Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
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Riconosciamo mhrd-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), progetto #34_IITB a SS e MASSFIITB Facility presso IIT Bombay supportato dal Dipartimento di Biotecnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) per effettuare tutti gli esperimenti relativi alla SM.

Questo studio è stato esaminato e approvato dai comitati di revisione istituzionali e dal comitato etico dell'Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). I pazienti/partecipanti hanno fornito il loro consenso scritto a partecipare a questo studio.
1. Preparazione del lisito tissutale
NOTA: eseguire tutti i seguenti passaggi sul ghiaccio per mantenere inattive le proteasi. Assicurarsi che i bisturi e gli eventuali tubi utilizzati siano ...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

La proteomica tissutale di campioni biologici ci consente di esplorare nuovi potenziali biomarcatori associati a diversi stadi di progressione della malattia. Spiega anche il meccanismo di segnalazione e le vie associate alla progressione della malattia. Il protocollo descritto per l'analisi proteomica quantitativa dei tessuti fornisce dati riproducibili di buona copertura. La maggior parte dei passaggi sono stati adattati dalle istruzioni del produttore. Per ottenere dati di alta qualità, i seguenti passaggi sono fonda...

Le tecnologie di proteomica hanno il potenziale per consentire l'identificazione e la quantificazione di potenziali marcatori candidati che possono aiutare nella rilevazione e nella prognosi della malattia1. I recenti progressi nel campo della spettrometria di massa hanno accelerato la ricerca clinica a livello proteico. I ricercatori stanno cercando di affrontare la sfida della patobiologia complicata di diverse malattie utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa, che ora offre una maggiore sensibilità per l'identificazione e la quantificazione delle proteine2. Una misurazione quantitativa accurata delle proteine è fondamentale per comprendere la cooperazione dinamica e spaziale tra le proteine in individui sani e malati3; tuttavia, tale analisi su scala proteoma non è facile.
Uno dei principali limiti della profilazione proteomica dei campioni clinici è la complessità dei campioni biologici. Molti diversi tipi di campioni sono stati studiati per studiare il proteoma della malattia, come linee cellulari, plasma e tessuti4,5. Le linee cellulari sono ampiamente utilizzate come modelli in esperimenti in vitro per imitare diversi stadi di progressione della malattia. Tuttavia, una delle principali limitazioni con le linee cellulari è che acquisiscono facilmente cambiamenti genotipici e fenotipici durante il processo di coltura cellulare6. I fluidi corporei come il plasma potrebbero essere una fonte interessante per la scoperta di biomarcatori; tuttavia, a causa delle proteine molto abbondanti e della gamma dinamica di concentrazione proteica, la proteomica plasmatica è un po 'più impegnativa7. Qui, i peptidi originati dalle proteine più abbondanti possono sopprimere quelli derivati dalle proteine a bassa abbondanza anche se il rapporto massa/carica è lo stesso6. Sebbene ci siano stati progressi nelle tecnologie di esaurimento e frazionamento negli ultimi anni, ottenere una buona copertura rimane ancora una delle principali limitazioni della proteomicaplasmatica 8,9. L'uso di tessuti per l'indagine proteomica della biologia della malattia è preferito in quanto i campioni di tessuto sono più prossimali ai siti di malattia e offrono elevate informazioni fisiologiche e patologiche per fornire migliori informazioni sulla biologia della malattia10,11.
In questo manoscritto, abbiamo fornito un protocollo semplificato per la proteomica quantitativa di campioni di tessuto. Abbiamo utilizzato un tampone contenente 8 M di urea per la preparazione del lisato tissutale in quanto questo tampone è compatibile con le indagini basate sulla spettrometria di massa. Tuttavia, è obbligatorio pulire i peptidi per rimuovere i sali prima di iniettarli nello spettrometro di massa. Un punto importante da ricordare è quello di ridurre la concentrazione di urea a meno di 1 M prima di aggiungere tripsina per la digestione delle proteine poiché la tripsina mostra una bassa attività a 8 M di concentrazione di urea. Abbiamo spiegato due approcci di proteomica globale quantitativa: la quantificazione basata su etichette utilizzando iTRAQ (tag isobarici per la quantificazione relativa e assoluta) e la quantificazione senza etichetta (LFQ). La proteomica quantitativa basata su iTRAQ viene utilizzata principalmente per confrontare più campioni che variano nelle loro condizioni biologiche (ad esempio, campioni normali rispetto a campioni di malattia o trattati). L'approccio utilizza reagenti isobarici per etichettare le ammine primarie N-terminali dei peptidi12. I reagenti iTRAQ contengono un gruppo reporter N-metil piperazina, un gruppo bilanciatore e un gruppo estere N-idrossi succinimide che reagisce con le ammine primarie N-terminali dei peptidi13. I peptidi digeriti da ciascuna condizione sono etichettati con un particolare reagente iTRAQ. Dopo l'etichettatura, la reazione viene interrotta e i peptidi etichettati da diverse condizioni vengono raggruppati in un singolo tubo. Questa miscela di campioni combinati viene analizzata dallo spettrometro di massa per l'identificazione e la quantificazione. Dopo l'analisi MS/MS, vengono generati frammenti ioniche reporter con basse masse molecolari e le intensità ioniche di questi ioni reporter vengono utilizzate per la quantificazione delle proteine.
Un altro approccio, la quantificazione senza etichetta, viene utilizzato per determinare il numero relativo di proteine in campioni complessi senza etichettare peptidi con isotopi stabili.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

