Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
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Wir danken dem MHRD-UAY-Projekt (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), dem Projekt #34_IITB SS und massfiitB Facility am IIT Bombay, das vom Department of Biotechnology (BT / PR13114 / INF / 22 / 206 / 2015) unterstützt wird, um alle MS-bezogenen Experimente durchzuführen.

Diese Studie wurde von institutionellen Prüfungsausschüssen und der Ethikkommission des Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026) geprüft und genehmigt. Die Patienten/Teilnehmer gaben ihre schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an dieser Studie.
1. Gewebelysatpräparat
HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte auf dem Eis aus, um die Proteasen inaktiv zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Skalpelle und alle verwendeten Röhrchen...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

Die Gewebeproteomik biologischer Proben ermöglicht es uns, neue potenzielle Biomarker zu erforschen, die mit verschiedenen Stadien des Krankheitsverlaufs verbunden sind. Es erklärt auch den Mechanismus der Signalübertragung und die mit dem Fortschreiten der Krankheit verbundenen Wege. Das beschriebene Protokoll für die quantitative Gewebeproteomik-Analyse liefert reproduzierbare gute Abdeckungsdaten. Die meisten Schritte wurden aus den Anweisungen des Herstellers angepasst. Um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten...

Proteomik-Technologien haben das Potenzial, die Identifizierung und Quantifizierung potenzieller Kandidatenmarker zu ermöglichen, die bei der Erkennung und Prognose der Krankheit helfen können1. Jüngste Fortschritte auf dem Gebiet der Massenspektrometrie haben die klinische Forschung auf Proteinebene beschleunigt. Forscher versuchen, die Herausforderung der komplizierten Pathobiologie mehrerer Krankheiten mit Hilfe der massenspektrometrischen Proteomik anzugehen, die jetzt eine erhöhte Empfindlichkeit für die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen bietet2. Eine genaue quantitative Messung von Proteinen ist entscheidend, um die dynamische und räumliche Zusammenarbeit zwischen Proteinen bei gesunden und kranken Individuen zu verstehen3; Eine solche Analyse auf proteomweiter Skala ist jedoch nicht einfach.
Eine wesentliche Einschränkung der proteomischen Profilierung klinischer Proben ist die Komplexität biologischer Proben. Viele verschiedene Arten von Proben wurden untersucht, um das Krankheitsproteom zu untersuchen, wie Zelllinien, Plasma und Gewebe4,5. Zelllinien werden häufig als Modelle in In-vitro-Experimenten verwendet, um verschiedene Stadien des Krankheitsverlaufs nachzuahmen. Eine wesentliche Einschränkung bei Zelllinien besteht jedoch darin, dass sie während des Prozesses der Zellkultur leicht genotypische und phänotypische Veränderungen erwerben6. Körperflüssigkeiten wie Plasma könnten eine attraktive Quelle für die Entdeckung von Biomarkern sein; Aufgrund der sehr reichhaltigen Proteine und des dynamischen Bereichs der Proteinkonzentration ist die Plasmaproteomik jedoch etwas anspruchsvoller7. Hier können Peptide, die aus den am häufigsten vorkommenden Proteinen stammen, diejenigen unterdrücken, die von den wenig reichlich vorhandenen Proteinen abgeleitet sind, auch wenn das Masse-Ladungs-Verhältnis gleichist 6. Obwohl es in den letzten Jahren Fortschritte bei den Depletions- und Fraktionierungstechnologien gegeben hat, bleibt eine gute Abdeckung immer noch eine große Einschränkung der Plasmaproteomik8,9. Die Verwendung von Geweben zur proteomischen Untersuchung der Krankheitsbiologie wird bevorzugt, da Gewebeproben am nahesten zu den Krankheitsstellen sind und hohe physiologische und pathologische Informationen bieten, um bessere Einblicke in die Krankheitsbiologie zu geben10,11.
In diesem Manuskript haben wir ein vereinfachtes Protokoll für die quantitative Proteomik von Gewebeproben bereitgestellt. Für die Gewebelysatzubereitung haben wir einen Puffer mit 8 M Harnstoff verwendet, da dieser Puffer mit massenspektrometrischen Untersuchungen kompatibel ist. Es ist jedoch zwingend erforderlich, die Peptide zu reinigen, um Salze zu entfernen, bevor sie in das Massenspektrometer injiziert werden. Ein wichtiger Punkt, an den Sie sich erinnern sollten, ist, die Harnstoffkonzentration auf weniger als 1 M zu reduzieren, bevor Trypsin für die Proteinverdauung hinzugefügt wird, da Trypsin bei einer Harnstoffkonzentration von 8 M eine geringe Aktivität aufweist. Wir haben zwei Ansätze der quantitativen globalen Proteomik erläutert: die markierungsbasierte Quantifizierung mit iTRAQ (isobare Tags für relative und absolute Quantifizierung) und die markierungsfreie Quantifizierung (LFQ). Die iTRAQ-basierte quantitative Proteomik wird hauptsächlich zum Vergleich mehrerer Proben verwendet, die sich in ihrem biologischen Zustand (z. B. normale versus Krankheit oder behandelte Proben) auskennen. Der Ansatz verwendet isobare Reagenzien, um die N-terminalen primären Amine von Peptiden12zu kennzeichnen. Die iTRAQ-Reagenzien enthalten eine N-Methylpipepasin-Reportergruppe, eine Balancer-Gruppe und eine N-Hydroxysuccinimidester-Gruppe, die mit N-terminalen primären Aminen von Peptiden reagiert13. Verdaute Peptide aus jeder Erkrankung werden mit einem bestimmten iTRAQ-Reagenz markiert. Nach der Markierung wird die Reaktion gestoppt und markierte Peptide aus verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Röhrchen zusammengefasst. Dieses kombinierte Probengemisch wird mit einem Massenspektrometer zur Identifizierung und Quantifizierung analysiert. Nach der MS/MS-Analyse werden Reporterionenfragmente mit niedermolekularen Massen erzeugt und die Ionendichten dieser Reporterionen für die Quantifizierung der Proteine verwendet.
Ein weiterer Ansatz, die markierungsfreie Quantifizierung, wird verwendet, um die relative Anzahl von Proteinen in komplexen Proben zu bestimmen, ohne Peptide mit stabilen Isotopen zu markieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

