Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
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我々は、MHRD-UAYプロジェクト(UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)、バイオテクノロジー省(BT/PR13114/INF/22/2015)が支援するIITボンベイのSSおよびMASSFIITB施設へのプロジェクト#34_IITBを認め、MS関連の実験をすべて実施します。

この研究は、インド工科大学ボンベイ校(IITB-IEC/2016/026)の機関審査委員会と倫理委員会によって審査され、承認されました。患者/参加者は、この研究に参加するために書面による同意を提供しました。
1. 組織のライセートの準備
注:氷の上で以下の手順をすべて実行して、プロテアーゼを非アクティブに保ちます。メスと使用されるチュー...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

生物学的サンプルの組織プロテオミクスは、疾患進行の異なる段階に関連する新しい潜在的なバイオマーカーを探求することを可能にする。また、疾患の進行に関連するシグナル伝達および経路のメカニズムについても説明する。組織定量プロテオミクス分析用に記述されたプロトコルは、再現可能な良好なカバレッジデータを提供する。ほとんどの手順は、製造元の指示に従って調整され?...

プロテオミクス技術は、疾患1の検出および予後に役立つ候補マーカーの同定と定量を可能にする可能性を有する。質量分析の分野における最近の進歩は、タンパク質レベルでの臨床研究を加速しています。研究者たちは、質量分析法ベースのプロテオミクスを用いて、いくつかの疾患の複雑な病態生物学の課題に取り組もうとしており、現在はタンパク質同定と定量化に対する感度の向上を提供している。タンパク質の正確な定量的測定は、健康な個人と病気の個人のタンパク質間の動的および空間的な協調を理解するために重要である3;しかし、このようなプロテオーム規模の分析は容易ではありません。
臨床検体のプロテオミクスプロファイリングの大きな制限の1つは、生物学的サンプルの複雑さである。多くの異なる種類のサンプルが、細胞株、血漿、および組織4、5などのプロテオームの疾患を研究するために調査されてきた。細胞株は、疾患進行の異なる段階を模倣するインビトロ実験のモデルとして広く使用されています。しかしながら、細胞株の1つの大きな制限は、細胞培養6の過程で遺伝子と平解な変化を容易に獲得する点である。プラズマなどの体液は、バイオマーカー発見の魅力的な源となる可能性があります。しかし、タンパク質の豊富さとダイナミックレンジのタンパク質濃度により、血漿プロテオミクスは少し難しい7.ここで、最も豊富なタンパク質から生まれたペプチドは、質量/電荷比が同じ6であっても、低い豊富なタンパク質由来のものを抑制することができる。ここ数年で枯渇と分画技術の進歩がありましたが、良好なカバレッジを得ることは、依然としてプラズマプロテオミクス8、9の大きな限界です。疾患生物学のプロテオーム学的調査のための組織の使用は、組織サンプルが疾患部位に最も近く、疾患生物学10,11に対するより良い洞察を提供するために高い生理学的および病理学的情報を提供するので好ましい。
本稿では、組織試料の定量的プロテオミクスの簡易プロトコルを提供しました。このバッファーは質量分析法に基づく調査と互換性があるため、8 M 尿素を含むバッファーを組織のライセート調製に使用しました。しかし、質量分析計に注入する前に、塩を除去するためにペプチドをきれいにすることが必須です。覚えておかねない重要なポイントの1つは、トリプシンが8M尿素濃度で低い活性を示すため、タンパク質消化のためのトリプシンを添加する前に尿素濃度を1M未満に減らすことです。定量的なグローバルプロテオミクスの2つのアプローチ:iTRAQ(相対および絶対定量のためのアイソバリックタグ)とラベルフリー定量(LFQ)を用いたラベルベースの定量法について説明しました。iTRAQベースの定量プロテオミクスは、主に生物学的状態(例えば、正常と疾患または治療されたサンプル)で変化する複数のサンプルを比較するために使用されます。このアプローチは、ペプチド12のN末端一次アミンを標識する等圧試薬を利用する。iTRAQ試薬は、1つのN-メチルピペラジンレポーターグループ、バランサ基、およびペプチド13のN末端一次アミンと反応する1つのN-ヒドロキシスクッチイミドエステル基を含む。各条件から消化されたペプチドは、特定のiTRAQ試薬で標識される。標識に続いて、反応を停止し、異なる条件からの標識ペプチドを単一のチューブにプールする。この組み合わせサンプル混合物は、同定と定量のために質量分析計によって分析される。MS/MS分析後、低分子質量のレポーターイオン断片が生成され、これらのレポーターイオンのイオン強度がタンパク質の定量化に使用されます。
別のアプローチとして、標識フリー定量法を用いて、安定同位体を有するペプチドを標識することなく、複合体サンプル中のタンパク質の相対数を決定する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

