Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
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우리는 MHRD-UAY 프로젝트 (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), 생명 공학부 (BT / PR13114 / INF / 22/206/2015)가 지원하는 IIT 봄베이의 SS 및 MASSFIITB 시설에 대한 프로젝트 #34_IITB 모든 MS 관련 실험을 수행하도록 인정합니다.

이 연구는 기관 검토 위원회와 인도 기술 봄베이 연구소의 윤리위원회 (IITB-IEC/2016/026)에 의해 검토및 승인되었습니다. 환자/참가자는 이 연구에 참여하기 위해 서면 동의를 제공했습니다.
1. 조직 리자테 준비
참고: 얼음에서 다음 단계를 모두 수행하여 프로테아제의 비활성 상태를 유지합니다. 메스와 사용된 모든 튜브가 오염을 피하기 위해 ?...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

생물학적 샘플의 조직 프로테오믹스는 질병 진행의 다른 단계와 관련된 새로운 잠재적인 바이오마커를 탐구할 수 있게 해줍니다. 그것은 또한 질병 진행과 관련 되 었던 신호 및 통로의 메커니즘을 설명합니다. 조직 정량 적 프로테오믹스 분석을 위한 기술된 프로토콜은 재현 가능한 양호한 커버리지 데이터를 제공한다. 대부분의 단계는 제조업체의 지침에서 적용되었습니다. 고품질 데이터를 ?...

프로테오믹스 기술은 질병1의검출 및 예후에 도움을 줄 수 있는 잠재적 후보 마커의 식별 및 정량화를 가능하게 할 가능성이 있다. 질량 분석 분야의 최근 발전은 단백질 수준에서 임상 연구를 가속화했습니다. 연구원은 지금 단백질 식별 및 정량화2를위한 증가한 감도를 제공하는 질량 분광법 기지를 둔 proteomics를 사용하여 몇몇 질병의 복잡한 병리학의 도전을 해결하기 위하여 노력하고 있습니다. 단백질의 정확한 정량적 측정은 건강하고 병들인 개별에 있는 단백질 중 동적 및 공간 협력을 이해하기 위하여 중요합니다3; 그러나, 프로테오메 전체 규모에 대한 이러한 분석은 쉽지 않다.
임상 표본의 프로테오믹 프로파일링의 한 가지 주요 제한사항은 생물학적 샘플의 복잡성입니다. 많은 상이한 유형의 샘플은 세포주, 혈장 및 조직4,5와같은 질병 프로테아움을 연구하기 위해 조사되었다. 세포주 널리 질병 진행의 다른 단계를 모방 하는 체 외 실험에서 모델로 사용 됩니다. 그러나, 세포주를 가진 한 가지 주요 제한은 세포 배양6의과정에서 지노티픽 및 현상 변화를 쉽게 획득한다는 것입니다. 플라즈마와 같은 체액은 바이오마커 발견을 위한 매력적인 공급원이 될 수 있습니다. 그러나, 단백질 농도가 매우 풍부하고 동적 범위 때문에 플라즈마 프로테오믹스는 조금 더 도전적입니다7. 여기서, 가장 풍부한 단백질로부터 유래된 펩타이드는 질량/전하 비율이 동일하더라도 낮은 풍부한 단백질로부터 유래된 단백질을 억제할 수있다. 지난 몇 년 동안 고갈 및 분수 기술의 발전이 있었지만, 좋은 커버리지를 얻는 것은 여전히 플라즈마 proteomics8,9의주요 한계남아있다. 질병 생물학의 proteomic 조사를 위한 조직의 사용은 조직 견본이 질병 사이트에 가장 근위이고 질병 생물학에 더 나은 통찰력을 제공하기 위하여 높은 생리적 및 병리학적인 정보를 제공하기 때문에 바람직하다10,11.
이 원고에서, 우리는 조직 견본의 정량적인 proteomics를 위한 단순화된 프로토콜을 제공했습니다. 우리는 이 완충이 질량 분석 기지를 둔 조사와 호환하기 때문에 조직 용액 준비에 대해 8 M 우레아를 포함하는 완충액을 사용했습니다. 그러나, 질량 분광계에 주입 하기 전에 소금을 제거 하는 펩 티 드를 청소 하는 것이 필수적이다. 기억해야 할 한 가지 중요한 점은 트립신이 8M 우레아 농도에서 낮은 활성을 나타내기 때문에 단백질 소화를 위한 트립신을 첨가하기 전에 우레아 농도를 1M 미만으로 낮추는 것입니다. iTRAQ(상대적이고 절대적인 정량화를 위한 아이소바릭 태그) 및 라벨없는 정량화(LFQ)를 사용하여 정량적 글로벌 프로테오믹스의 두 가지 접근법을 설명했습니다. iTRAQ 기반 정량 프로테오믹스는 주로 생물학적 상태(예: 정상 대 질병 또는 처리된 샘플)에서 다양한 여러 샘플을 비교하는 데 사용됩니다. 이 접근법은펩타이드(12)의N단 1차 아민에 라벨을 붙이기 위해 동소근 시약을 활용한다. iTRAQ 시약에는 펩티드13의N-terminal 1차 아민과 반응하는 N-메틸 피프라진 기자 그룹, 밸러스티어 그룹 및 1개의 N-하이드록시 succinimide 에스테르 군이 포함되어 있다. 각 조건에서 소화 된 펩 티 드 특정 iTRAQ 시약으로 표시 됩니다. 라벨링 에 이어, 반응이 중지되고 상이한 조건에서 펩티드가 단일 튜브로 풀링된다. 이 결합된 견본 혼합물은 식별 및 정량화를 위한 질량 분광계에 의해 분석됩니다. MS/MS 분석 후, 저분자 질량을 가진 리포터 이온 단편이 생성되고 이들 리포터 이온의 이온 강도는 단백질의 정량화에 사용된다.
또 다른 접근법, 라벨없는 정량화는 안정적인 동위원소로 펩티드를 라벨링하지 않고 복잡한 시료에서 단백질의 상대적 수를 결정하는 데 사용됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

