Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

אנו מכירים בפרויקט MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), פרויקט #34_IITB למתקן SS ו- MASSFIITB ב- IIT בומביי הנתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (BT / PR13114/ INF / 22/206/2015) לביצוע כל הניסויים הקשורים ל- MS.

מחקר זה נבדק ואושר על ידי ועדות בדיקה מוסדיות וועדת האתיקה של המכון ההודי לטכנולוגיה בומביי (IITB-IEC/2016/026). המטופלים/המשתתפים סיפקו את הסכמתם בכתב להשתתף במחקר זה.
1. הכנת ליסאט רקמות
הערה: בצע את כל השלבים הבאים על הקרח כדי לשמור על הפרוטאזים לא פעילים. וד...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

פרוטאומייקה של רקמות של דגימות ביולוגיות מאפשרת לנו לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים הקשורים לשלבים שונים של התקדמות המחלה. זה גם מסביר את מנגנון האיתות והמסלולים הקשורים להתקדמות המחלה. הפרוטוקול המתואר לניתוח פרוטאומי כמותי של רקמות מספק נתוני כיסוי טובים לשחזור. רוב השלבים הו...

טכנולוגיות פרוטאומיקס יש פוטנציאל לאפשר זיהוי וכימות של סמנים מועמד פוטנציאליים שיכולים לסייע באיתור וחיזוי של המחלה1. ההתקדמות האחרונה בתחום ספקטרומטריית המסה האיצה את המחקר הקליני ברמת החלבון. חוקרים מנסים להתמודד עם האתגר של פתוביולוגיה מסובכת של מספר מחלות באמצעות פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית, אשר מציעה כעת רגישות מוגברת לזיהוי וכימות חלבונים2. מדידה כמותית מדויקת של חלבונים חיונית להבנת שיתוף הפעולה הדינמי והמרחבי בין חלבונים אצל אנשים בריאים וחולים3; עם זאת, ניתוח כזה בקנה מידה רחב פרוטאום אינו קל.
מגבלה מרכזית אחת של פרופיל פרוטאומי של דגימות קליניות היא המורכבות של דגימות ביולוגיות. סוגים רבים ושונים של דגימות נחקרו כדי לחקור את פרוטאום המחלה, כגון קווי תאים, פלזמה, ורקמות4,5. קווי תאים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים בניסויי במבחנה כדי לחקות שלבים שונים של התקדמות המחלה. עם זאת, מגבלה מרכזית אחת עם קווי תאים היא שהם רוכשים בקלות שינויים גנוטיפיים ופנוטיפיים במהלך התהליך של תרבית התא6. נוזלי גוף כגון פלזמה יכולים להיות מקור אטרקטיבי לגילוי סמן ביולוגי; עם זאת, בשל חלבונים שופעים מאוד ואת הטווח הדינמי של ריכוז חלבון, פרוטאומיקה פלזמה הוא קצת יותר מאתגר7. כאן, פפטידים שמקורם בחלבונים הנפוצים ביותר יכולים לדכא את אלה שמקורם בחלבונים השופעים הנמוכים גם אם יחס המסה /מטען זהה ל-6. למרות שהיו התקדמות בטכנולוגיות דלדול ופירוק בשנים האחרונות, קבלת כיסוי טוב עדיין נותר מגבלה גדולה של פרוטאומיקספלזמה 8,9. השימוש ברקמות לחקירה פרוטאומית של ביולוגיה של המחלה עדיף שכן דגימות רקמה הן הקרובות ביותר לאתרי המחלה ומציעות מידע פיזיולוגי ופתולוגי גבוה כדי לספק תובנות טובות יותר על ביולוגיית המחלה10,11.