質量分析の最近の進歩は、堅牢で再現可能なデータセットの生成と共に深いプロテオミクス分析をもたらしました。しかし、かなりの技術的進歩にもかかわらず、患者の血液、CSF、および組織などの生体検体からのサンプル調製は依然としてかなりの課題を抱えています。バイオマーカーを同定するために、組織プロテオミクスはしばしば、研究結果をベンチから診療所に翻訳する魅力的なサンプル源を提供する。これは、アルツハイマー病、パーキンソン病などの癌や神経変性疾患の早期診断のための潜在的な候補バイオマーカーを明らかにすることができます。組織プロテオミクスはまた、タンパク質の豊富に基づいて全身情報の富を生成し、興味深い生物学的な質問に対処するのに役立ちます。
定量的プロテオミクス解析は、ラベルベースとラベルフリーアプローチの2つの大きなカテゴリに分類できます。標識ベースのアプローチでは、タンパク質またはペプチドは、SILAC(細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識)、ICAT(同位体コード化アフィニティータグ)、TMT(タンデム質量タグ)またはiTRAQ(相対および絶対定量のための同位体タグ)などの安定同位体を使用して標識されます。標識ベースのアプローチは、タンパク質をより正確に定量できるという利点を有し、またアイソバリックラベルを用いて、複数のサンプルを1回の実験で分析することができる。ラベルフリーのアプローチは、ラベルベースのアプローチに代わるコスト効率の高い方法です。特定のコホートに属する数百の患者サンプルを分析し、臨床特徴に基づいて他のコホートと比較することができる。ここでは、ライフサイエンス、特にバイオマーカー発見ベースのプロジェクトでの応用に不可欠な、ラベルフリーおよびラベルベースのプロテオームプロファイリング法を用いた組織サンプルの最適化された定量プロテオミクスワークフローについて説明しました。

私たちは、発見プロテオミクスには、ラベルフリーとラベルベースのプロテオミクスアプローチの2つの異なるアプローチを使用してきました。SDS-PAGE上の組織サンプルのタンパク質プロファイルは、インタクトなタンパク質を示し、プロテオミクス分析のために考慮することができた(図2A)。装置の品質管理チェックは、システム適合性ソフトウェアを介して監視...

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Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

記載されたプロトコルは、ラベルベースとラベルフリー定量の2つのアプローチを用いて、組織サンプルの最適化された定量プロテオミクス分析を提供します。ラベルベースのアプローチは、より正確なタンパク質定量の利点を有する一方で、ラベルフリーアプローチはより費用対効果が高く、コホートの何百ものサンプルを分析するために使用されます。