I recenti progressi nella spettrometria di massa hanno portato a un'analisi proteomica profonda insieme alla generazione di set di dati robusti e riproducibili. Tuttavia, nonostante i notevoli progressi tecnici, la preparazione del campione da parte di biocampimenti come il sangue del paziente, il CSF e il tessuto pone ancora sfide considerevoli. Per identificare i biomarcatori, la proteomica tissutale spesso fornisce un'interessante fonte di campioni per tradurre i risultati della ricerca dal banco alla clinica. Può rivelare potenziali biomarcatori candidati per la diagnosi precoce del cancro e delle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, ecc. La proteomica tissutale produce anche una ricchezza di informazioni sistemiche basate sull'abbondanza di proteine e aiuta ad affrontare interessanti questioni biologiche.
L'analisi proteomica quantitativa può essere raggruppata in due grandi categorie: un approccio basato su etichette e un approccio privo di etichette. Nell'approccio basato sull'etichetta, le proteine o i peptidi sono etichettati utilizzando isotopi stabili come SILAC (etichettatura isotopica stabile con amminoacidi in coltura cellulare) o da tag chimici come ICAT (tag di affinità codificati con isotopi), TMT (tag di massa tandem) o iTRAQ (tag isobarico per la quantificazione relativa e assoluta). Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine e utilizzando etichette isobariche, è possibile analizzare più campioni in un singolo esperimento. L'approccio senza etichette fornisce un'alternativa economica agli approcci basati sulle etichette. Centinaia di campioni di pazienti appartenenti a una particolare coorte possono essere analizzati e confrontati con altre coorti in base alle caratteristiche cliniche. Qui, abbiamo descritto un flusso di lavoro di proteomica quantitativa ottimizzato per campioni di tessuto utilizzando metodi di profilazione del proteoma privi di etichette e basati su etichette, che è fondamentale per le applicazioni nelle scienze della vita, in particolare i progetti basati sulla scoperta di biomarcatori.

Abbiamo utilizzato due diversi approcci per la proteomica di scoperta: approcci di proteomica senza etichetta e basati su etichette. Il profilo proteico dei campioni di tessuto su SDS-PAGE ha mostrato le proteine intatte e potrebbe essere considerato per l'analisi proteomica (Figura 2A). Il controllo di qualità dello strumento è stato monitorato tramite un software di idoneità del sistema e ha mostrato la variazione giornaliera delle prestazioni dello strumento (<strong class="xf...