Jüngste Fortschritte in der Massenspektrometrie haben zu einer tiefen proteomischen Analyse zusammen mit der Generierung robuster und reproduzierbarer Datensätze geführt. Trotz der erheblichen technischen Fortschritte stellt die Probenvorbereitung aus Bioproben wie Patientenblut, Liquor und Gewebe jedoch immer noch erhebliche Herausforderungen dar. Für die Identifizierung von Biomarkern bietet die Gewebeproteomik oft eine attraktive Probenquelle, um die Forschungsergebnisse von der Bank in die Klinik zu übertragen. Es kann potenzielle Biomarkerkandidaten für die Früherkennung von Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson usw. aufdecken. Die Gewebeproteomik liefert auch eine Fülle von systemischen Informationen, die auf der Fülle von Proteinen basieren und helfen, interessante biologische Fragen zu beantworten.
Die quantitative Proteomik-Analyse kann in zwei große Kategorien eingeteilt werden: einen labelbasierten und einen labelfreien Ansatz. Im labelbasierten Ansatz werden Proteine oder Peptide mit stabilen Isotopen wie SILAC (stabile Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in Zellkultur) oder durch chemische Tags wie ICAT (isotopencodierte Affinity-Tags), TMT (Tandem-Massen-Tag) oder iTRAQ (isobarer Tag für relative und absolute Quantifizierung) markiert. Markierungsbasierte Ansätze haben den Vorteil einer genaueren Quantifizierung von Proteinen und mit isobaren Markierungen können mehrere Proben in einem einzigen Experiment analysiert werden. Der etikettenfreie Ansatz bietet eine kostengünstige Alternative zu etikettenbasierten Ansätzen. Hunderte von Patientenproben, die zu einer bestimmten Kohorte gehören, können analysiert und mit anderen Kohorten basierend auf klinischen Merkmalen verglichen werden. Hier haben wir einen optimierten quantitativen Proteomik-Workflow für Gewebeproben unter Verwendung von markierungsfreien und markierungsbasierten Proteom-Profiling-Methoden beschrieben, der für Anwendungen in den Biowissenschaften, insbesondere für Projekte auf Biomarker-Entdeckung, von entscheidender Bedeutung ist.