בכתב יד זה, סיפקנו פרוטוקול פשוט יותר עבור פרוטאומיקה כמותית של דגימות רקמה. השתמשנו במאגר המכיל 8 M אוריאה להכנת ליסאט רקמה כמו חוצץ זה תואם עם חקירות מבוססות ספקטרומטריית מסה. עם זאת, חובה לנקות את הפפטידים כדי להסיר מלחים לפני הזרקת אותם לתוך ספקטרומטר המסה. נקודה חשובה לזכור היא להפחית את ריכוז אוריאה לפחות מ 1 M לפני הוספת טריפסין לעיכול חלבון כמו טריפסין תערוכות פעילות נמוכה בריכוז 8 M אוריאה. הסברנו שתי גישות של פרוטאומיקה גלובלית כמותית: כימות מבוסס תווית באמצעות iTRAQ (תגים איזובריים לכימות יחסית ומוחלטת) וכימות ללא תוויות (LFQ). הפרוטאומיקה הכמותית המבוססת על iTRAQ משמשת בעיקר להשוואת דגימות מרובות המשתנות במצבן הביולוגי (למשל, נורמלי לעומת מחלה או דגימות מטופלות). הגישה משתמשת ריאגנטים איזובריים כדי לתייג את אמינים ראשיים N-terminal של פפטידים12. ריאגנטים iTRAQ מכילים קבוצת כתבים N-מתיל פיפראזין אחת, קבוצת מאזן, וקבוצת אסתר תמציתית N-הידרוקסית שמגיבה עם אמינים ראשוניים N-terminal של פפטידים13. פפטידים מעוכלים מכל תנאי מסומנים עם ריאגנט iTRAQ מסוים. לאחר התיוג, התגובה נעצרת ו מתויג פפטידים מתנאים שונים מחולקים לתוך צינור אחד. תערובת מדגם משולבת זו מנותחת על ידי ספקטרומטר מסה לזיהוי וכימות. לאחר ניתוח MS / MS, רסיסי יונים עיתונאיים עם מסות מולקולריות נמוכות נוצרים ועוצמות היונים של יונים עיתונאיים אלה משמשות לכימות החלבונים.
גישה נוספת, כימות ללא תוויות משמש כדי לקבוע את המספר היחסי של חלבונים בדגימות מורכבות מבלי לסמן פפטידים עם איזוטופים יציבים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסה הביאה לניתוח פרוטאומי עמוק יחד עם יצירת ערכות נתונים חזקות ושחזוריות. עם זאת, למרות ההתקדמות הטכנית ניכרת, הכנת מדגם מ biospecimens כגון דם המטופל, CSF, ורקמות עדיין מציב אתגרים ניכרים. לזיהוי סמנים ביולוגיים, פרוטאומיקה של רקמות מספקת לעתים קרובות מקור מדגם אטרקטיבי לתרגום ממצאי המחקר מהספסל למרפאה. זה יכול לחשוף סמנים ביולוגיים מועמד פוטנציאלי לאבחון מוקדם של סרטן ומחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, וכו '. פרוטאומייקה של רקמות גם מניבה שפע של מידע מערכתי המבוסס על שפע החלבונים ומסייעת לענות על שאלות ביולוגיות מעניינות.
ניתן לקבץ ניתוח פרוטאומיה כמותית לשתי קטגוריות רחבות: גישה מבוססת תוויות וגישה נטולת תוויות. בגישה המבוססת על תוויות, חלבונים או פפטידים מסומנים באמצעות איזוטופים יציבים כגון SILAC (תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו בתרבות התאים) או על ידי תגים כימיים כגון ICAT (תגי זיקה מקודדים איזוטופ), TMT (תג מסה דו-מושבי) או iTRAQ (תג איזוברי לכמות יחסית ומוחלטת). גישות מבוססות תוויות יש את היתרון של כמות מדויקת יותר של חלבונים באמצעות תוויות איזובריות, דגימות מרובות ניתן לנתח בניסוי אחד. הגישה נטולת התוויות מספקת חלופה חסכונית לגישות מבוססות תוויות. ניתן לנתח ולהשוות מאות דגימות מטופלים השייכות לקבוצה מסוימת ולהשוותן לקבוצות אחרות המבוססות על תכונות קליניות. כאן, תיארנו זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ממוטבת עבור דגימות רקמה באמצעות שיטות פרופיל פרוטאום ללא תוויות ומבוססות תוויות, החיוניות ליישומים במדעי החיים, במיוחד פרויקטים מבוססי גילוי סמנים ביולוגיים.

