technische replicaties zorgt voor een goede reproduceerbaarheid, zelfs als de monsters op verschillende tijdstippen worden uitgevoerd. Hier hebben we de analyse van weefselmonsters aangetoond met behulp van twee kwantificeringsmethoden: labelvrije en labelgebaseerde proteomics. De selectie van kwantitatieve proteomische technieken kan afhangen van het aantal monsters, de beschikbaarheid van MS-platforms en de biologische vraag die moet worden aangepakt.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomics Monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up en Shotgun Proteomics een uitgebreide Cochlear Proteome Identificeer

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Verrijking van extracellulaire matrix eiwitten uit weefsels en de spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Uitgebreide Workflow voor de genoom-brede identificatie en expressie Meta-analyse van de ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene familie in Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...