組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

タンパク質の正確な定量的測定は、生物学に戻って病気を理解するためにタンパク質間の動的かつ空間的な協力を理解するために重要です。この実験の全体的な目的は、バイオマーカー発見のためのラベルフリーおよびラベルベースのタンパク質プロファイリングを組み合わせた、組織サンプルの統合された定量プロテオミクスワークフローを提供することです。本研究では、標識ベースの標識のないアプローチを用いてタンパク質を定量化するために、オービットラップ・フュージョンという計器を用いた。組織のリシスは、LC-MS-MS実験を成功させる最も重要なステップの1つです。ビーズの鼓動管に30mgの組織を取る。PBSで洗浄した後、8つの大臼歯、トリス、NaClおよびMgCl2を含む尿素溶菌緩衝液の300マイクロリットルを加える。プローブ超音波処理器を使用して、組織の内容物を解凍します。別のサイクルに対してこれを繰り返します。チューブの底に無傷の組織を観察した場合は、チューブにジルコニウムビーズを加え、ビーズビーターを使用して90秒間、氷の上に5分間インキュベーションして組織を均質化します。サンプルを摂氏4度で15分間遠心分離し、上清から細胞の破片を分離します。新鮮なチューブに上清を収集し、均一に溶液を混合します。ブラッドフォード試薬を用いて組織ライセート中のタンパク質濃度を定量化する。この場合、サンプルのODを595ナノメートルで測定し、この画面に示すように標準グラフを使用して推定します。タンパク質定量に続いて、12%SDS-PAGEゲルで10マイクログラムの組織ライセートを実行し、ライセートの品質を確認します。インソリューション消化の最初のステップは、TCEPを使用して、ジスルフィド結合の減少を含みます。TCEPの添加に続いて、37°Cで1時間チューブの内容物をインキュベートします。次のステップは、還元された二硫化結合の再形成を防ぐためにアルキル化を伴う。ヨウドアセトアミドのようなアルキル化剤を添加し、チューブを暗く10分間インキュベートします。インキュベーション後、4~8体積の希釈バッファーで希釈することにより、尿素の最終濃度を1モル未満に下げます。この時点で、pHを確認することをお勧めします。次のステップは、トリプシンをチューブに加え、効率的な消化のためにチューブを一晩インキュベートすることを含む。翌日、消化したペプチドを真空濃縮器で乾燥させ、脱塩工程に進みます。ペプチドの脱塩を行うために、C18段階のヒントを使用してください。50マイクロリットルのメタノールを加えてC18段先端を活性化し、1000Gで先端を2分間遠心分離する。今度は、0.1%のギ酸に50マイクロリットルのアセトニトリルを加えてステージ先端を洗浄し、再び先端を遠心分離する。乾燥した消化されたペプチドを0.1%のギ酸の50マイクロリットルで再構成する。活性化された段階の先端に再構成されたペプチドを加える。この手順を少なくとも 4 回繰り返します。試料を洗浄するには、0.1%のギ酸を50マイクロリットル加え、遠心分離工程を繰り返します。ペプチドの溶出のために、0.1%のギ酸に40%ACNの50マイクロリットルを加え、遠心分離によって段階先端を通過する。0.1%のギ酸で50%と60%ACNでこのステップを繰り返し、新鮮なチューブに濾液を集める。脱塩したペプチドを真空濃縮器で乾燥させます。LC-MS-MSの実行に先立ち、Scopes法を用いてペプチドを定量化してください。このために、再構成したサンプルを2マイクロリットルのマイクロドロッププレートのウェルに積み込み、205ナノメートルと280ナノメートルで吸光度を測定します。このスライドで説明した式から濃度を計算します。脱塩ペプチドは、いったん乾燥すると、ラベルベースの定量化の準備が整います。iTRAQ標識の場合、乾燥したペプチドは、iTRAQ標識キットに用意されている20マイクロリットルの溶解バッファーで再構成されなければならない。キットに付属のバイアルからエタノールを添加してラベルを再構成し、十分に混ぜ合わせます。すべての手順は、製造元の指示に従って実行することをお勧めします。均質に混合されたiTRAQラベルをそれぞれのチューブに加え、標識反応を起こすのを可能にします。反応の最後に、MSグレードの水を加えることによってチューブ内の余分な非結合標識をクエンチし、30分から1時間インキュベートする。次に、標識された内容物をすべて単一のチューブに移し、標識されたペプチドを乾燥させます。サンプルを0.1%のギク酸に再構成した後、NanoLCのオートサンプラーを開き、オートサンプラーの内部にサンプルを置きます。