השתמשנו בשתי גישות שונות לגילוי פרוטאומיקס: גישות פרוטאומיות ללא תוויות ומבוססות תוויות. פרופיל החלבון של דגימות רקמות ב-SDS-PAGE הראה את החלבונים השלמים וניתן לשקול אותו לניתוח פרוטאומי(איור 2A). בדיקת בקרת האיכות של המכשיר הייתה מנוטרת באמצעות תוכנת התאמת מערכת והיא הר?...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

הפרוטוקול המתואר מספק ניתוח פרוטאומי כמותי ממוטב של דגימות רקמה באמצעות שתי גישות: כמות מבוססת תווית וללא תווית. לגישות מבוססות תוויות יש יתרון של כמות מדויקת יותר של חלבונים, בעוד שגישה נטולת תוויות חסכונית יותר ומשמשת לניתוח מאות דגימות של קבוצה.

זרימת עבודה מקיפה של פרוטאומיקת רובה ציד מבוססת ספקטרומטריה של דגימות רקמה

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

מדידות כמותיות מדויקות של חלבונים חיוניות להבנת שיתוף הפעולה הדינמי והמרחבי בין חלבונים כדי להבין את המחלה בחזרה לביולוגיה. המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לספק זרימת עבודה משולבת של פרוטאומיה כמותית עבור דגימות רקמות, המשלבת פרופיל חלבון ללא תוויות ומבוסס תווית לגילוי סמן ביולוגי. במחקר זה, השתמשנו במכשיר Orbitrap Fusion כדי לכמת את החלבונים באמצעות גישות מבוססות תוויות וללא תוויות.תמה רקמה היא אחד הצעדים המכריעים ביותר להצלחת ניסוי LC-MS-MS. קח 30 מ"ג של רקמה בצינור להכות חרוזים. לאחר הכביסה עם PBS, להוסיף 300 microliter של חוצץ אוריאה תמוגה המכיל שמונה אוריאה טוחנת, טריס, NaCl ו MgCl2.באמצעות sonicator בדיקה, ליזה את התוכן של הרקמה. חזור על כך למחזור אחר. אם אתה מתבונן בכל רקמה שלמה בתחתית הצינור, להוסיף חרוזי זירקוניום לצינור הומוגניזציה הרקמה באמצעות מקצף חרוזים במשך 90 שניות, עם חמש דקות דגירה על קרח.צנטריפוגה הדגימות סביב 6000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד את פסולת התא מן supernatant. אוספים את הסופר-נט בצינור טרי ומערבבים את התמיסה באופן אחיד. לכמת את ריכוז החלבון ברקמות lysate באמצעות ריאגנט ברדפורד.בשביל זה, למדוד את OD של המדגם ב 595 ננומטר ולהסיק אותו באמצעות גרף סטנדרטי כפי שמוצג על מסך זה. לאחר כימות החלבון, הפעל 10 מיקרוגרם של ליסאט רקמות על ג'ל 12%SDS-PAGE כדי לבדוק את איכות lysates. השלב הראשון בעיכול בתמיסה כרוך בהפחתת קשרים דיסולפידים, באמצעות TCEP.לאחר תוספת של TCEP, לדגור על התוכן של הצינור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. השלב הבא כרוך אלקילציה כדי למנוע את הקשרים דיסולפיד מופחתים מלהיווצר מחדש. מוסיפים חומר אלקילטינג כמו iodoacetamide ודגרה הצינור בחושך במשך 10 דקות.לאחר הדגירה, להוריד את הריכוז הסופי של אוריאה לפחות טוחנת אחת על ידי דילול עם ארבעה עד שמונה כרכים של חוצץ דילול. בשלב זה, מומלץ לבדוק את ה- pH. השלב הבא כרוך בתוספת טריפסין לצינור, ודגורת הצינור בן לילה לעיכול יעיל.