질량 분석의 최근 발전은 강력하고 재현 가능한 데이터 세트의 생성과 함께 깊은 프로테오믹 분석을 초래했습니다. 그러나 상당한 기술적 진보에도 불구하고 환자 혈액, CSF 및 조직과 같은 생체 표본의 샘플 준비는 여전히 상당한 어려움을 겪고 있습니다. 바이오마커를 식별하기 위해 조직 프로테오믹스는 종종 벤치에서 클리닉으로 연구 결과를 번역하는 매력적인 샘플 소스를 제공합니다. 알츠하이머병, 파킨슨병 등과 같은 암 및 신경퇴행성 질환의 조기 진단을 위한 잠재적인 후보바이오마커를 공개할 수 있다. 조직 proteomics는 또한 단백질의 풍부에 근거를 둔 전신 정보의 부를 산출하고 흥미로운 생물학 질문을 해결하는 것을 돕습니다.
정량적 프로테오믹스 분석은 라벨 기반 및 라벨 이없는 접근 방식의 두 가지 광범위한 범주로 그룹화될 수 있습니다. 라벨 기반 접근법에서 단백질 또는 펩타이드는 SILAC(세포 배양에서 아미노산을 가진 안정적인 동위원소 라벨) 또는 ICAT(동위원소 코딩 친화성 태그), TMT(동위원소 코딩 친화성 태그), TMT(동위원소 대칭 대칭 태그) 또는 iTRAQ(상대및 절대수량에 대한 isobaric tag)와 같은 화학 적 태그로 분류됩니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양과 동소바릭 라벨을 사용하는 장점이 있으며, 여러 샘플을 단일 실험에서 분석할 수 있다. 라벨없는 접근 방식은 라벨 기반 접근 방식에 대한 비용 효율적인 대안을 제공합니다. 특정 코호트에 속하는 수백 개의 환자 샘플을 분석하고 임상 적 특징에 따라 다른 코호트와 비교할 수 있습니다. 여기서는 생명 과학, 특히 바이오마커 발견 기반 프로젝트에서 중요한 라벨 프리 및 라벨 기반 프로테오메 프로파일링 방법을 사용하여 조직 샘플에 최적화된 정량적 프로테오믹스 워크플로우를 설명했습니다.