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Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Misurazioni quantitative accurate delle proteine sono fondamentali per comprendere la cooperazione dinamica e spaziale tra le proteine per comprendere la malattia fino alla biologia. L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di fornire un flusso di lavoro quantitativo integrato di proteomica per campioni di tessuto, combinando il profilo proteico senza etichetta e basato su etichette per la scoperta di biomarcatori. In questo studio, abbiamo utilizzato lo strumento Orbitrap Fusion per quantificare le proteine utilizzando approcci basati su etichette e senza etichette.La lisi tissutale è uno dei passaggi più cruciali per il successo di un esperimento LC-MS-MS. Prendi 30 mg di tessuto in un tubo che batte le perle. Dopo il lavaggio con il PBS, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi dell'urea contenente otto urea molare, Tris, NaCl e MgCl2.Utilizzando un sonicatore a sonda, lisi il contenuto del tessuto. Ripeti questa operazione per un altro ciclo. Se si osserva un tessuto intatto sul fondo del tubo, aggiungere perle di zirconio al tubo e omogeneizzare il tessuto usando un battitore di perle per 90 secondi, con cinque minuti di incubazione sul ghiaccio.Centrifugare i campioni intorno a 6000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per separare i detriti cellulari dal surnatante. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e mescolare uniformemente la soluzione. Quantificare la concentrazione proteica nel llisito tissutale utilizzando il reagente di Bradford.Per questo, misurare l'OD del campione a 595 nanometri ed estrapolarlo utilizzando un grafico standard come mostrato in questa schermata. Dopo la quantificazione delle proteine, eseguire 10 microgrammi di llisi tissutale su gel SDS-PAGE al 12% per verificare la qualità dei lasati. Il primo passo nella digestione in soluzione comporta la riduzione dei legami disolfuro, utilizzando TCEP.Dopo l'aggiunta di TCEP, incubare il contenuto del tubo per un'ora a 37 gradi Celsius. Il passo successivo prevede l'alchilazione per impedire la ricomatura dei legami disolfuro ridotti. Aggiungere un agente alchilante come la iodoacetammide e incubare il tubo al buio per 10 minuti.Dopo l'incubazione, abbassare la concentrazione finale di urea a meno di un molare diluendo con quattro-otto volumi di tampone di diluizione. A questo punto, è consigliabile controllare il pH. Il passo successivo prevede l'aggiunta di tripsina al tubo e l'incubazione del tubo durante la notte per una digestione efficiente.Il giorno successivo, asciugare i peptidi digeriti in un concentratore di vuoto e procedere alla fase di dissamatrice. Per eseguire la dissalo dei peptidi, utilizzare le punte dello stadio C18. Attivare la punta dello stadio C18 aggiungendo 50 microlitro di metanolo, centrifugare la punta a 1000 G per due minuti.Ora, aggiungere 50 microlitro di acetonitrile in acido formico allo 0,1% per lavare la punta del palco e, di nuovo, centrifugare la punta. Ricostituire i peptidi digeriti essiccati in 50 microlitri di acido formico allo 0,1%. Aggiungere i peptidi ricostituiti nella punta dello stadio attivato.Ripetere questo passaggio almeno quattro volte. Per lavare il campione, aggiungere 50 microlitro di acido formico allo 0,1% e ripetere la fase di centrifugazione. Per l'eluizione dei peptidi, aggiungere 50 microlitri di 40% ACN in acido formico allo 0,1% e passarlo attraverso la punta dello stadio mediante centrifugazione.Ripetere questo passaggio con 50% e 60% ACN in acido formico 0,1% e raccogliere il filtrato in un tubo fresco. Asciugare i peptidi dissalettati usando un concentratore a vuoto. Prima dell'esecuzione di LC-MS-MS, quantificare i peptidi utilizzando il metodo Scopes.Per questo, caricare due microlitri di campione ricostituito nel pozzettilo di una piastra microgocce e misurare l'assorbanza a 205 nanometri e 280 nanometri. Calcola la concentrazione dalla formula descritta in questa diapositiva. Una volta che i peptidi dissali sono essiccati, sono pronti per la quantificazione basata sull'etichetta.Per l'etichettatura iTRAQ, i peptidi essiccati devono essere ricostituiti in 20 microlitri di tampone di dissoluzione, forniti nel kit di etichettatura iTRAQ. Ricostituire le etichette aggiungendo etanolo dal flaconcino fornito nel kit e mescolare accuratamente. Si consiglia di eseguire tutti i passaggi secondo le istruzioni del produttore.Aggiungere le etichette iTRAQ omogeneamente miscelate ai rispettivi tubi e consentire la reazione di etichettatura. Alla fine della reazione, spegnere qualsiasi etichetta non legata in eccesso nel tubo aggiungendo acqua di grado MS e incubare da mezz'ora a un'ora. Ora, trasferire tutto il contenuto etichettato in un singolo tubo e asciugare i peptidi etichettati.Dopo aver ricostituito i campioni in acido formico allo 0,1%, aprire l'autocampionatore di NanoLC e posizionare i campioni all'interno dell'autocampionatore. Una volta che i campioni sono stati inseriti nell'autocampionatore, è importante impostare i giusti parametri per la cromatografia liquida e la spettrometria di massa. Qui, descriviamo i parametri sia per la quantificazione senza etichetta che per la quantificazione basata su iTRAQ utilizzando LC-MS.In