למחרת, יבשו את הפפטידים המעוכלים ברכז ואקום, והמשיכו לשלב התפלה. כדי לבצע התפלת פפטידים, השתמש בעצות שלב C18. הפעל את קצה שלב C18 על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מתנול, צנטריפוגה הקצה ב 1000 G במשך שתי דקות.עכשיו, להוסיף 50 מיקרוליטר של acetonitrile ב 0.1% חומצה פורמית לשטוף את קצה הבמה, ושוב, צנטריפוגה הקצה. ליישב מחדש את הפפטידים המיובשים ב-50 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית. הוסיפו את הפפטידים המחודשים לקצה הבמה הפעיל.חזור על שלב זה לפחות ארבע פעמים. כדי לשטוף את המדגם, להוסיף 50 microliter של 0.1% חומצה פורמית, ולחזור על שלב צנטריפוגה. לתמונת פפטידים, הוסיפו 50 מיקרוליטר של 40% ACN בחומצה פורמית של 0.1%, והעבירו אותו דרך קצה הבמה בצנטריפוגה.חזור על שלב זה עם 50% ו 60% ACN ב 0.1% חומצה פורמית ולאסוף את הסינון בצינור טרי. יבשו את הפפטידים המותפלים באמצעות רכז ואקום. לפני ריצת LC-MS-MS, לכמת את הפפטידים באמצעות השיטה Scopes.בשביל זה, לטעון שני microliters של מדגם reconstituted בבאר של צלחת microdrop, ולמדוד את הספיגה ב 205 ננומטר ו 280 ננומטר. חשב את הריכוז מהנוסחה המתוארת בשקופית זו. ברגע הפפטידים המותפלים מיובשים, הם מוכנים לכימות מבוסס תווית.עבור תיוג iTRAQ, יש לשחזר את הפפטידים היבשים ב-20 מיקרו-ליטר של מאגר פירוק, המסופק בערכת התוויות של iTRAQ. ליישב מחדש את התוויות על ידי הוספת אתנול מהחינתון המסופק בערכה, ומערבבים היטב. מומלץ כי כל הצעדים להתבצע בהתאם להוראות היצרן.הוסף את תוויות iTRAQ המעורבות הומוגניות לצינורות המתאימים שלהם ולאפשר את תגובת התיוג להתרחש. בסוף התגובה, להרוות כל תווית לא מאוגדת עודף בצינור על ידי הוספת מים ברמה MS, ודגרה במשך חצי שעה עד שעה אחת. עכשיו, להעביר את כל התוכן המסומן לתוך צינור אחד ולייבש את הפפטידים המסומנים.לאחר שחזור הדגימות בחומצה פורמית של 0.1%, פתחו את הדגימה האוטומטית של NanoLC, והכניסו את הדגימות לתוך הדגימה האוטומטית. לאחר הדגימות הונחו בדגימה האוטומטית, חשוב להגדיר את הפרמטרים הנכונים עבור כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה. כאן, אנו מתארים את הפרמטרים הן עבור כמות ללא תוויות והן עבור כימות מבוסס iTRAQ באמצעות LC-MS.במקרה של כמות ללא תוויות, מעבר צבע של 120 דקות שימש כדגימה אחת לא מנוצלת מוזרקת. משך זמן זה ניתן להגדיל או להקטין בהתבסס על המורכבות המדגם. בניסוי זה, זרימה של 300 ננו-liter לדקה נקבעה עם השיפוע הבא עבור פתרון B, שהוא 80% acetonitrile ב 1%חומצה פורמית, במקרה זה.באותו אופן, אנחנו יכולים להגדיר הדרגתי לניסוי iTRAQ. מאחר שהדגימות אינן מופרות, נעשה שימוש במעבר צבע של 90 דקות. ניתן לראות כאן את הפרמטרים של MS עבור כימות ללא תוויות, כמו גם כימות מבוסס תווית iTRAQ.השלב הראשון כרוך בהגדרת מצב היישום על-ידי לחיצה על הפרמטרים הכלליים. בחרו במצב פפטיד והגדירו את משך פעולת השירות לפי מעבר הצבע של LC הנמצא בשימוש. הגדר את פרמטרי הסריקה עבור הניסוי.בלחיצה על האפשרות MS-OT, הפרמטרים הופכים גלויים. סוג הגלאי בשימוש מוגדר Orbitrap. האפשרות האחרת הזמינה במכשיר זה כוללת מלכודת יונים.