우리는 발견 프로테오믹스에 대한 두 가지 접근 방식을 사용했습니다: 라벨이 없는 및 라벨 기반 프로테오믹스 접근법. SDS-PAGE에서 조직 샘플의 단백질 프로파일은 그대로 단백질을 나타내고 프로테오믹분석(도 2A)을고려할 수 있었다. 계측기의 품질 관리 검사는 시스템 적합성 소프트웨어를 통해 모니터링되었으며 계측기 성능(도2B)의일별 변화...

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Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

단백질의 정확한 정량적 측정은 질병을 생물학으로 되돌리기 위해 단백질 간의 동적 및 공간 협력을 이해하는 데 중요합니다. 이 실험의 전반적인 목적은 바이오마커 발견을 위한 라벨프리 및 라벨 기반 단백질 프로파일링을 결합하여 조직 샘플을 위한 통합 정량적 프로테오믹스 워크플로우를 제공하는 것입니다. 이 연구에서는, 우리는 라벨 기지를 둔 레이블 자유로운 접근을 사용하여 단백질을 정량화하기 위하여 악기 Orbitrap Fusion를 이용했습니다.조직 용해는 LC-MS-MS 실험의 성공을 위한 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 구드 구타 튜브에 조직의 30 mg을 가져 가라. PBS로 세척한 후 8개의 어금니 우레아, 트리스, NaCl 및 MgCl2를 함유한 300마이크로리터의 우레아 용해 버퍼를 추가합니다.프로브 초음파 처리기를 사용하여 조직의 내용을 lyse. 다른 주기에 대해 이 것을 반복합니다. 튜브 의 바닥에 있는 손상되지 않은 조직을 관찰하는 경우, 튜브에 지르코늄 구슬을 추가하고 얼음에 5 분 배양과 함께 90 초 동안 비드 비터를 사용하여 조직을 균질화하십시오.원심 분리는 섭씨 4도에서 15분 동안 약 6000G의 샘플을 분리하여 셀 파편을 상체에서 분리합니다. 상체를 신선한 튜브에 모아 서용액을 균일하게 섞습니다. 브래드포드 시약을 사용하여 조직 용액의 단백질 농도를 정량화합니다.이를 위해 595나노미터에서 샘플의 OD를 측정하고 이 화면에 표시된 표준 그래프를 사용하여 추정합니다. 단백질 정량화에 따라 12%SDS-PAGE 젤에 10 마이크로그램의 조직 용액을 실행하여 용액의 품질을 확인합니다. 용액 소화의 첫 번째 단계는 TCEP를 사용하여 이황화물 결합의 감소를 포함합니다.TCEP의 추가에 따라, 37섭씨에서 1시간 동안 튜브의 내용을 배양한다. 다음 단계는 감소 된 이황화물 결합이 다시 형성되는 것을 방지하기 위해 용해를 포함한다. 요오도아세타미드와 같은 알킬라팅 제를 추가하고 10분 동안 어둠 속에서 튜브를 배양합니다.인큐베이션 후, 4~8권의 희석 버퍼로 희석하여 우레아의 최종 농도를 1개 미만으로 낮춥니까. 이 시점에서 pH를 확인하는 것이 좋습니다. 다음 단계는 튜브에 트립신을 추가하고 효율적인 소화를 위해 밤새 튜브를 배양하는 것을 포함합니다.다음 날, 소화된 펩티드를 진공 농축기에서 건조시키고 탈염 단계를 진행한다. 펩티드의 탈솔화를 수행하려면 C18 단계 팁을 사용하십시오. 메탄올 50 마이크로리터를 추가하여 C18 단계 팁을 활성화하고, 2분 동안 1000G의 원심분리기를 원심분리합니다.이제 아세토닐릴 50마이크로리터를 0.1%의 포믹산에 추가하여 스테이지 팁을 세척하고 팁을 원심분리합니다. 말린 소화 펩티드를 0.1%의 50 마이크로리터에서 0.1%의 포믹산으로 재구성한다. 재구성된 펩티드를 활성화 된 단계 팁에 추가합니다.이 단계를 적어도 네 번 반복합니다. 