caso di quantificazione senza etichetta, è stato utilizzato un gradiente di 120 minuti come iniezione di un singolo campione non sezionato. Questa durata può essere aumentata o diminuita in base alla complessità del campione. In questo esperimento, è stato impostato un flusso di 300 nanolitri al minuto con il seguente gradiente per la soluzione B, che è l'80% di acetonitrile in acido formico all'1%, in questo caso.Allo stesso modo, possiamo impostare un gradiente per un esperimento iTRAQ. Poiché i campioni non sono sottoposti a frazionati, è stato utilizzato un gradiente di 90 minuti. I parametri MS sia per la quantificazione senza etichetta, sia per la quantificazione basata sull'etichetta iTRAQ, possono essere visti qui.Il primo passo prevede l'impostazione della modalità applicazione facendo clic sui parametri globali. Selezionare la modalità peptide e impostare la durata del metodo in base al gradiente LC utilizzato. Definire i parametri di scansione per l'esperimento.Facendo clic sull'opzione MS-OT, i parametri diventano visibili. Il tipo di rilevatore in uso è impostato su Orbitrap. L'altra opzione disponibile su questo strumento include una trappola ioio.La risoluzione è stata impostata su 60.000 e si può scegliere tra diverse opzioni disponibili, a seconda delle esigenze e del tipo di esperimento. L'intervallo di massa è normale e l'intervallo di scansione è impostato da 375 a 1700. Gli altri parametri sono predefiniti per MS Application.La soglia di intensità è stata impostata e lo stato di carica impostato nell'intervallo da due a sei. L'esclusione dinamica è stata impostata su 40 secondi e la tolleranza di massa è stata mantenuta a 10. Il set successivo di parametri include i parametri MS-MS.La modalità di isolamento è stata selezionata con quadrupolo, finestra di isolamento impostata a due, offset di isolamento è stato impostato su off e il tipo di attivazione è solitamente HCD per l'esperimento di proteomica. L'energia di collisione può essere riparata o può essere assistita. I campioni etichettati richiedono energie di collisione più elevate, quindi, per gli esperimenti iTRAQ, è consigliabile che l'energia di collisione sia impostata su 35, mentre per gli esperimenti LFQ può essere impostata su 30.Il tipo di rivelatore utilizzato qui è Orbitrap. La modalità intervallo di scansione sarà automatica. Gli altri parametri sono predefiniti per gli esperimenti iTRAQ e l'esperimento quantitativo senza etichetta.Cliccando sul riepilogo si otterrà una panoramica di tutti i parametri LC e MS utilizzati per l'esperimento. Puoi dare un'occhiata a ogni singolo parametro e fare la correzione di bozze. Una volta fatto, fai clic sul file e salvalo come file di metodo.Una volta salvato, puoi eseguire il metodo e otterrai i file raw. E poi quei file raw possono essere analizzati utilizzando il software Proteome Discoverer. Questa figura mostra la copertura della sequenza di BSA in tre repliche tecniche, che è il 91% nelle tre repliche.Questo indica la riproducibilità dello strumento. Ora, questa figura mostra l'uniformità nel numero di corrispondenze spettrali peptidiche, peptidi e proteine identificate in tre diversi campioni biologici, il che, ancora una volta, dà un'idea della riproducibilità dello strumento. Qui, il diagramma di Venn rappresenta le proteine comuni ed esclusive identificate in tre diversi campioni in esperimenti senza etichetta e esperimenti basati su etichette.Questi grafici a barre mostrano il numero di corrispondenze spettrali peptidiche, gruppi peptidici, proteine totali, gruppi proteici e numero di proteine dopo l'1% FDR, identificati nell'esperimento LFQ e iTRAQ. La proteomica tissutale di campioni biologici ci consente di esplorare nuovi potenziali biomarcatori associati a diversi stadi di progressione della malattia. Il protocollo descritto per l'analisi proteomica quantitativa dei tessuti fornisce dati di buona copertura riproducibili.L'uso di repliche tecniche garantisce una buona riproducibilità, anche se i campioni vengono eseguiti in momenti diversi. Qui, abbiamo mostrato l'analisi di campioni di tessuto utilizzando due metodi di quantificazione: proteomica senza etichetta e basata su etichette. La selezione delle tecniche proteomiche quantitative può dipendere dal numero di campioni, dalla disponibilità di piattaforme MS e dalla questione biologica da affrontare.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Ricerca

Biologia

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol come Matrix Assisted Laser per Matrix desorbimento / ionizzazione Imaging su una trasformata di Fourier Ionorisonanza Ciclotronica Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up e Shotgun Proteomica per identificare una completa Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture spettrometria di massa Compound - un potente strumento per identificare nuovi c-di-GMP effettori Proteine

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Arricchimento della matrice extracellulare proteine ​​da tessuti e digestione in Peptidi per l&#39;analisi Spettrometria di Massa

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Flusso di lavoro globale per l'identificazione del genoma e la Meta-analisi di espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi a Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...