הרזולוציה הוגדרה ל- 60,000, וניתן לבחור בין אפשרויות שונות הזמינות, בהתאם לצורך ולסוג הניסוי. טווח המסה הוא נורמלי, וטווח הסריקה מוגדר בין 375 ל-1700. הפרמטרים האחרים הם ברירת המחדל עבור יישום MS.סף האינטנסיביות נקבע, ומצב הטעינה נקבע בטווח של שניים עד שישה. אי-הכללה דינמית נקבעה ל-40 שניות, והסובלנות ההמונית נשמרה ל-10. ערכת הפרמטרים הבאה כוללת את הפרמטרים MS-MS.מצב הבידוד נבחר עם quadrupole, חלון בידוד מוגדר בשתיים, היסט בידוד הוגדר כבוי, וסוג ההפעלה הוא בדרך כלל HCD לניסוי proteomics. אנרגיית התנגשות יכולה להיות קבועה, או שניתן לסייע בה. דגימות מסומנות דורשות אנרגיות התנגשות גבוהות יותר, ולכן, עבור ניסויי iTRAQ, מומלץ כי אנרגיית ההתנגשות להיות מוגדרת 35, בעוד עבור ניסויי LFQ, זה יכול להיות מוגדר 30.סוג הגלאי המשמש כאן הוא Orbitrap. מצב טווח סריקה יהיה אוטומטי. הפרמטרים האחרים הם ברירת המחדל לניסויי iTRAQ וניסוי כמותי ללא תוויות.לחיצה על הסיכום תספק סקירה כללית של כל הפרמטרים LC ו- MS המשמשים לניסוי. אתה יכול להעיף מבט על כל פרמטר ולעשות את ההגהה. לאחר שזה נעשה, ואז לחץ על הקובץ ולשמור אותו כקובץ שיטה.לאחר השמירה, אז אתה יכול להפעיל את השיטה, ואתה תקבל את הקבצים הגולמיים. ואז ניתן לנתח את הקבצים הגולמיים האלה באמצעות תוכנת Proteome Discoverer. איור זה מציג את כיסוי הרצף של BSA בשלושה שכפולים טכניים, שהם 91% בשלושת המשכפלים.זה מציין את יכולת הרבייה של המכשיר. עכשיו, נתון זה מראה את האחידות במספר הגפרורים הספקטרליים הפפטידים, הפפטידים והחלבונים שזוהו בשלוש דגימות ביולוגיות שונות, אשר, שוב, נותן מושג על רבייה של המכשיר. כאן, דיאגרמת ון מייצגת את החלבונים הנפוצים והבלעדיים שזוהו בשלוש דגימות שונות בניסוי ללא תוויות וניסוי מבוסס תוויות.תרשימי עמודות אלה מציגים את מספר הגפרורים הספקטרליים הפפטידים, קבוצות הפפטידים, סך החלבונים, קבוצות החלבון ומספר החלבון לאחר 1%FDR, שזוהו בניסוי LFQ ו- iTRAQ. פרוטאומייקה של רקמות של דגימות ביולוגיות מאפשרת לנו לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים הקשורים לשלבים שונים של התקדמות המחלה. הפרוטוקול המתואר לניתוח פרוטאומי כמותי של רקמות מספק נתוני כיסוי טובים לשחזור.שימוש בשכפולים טכניים מבטיח יכולת רבייה טובה, גם אם הדגימות מופעלות בנקודות זמן שונות. כאן, הראינו את הניתוח של דגימות רקמה באמצעות שתי שיטות כמות: ללא תווית ופרוטומיה מבוססת תווית. בחירת טכניקות פרוטאומיות כמותיות עשויה להיות תלויה במספר הדגימות, הזמינות של פלטפורמות MS ושאלה ביולוגית שיש לטפל בהן.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

מלמטה למעלה ופרוטאומיקה Shotgun לזהות מקיף שבלול Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

זרימת עבודה מקיפה עבור הביטוי מטא אנליזה ATL E3 אוביקוויטין ליגאז ג'ין משפחת גפן וזיהוי הגנום כולו

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...