시료를 세척하려면 0.1%의 마이크로리터 를 추가하고 원심 분리 단계를 반복합니다. 펩타이드의 용출을 위해, 0.1%의 포믹산에 40%ACN의 50 마이크로리터를 추가하고 원심분리로 단계 끝을 통과한다.0.1%의 포믹산으로 50%와 60%ACN으로 이 단계를 반복하고 신선한 튜브에서 여과물을 수집합니다. 진공 농축기로 탈염 펩티드를 건조시라. LC-MS-MS 실행 전에, 범위 방법을 사용하여 펩티드를 정량화한다.이를 위해, 마이크로드롭 플레이트의 우물에 재구성된 시료의 2마이크로리터를 적재하고, 205나노미터 및 280나노미터에서 흡광도를 측정한다. 이 슬라이드에 설명된 수식에서 농도를 계산합니다. 탈염 펩티드가 건조되면 라벨 기반 정량화를 위한 준비가 되어 있습니다.iTRAQ 라벨링의 경우, 건조 된 펩티드는 iTRAQ 라벨링 키트에 제공되는 용해 버퍼의 20 마이크로 리터로 재구성되어야합니다. 키트에 제공된 바이알에서 에탄올을 추가하여 라벨을 재구성하고 철저히 섞습니다. 모든 단계는 제조업체의 지침에 따라 수행되는 것이 좋습니다.동질적으로 혼합된 iTRAQ 라벨을 각 튜브에 추가하고 라벨링 반응을 수행합니다. 반응의 끝에서, MS 급수를 추가하여 튜브에 어떤 초과 언바운드 라벨을 담금질하고, 반 시간 에서 1 시간 동안 배양. 이제 라벨이 부착된 모든 내용을 단일 튜브로 옮기고 표지된 펩티드를 건조시합니다.샘플을 0.1%의 포믹산으로 재구성한 후 NanoLC의 자동 샘플러를 열고 자동 샘플러 내부에 샘플을 배치합니다. 샘플이 자동 샘플러에 배치되면 액체 크로마토그래피 및 질량 분광에 적합한 매개 변수를 설정하는 것이 중요합니다. 여기서는 LC-MS를 사용하여 라벨없는 수량과 iTRAQ 기반 정량화 모두에 대한 매개 변수를 설명합니다.라벨이 없는 수량의 경우, 120분 그라데이션이 단일 분할되지 않은 샘플이 주입됨에 따라 사용되었습니다. 이 지속 시간은 샘플 복잡성에 따라 증가하거나 감소할 수 있습니다. 이 실험에서 분당 300 나노리터의 흐름은 1%포믹산에서 80%의 아세토나이트인 용액 B에 대한 다음 그라데이션으로 설정되었다.같은 방법으로 iTRAQ 실험에 대한 그라데이션을 설정할 수 있습니다. 샘플의 분별되지 않으므로 90분 그라데이션이 사용되었습니다. 레이블이 없는 정량화와 iTRAQ 라벨 기반 정량화모두에 대한 MS 매개 변수는 여기에서 확인할 수 있습니다.첫 번째 단계는 전역 매개 변수를 클릭하여 응용 프로그램 모드를 설정하는 것입니다. 펩티드 모드를 선택하고 사용되는 LC 그라데이션에 따라 메서드 지속 시간을 설정합니다. 실험에 대한 스캔 매개 변수를 정의합니다.MS-OT 옵션을 클릭하면 매개 변수가 표시됩니다. 사용 중의 검출기 유형이 Orbitrap로 설정됩니다. 이 기기에서 사용할 수 있는 다른 옵션에는 이온 트랩이 포함되어 있습니다.해상도가 60, 000으로 설정되었으며 실험의 필요성과 유형에 따라 사용할 수 있는 다양한 옵션 중에서 선택할 수 있습니다. 매스 범위는 정상이며 스캔 범위는 375에서 1700으로 설정됩니다. 다른 매개 변수는 MS 응용 프로그램의 기본값입니다.강도 임계값이 설정되었으며 충전 상태가 2~6개 범위로 설정되었습니다. 동적 제외가 40초로 설정되었으며 질량 허용 오차는 10초로 유지됩니다. 다음 매개 변수 집합에는 MS-MS 매개 변수가 포함됩니다.격리 모드는 쿼드러폴로 선택되었으며, 격리 창은 2개로 설정되고 격리 오프셋이 꺼져 있으며, 활성화 유형은 일반적으로 프로테오믹스 실험에 대한 HCD입니다. 충돌 에너지를 고정하거나 도움을 받을 수 있습니다. 