サンプルをオートサンプラーに入れたら、液体クロマトグラフィーと質量分析の適切なパラメータを設定することが重要です。ここでは、LC-MS を使用したラベルなし定量と iTRAQ ベースの定量の両方のパラメータについて説明します。ラベルなしの定量の場合、120分の勾配が単一の未分離れたサンプルとして注入されている。この期間は、サンプルの複雑さに基づいて増減できます。この実験では、溶液Bの流れを1%ギ酸中80%のアセトニトリルである溶液Bに対して、300ナノリットルの流れを設定した。同様に、iTRAQ実験の勾配を設定することができます。サンプルが分画されていないので、90分の勾配が使用されています。ラベルフリー定量と iTRAQ ベースの定量の両方の MS パラメータをここで確認できます。最初の手順では、グローバル パラメータをクリックしてアプリケーション モードを設定します。ペプチドモードを選択し、使用するLC勾配に従って方法の持続時間を設定します。実験のスキャン パラメータを定義します。MS-OT オプションをクリックすると、パラメータが表示されます。使用中の検出器タイプはオービットラップに設定されています。この機器で使用できる他のオプションには、イオントラップが含まれています。解像度は 60,000 に設定されており、実験の必要性と種類に応じて、使用可能なさまざまなオプションを選択できます。質量範囲は正規であり、スキャン範囲は375から1700に設定されます。その他のパラメータは MS アプリケーションのデフォルトです。強度しきい値が設定され、充電状態が 2 ~ 6 の範囲で設定されています。動的除外は 40 秒に設定され、質量許容値は 10 に維持されています。次のパラメータセットには MS-MS パラメータが含まれます。分離モードは四重極で選択されており、分離窓は2に設定され、分離オフセットはオフに設定されており、活性化タイプは通常プロテオミクス実験のHCDです。衝突エネルギーは固定するか、またはアシストすることができます。標識されたサンプルは、より高い衝突エネルギーを必要とするため、iTRAQ実験では衝突エネルギーを35に設定し、LFQ実験では30に設定することが推奨されます。ここで使用される検出器のタイプはオービットラップです。スキャン範囲モードは自動になります。他のパラメータは、iTRAQ実験およびラベルフリー定量実験のデフォルトです。概要をクリックすると、実験に使用されるすべての LC パラメータと MS パラメータの概要が表示されます。あなたは一つ一つのパラメータを見て、校正を行うことができます。それが完了したら、ファイルをクリックしてメソッドファイルとして保存します。保存すると、メソッドを実行すると、生のファイルが取得されます。そして、これらの生のファイルは、プロテオーム発見ソフトウェアを使用して分析することができます。この図は、BSAのシーケンスカバレッジを3つの技術的な反復で示しています。これは、機器の再現性を示しています。さて、この図は、3つの異なる生物学的サンプルで同定されたペプチドスペクトル一致、ペプチド、およびタンパク質の数における均一性を示しており、これは再び、装置の再現性に関するアイデアを与える。ここで、ベン図は、ラベルフリー実験およびラベルベースの実験において、3つの異なるサンプルで同定された一般的なタンパク質および排他的タンパク質を表す。これらの棒グラフは、LFQおよびiTRAQ実験で同定された1%FDR後のペプチドスペクトル一致、ペプチド基、総タンパク質、タンパク質基、およびタンパク質数の数を示す。生物学的サンプルの組織プロテオミクスは、疾患進行の異なる段階に関連する新しい潜在的なバイオマーカーを探求することを可能にする。組織定量プロテオーム分析用に記述されたプロトコルは、再現可能な良好なカバレッジデータを提供する。技術的な反復の使用はサンプルが異なった時間ポイントで実行される場合でさえ、良い再現性を保障する。ここでは、ラベルフリーとラベルベースのプロテオミクスの2つの定量方法を用いて組織サンプルの分析を示しました。定量的プロテオミクス技術の選択は、サンプルの数、MSプラットフォームの利用可能性、および対処されるべき生物学的問題に依存し得る。

Research

JoVE Journal

Biology

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Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

ゲノムワイドな探索とグレープバインで ATL E3 ユビキチンリ ガーゼ遺伝子家族の表現メタ分析のための包括的なワークフロー

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...