Wir haben zwei verschiedene Ansätze für die Entdeckungsproteomik verwendet: markierungsfreie und markierungsbasierte Proteomik-Ansätze. Das Proteinprofil von Gewebeproben auf SDS-PAGE zeigte die intakten Proteine und konnte für die proteomische Analyse in Betracht gezogen werden (Abbildung 2A). Die Qualitätskontrolle des Instruments wurde über eine Systemeignungssoftware überwacht und zeigte die tagesmäßige Variation der Geräteleistung auf (Abbildung 2...

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Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Das beschriebene Protokoll bietet eine optimierte quantitative Proteomik-Analyse von Gewebeproben mit zwei Ansätzen: markierungsbasierte und markierungsfreie Quantifizierung. Markierungsbasierte Ansätze haben den Vorteil einer genaueren Quantifizierung von Proteinen, während ein markierungsfreier Ansatz kostengünstiger ist und zur Analyse von Hunderten von Proben einer Kohorte verwendet wird.

Umfassender Workflow der massenspektrometrischen Schrotflintenproteomik von Gewebeproben

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Genaue quantitative Messungen von Proteinen sind entscheidend, um die dynamische und räumliche Zusammenarbeit zwischen Proteinen zu verstehen, um die Krankheit zurück in die Biologie zu verstehen. Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, einen integrierten quantitativen Proteomik-Workflow für Gewebeproben bereitzustellen, der markierungsfreies und markierungsbasiertes Proteinprofiling für die Biomarker-Entdeckung kombiniert. In dieser Studie haben wir das Instrument Orbitrap Fusion verwendet, um die Proteine mit markierungsbasierten und markierungsfreien Ansätzen zu quantifizieren.Die Gewebelyse ist einer der wichtigsten Schritte für den Erfolg eines LC-MS-MS-Experiments. Nehmen Sie 30 mg Gewebe in einem Perlenschlagröhrchen. Nach dem Waschen mit dem PBS 300 Mikroliter Harnstofflysepuffer mit acht molaren Harnstoff, Tris, NaCl und MgCl2 hinzufügen.Mit einem Sondenschallator wird der Inhalt des Gewebes lysiert. Wiederholen Sie dies für einen weiteren Zyklus. Wenn Sie intaktes Gewebe am Boden der Röhre beobachten, fügen Sie Zirkoniumperlen in die Röhre hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Perlenschläger für 90 Sekunden, mit fünf Minuten Inkubation auf Eis.Zentrifugieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius um 6000 G, um die Zellreste vom Überstand zu trennen. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen und mischen Sie die Lösung gleichmäßig. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration im Gewebelysat mit Bradford-Reagenz.Messen Sie dazu den OD der Probe bei 595 Nanometer und extrapolieren Sie ihn mit einem Standarddiagramm, wie auf diesem Bildschirm gezeigt. Nach der Proteinquantifizierung lassen Sie 10 Mikrogramm Gewebelysat auf 12% SDS-PAGE-Gel laufen, um die Qualität der Lysate zu überprüfen. Der erste Schritt bei der Aufschluss in Lösung beinhaltet die Reduzierung von Disulfidbindungen mit TCEP.Nach der Zugabe von TCEP den Inhalt der Tube für eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Der nächste Schritt beinhaltet die Alkylierung, um zu verhindern, dass sich die reduzierten Disulfidbindungen neu bilden. Fügen Sie ein Alkylierungsmittel wie Jodacetamid hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang im Dunkeln.Senken Sie nach der Inkubation die Endkonzentration von Harnstoff auf weniger als ein Mol, indem Sie mit vier bis acht Volumina Verdünnungspuffer verdünnen. An dieser Stelle ist es ratsam, den pH-Wert zu überprüfen. Der nächste Schritt beinhaltet die Zugabe von Trypsin zum Röhrchen und die Inkubation des Röhrchens über Nacht für eine effiziente Verdauung.Am nächsten Tag trocknen Sie die verdauten Peptide in einem Vakuumkonzentrator ab und fahren mit dem Entsalzungsschritt fort. Um die Entsalzung von Peptiden durchzuführen, verwenden Sie C18-Stufenspitzen. Aktivieren Sie die C18-Stufenspitze, indem Sie 50 Mikroliter Methanol hinzufügen, zentrifugieren Sie die Spitze zwei Minuten lang bei 1000 G.Fügen Sie nun 50 Mikroliter Acetonitril in 0,1% Ameisensäure hinzu, um die Bühnenspitze zu waschen, und zentrifugieren Sie die Spitze erneut. Rekonstituieren Sie die getrockneten verdauten Peptide in 50 Mikrolitern 0,1% Ameisensäure. Fügen Sie die rekonstituierten Peptide in die aktivierte Stadiumspitze hinzu.Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens viermal. Um die Probe zu waschen, fügen Sie 50 Mikroliter 0,1% Ameisensäure hinzu und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Für die Elution von Peptiden fügen Sie 50 Mikroliter 40% ACN in 0,1% Ameisensäure hinzu und führen Sie es durch Zentrifugation durch die Stufenspitze.Wiederholen Sie diesen Schritt mit 50% und 60% ACN in 0,1% Ameisensäure und sammeln Sie das Filtrat in einem frischen Röhrchen. Trocknen Sie die entsalzten Peptide mit einem Vakuumkonzentrator. Quantifizieren Sie vor dem LC-MS-Lauf die Peptide mit der Scopes-Methode.Laden Sie dazu zwei Mikroliter rekonstituierter Probe in den Brunnen einer Mikrotropfenplatte und messen Sie die Absorption bei 205 Nanometern und 280 Nanometern. Berechnen Sie die Konzentration aus der auf dieser Folie beschriebenen Formel. Sobald die entsalzten Peptide getrocknet sind, sind sie bereit für die markierungsbasierte Quantifizierung.Für die iTRAQ-Markierung müssen die getrockneten Peptide in 20 Mikroliter Auflösungspuffer rekonstituiert werden, der im iTRAQ-Markierungskit enthalten ist. Rekonstituieren Sie die Etiketten, indem Sie Ethanol aus der im Kit enthaltenen Durchstechflasche hinzufügen und gründlich mischen. Es ist ratsam, dass alle Schritte gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden.Fügen Sie die homogen gemischten iTRAQ-Etiketten zu ihren jeweiligen Röhrchen hinzu und lassen Sie die Markierungsreaktion stattfinden. Am Ende der Reaktion löschen Sie überschüssiges ungebundenes Etikett in der Tube durch Zugabe von MS-Wasser und inkubieren Sie es für eine halbe Stunde bis eine Stunde. Nun den gesamten markierten Inhalt in eine einzige Tube geben und die markierten Peptide trocknen.Nachdem Sie die Proben in 0,1% Ameisensäure rekonstituiert haben, öffnen Sie den Autosampler von NanoLC und legen Sie die Proben in den Autosampler. Nachdem die Proben in den Autosampler gelegt wurden, ist es wichtig, die richtigen Parameter für die Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie einzustellen. Hier beschreiben wir die Parameter sowohl für die markierungsfreie Quantifizierung als auch für die iTRAQ-basierte Quantifizierung mittels LC-MS.Im Falle einer markierungsfreien Quantifizierung wurde ein Gradient von 120 Minuten verwendet, da eine einzelne unfraktionierte Probe injiziert wird. Diese Dauer kann je nach Probenkomplexität erhöht oder verringert werden. In diesem Experiment wurde ein Fluss von 300 Nanolitern pro Minute mit dem folgenden Gradienten für Lösung B eingestellt, der in diesem Fall 80% Acetonitril in 1% Ameisensäure ist.Auf die gleiche Weise können wir einen Gradienten für ein iTRAQ-Experiment festlegen. Da die Proben nicht verletzt sind, wurde ein 90-minütiger Gradient verwendet. Die MS-Parameter sowohl für die markierungsfreie Quantifizierung als auch für die iTRAQ-markierungsbasierte Quantifizierung können hier eingesehen werden.Der erste Schritt besteht darin, den Anwendungsmodus durch Klicken auf die globalen Parameter einzustellen. Wählen Sie den Peptidmodus aus und legen Sie die Methodendauer gemäß dem verwendeten LC-Gradienten fest. Definieren Sie die Scanparameter für das Experiment.Wenn Sie auf die Option MS-OT klicken, werden die Parameter sichtbar. Der verwendete Detektortyp ist auf Orbitrap festgelegt. Die andere Option, die