라벨이 부착된 샘플은 더 높은 충돌 에너지를 필요로 하므로 iTRAQ 실험의 경우 충돌 에너지를 35로 설정하는 것이 바람직하며 LFQ 실험의 경우 30으로 설정할 수 있습니다.여기서 사용되는 검출기 유형은 Orbitrap입니다. 스캔 범위 모드는 자동됩니다. 다른 매개 변수는 iTRAQ 실험 및 레이블이 없는 정량 적 실험의 기본값입니다.요약을 클릭하면 실험에 사용되는 모든 LC 및 MS 매개 변수에 대한 개요가 표시됩니다. 당신은 각각의 모든 매개 변수에 대한 모양을 하고 교정을 할 수 있습니다. 작업이 완료되면 파일을 클릭하고 메서드 파일로 저장합니다.저장하면 메서드를 실행할 수 있으며 원시 파일을 가져옵니다. 그런 다음 이러한 원시 파일을 Proteome 디스커버러 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다. 이 수치는 세 가지 기술 복제에서 BSA의 시퀀스 커버리지를 보여 주며, 이는 세 복제에서 91%입니다.이는 계측기의 재현성을 나타냅니다. 지금, 이 그림은 3개의 다른 생물학 견본에서 확인된 펩티드 스펙트럼 성냥, 펩티드 및 단백질의 수에 있는 균일성을 보여줍니다, 이는, 다시, 계기의 재현성에 관하여 아이디어를 줍니다. 여기서, Venn 다이어그램은 라벨이 없는 실험 및 라벨 기반 실험에서 세 가지 다른 샘플에서 확인된 일반적이고 독점적인 단백질을 나타낸다.이러한 바 그래프는 LFQ 및 iTRAQ 실험에서 확인된 1%FDR 이후 펩티드 스펙트럼 성냥, 펩타이드 그룹, 총 단백질, 단백질 그룹 및 단백질 수의 수를 나타낸다. 생물학적 샘플의 조직 프로테오믹스는 질병 진행의 다른 단계와 관련된 새로운 잠재적인 바이오마커를 탐구할 수 있게 해줍니다. 조직 정량 적 프로테오믹 분석을 위한 기술된 프로토콜은 재현 가능한 양호한 커버리지 데이터를 제공한다.기술 복제를 사용하면 샘플이 서로 다른 시점에서 실행되더라도 좋은 재현성을 보장합니다. 여기서, 우리는 두 가지 수량 방법을 사용하여 조직 샘플의 분석을 보여 주었다: 라벨없는 라벨 기반 프로테오믹스. 정량적 프로테오믹 기술의 선택은 시료 수, MS 플랫폼의 가용성 및 해결될 생물학적 질문에 따라 달라질 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

연구

생물학

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

종합 달팽이 프로테옴을 확인하는 상향식 (bottom-up)과 샷건 단백질 체학 (Proteomics)

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Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

캡처 복합 질량 분석 - 소설의 C 디 GMP 이펙터 단백질을 식별 할 수있는 강력한 도구

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

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Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

절대 단백질 정량 질량 분석을 모니터링 선정 반응

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

게놈 넓은 식별 및 소문의 ATL E3 유비퀴틴 리가 유전자 가족의 식 메타 분석을 위한 포괄적인 워크플로

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...