auf diesem Instrument verfügbar ist, beinhaltet eine Ionenfalle.Die Auflösung wurde auf 60.000 eingestellt, und man kann je nach Bedarf und Art des Experiments zwischen verschiedenen verfügbaren Optionen wählen. Der Massenbereich ist normal, und der Scanbereich ist von 375 bis 1700 eingestellt. Die anderen Parameter sind Standard für MS Application.Die Intensitätsschwelle wurde festgelegt und der Ladezustand im Bereich von zwei bis sechs festgelegt. Der dynamische Ausschluss wurde auf 40 Sekunden festgelegt, und die Massentoleranz wurde auf 10 gehalten. Der nächste Parametersatz enthält die MS-MS-Parameter.Der Isolationsmodus wurde mit Quadrupol ausgewählt, das Isolationsfenster auf zwei gesetzt, der Isolationsversatz wurde deaktiviert und der Aktivierungstyp ist normalerweise HCD für das Proteomik-Experiment. Die Kollisionsenergie kann entweder fixiert oder unterstützt werden. Markierte Proben benötigen höhere Kollisionsenergien, daher ist es für iTRAQ-Experimente ratsam, die Kollisionsenergie auf 35 einzustellen, während sie für LFQ-Experimente auf 30 eingestellt werden kann.Der hier verwendete Detektortyp ist Orbitrap. Der Scanbereichsmodus ist automatisch. Die anderen Parameter sind Standard für iTRAQ-Experimente und markierungsfreie quantitative Experimente.Ein Klick auf die Zusammenfassung gibt einen Überblick über alle LC- und MS-Parameter, die für das Experiment verwendet wurden. Sie können sich jeden einzelnen Parameter ansehen und das Korrekturlesen durchführen. Sobald dies erledigt ist, klicken Sie auf die Datei und speichern Sie sie als Methodendatei.Sobald Sie gespeichert haben, können Sie die Methode ausführen, und Sie erhalten die Rohdateien. Und dann können diese Rohdateien mit der Proteome Discoverer-Software analysiert werden. Diese Abbildung zeigt die Sequenzabdeckung von BSA in drei technischen Replikaten, die in den drei Replikaten 91% beträgt.Dies gibt die Reproduzierbarkeit des Instruments an. Diese Abbildung zeigt nun die Gleichmäßigkeit der Anzahl der Peptidspektralabgleiche, Peptide und Proteine, die in drei verschiedenen biologischen Proben identifiziert wurden, was wiederum eine Vorstellung von der Reproduzierbarkeit des Instruments gibt. Hier stellt das Venn-Diagramm die gemeinsamen und exklusiven Proteine dar, die in drei verschiedenen Proben in markierungsfreien Experimenten und markierungsbasierten Experimenten identifiziert wurden.Diese Balkendiagramme zeigen die Anzahl der Peptidspektralübereinstimmungen, Peptidgruppen, Gesamtproteine, Proteingruppen und Proteinanzahl nach 1% FDR, die im LFQ- und iTRAQ-Experiment identifiziert wurden. Die Gewebeproteomik biologischer Proben ermöglicht es uns, neue potenzielle Biomarker zu erforschen, die mit verschiedenen Stadien des Krankheitsverlaufs verbunden sind. Das beschriebene Protokoll für die quantitative Proteomanalyse von Gewebe liefert reproduzierbare gute Abdeckungsdaten.Der Einsatz von technischen Replikaten gewährleistet eine gute Reproduzierbarkeit, auch wenn die Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten ausgeführt werden. Hier haben wir die Analyse von Gewebeproben mit zwei Quantifizierungsmethoden gezeigt: markierungsfreie und markierungsbasierte Proteomik. Die Auswahl quantitativer proteomischer Techniken kann von der Anzahl der Proben, der Verfügbarkeit von MS-Plattformen und der zu behandelnden biologischen Frage abhängen.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Forschung

Biologie

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound Mass Spectrometry - Ein leistungsfähiges Tool zum Identifizieren Novel c-di-GMP Effektorproteinen

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Umfassenden Workflow zur genomweiten Identifizierung und Ausdruck Meta-Analyse von der ATL E3 Ubiquitin Ligase Genfamilie in Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...