Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Vi anerkjenner MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), prosjekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility ved IIT Bombay støttet av Institutt for bioteknologi (BT/PR13114/INF/22/206/2015) for å utføre alle MS-relaterte eksperimenter.

Denne studien ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle kontrollkomiteer og etikkkomiteen til Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). Pasientene/deltakerne ga skriftlig samtykke til å delta i denne studien.
1. Vev lysat forberedelse
MERK: Utfør alle følgende trinn på isen for å holde proteasene inaktive. Pass på at skalpellene og eventuelle rør som brukes er sterile for å unngå krysskontaminering.
<ol><li>Ta ~ 30 ...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

Vevsproteomikk av biologiske prøver gjør det mulig for oss å utforske nye potensielle biomarkører forbundet med ulike stadier av sykdomsprogresjon. Det forklarer også mekanismen for signalering og veier forbundet med sykdomsprogresjon. Den beskrevne protokollen for vevse kvantitativ proteomikkanalyse gir reproduserbare gode dekningsdata. De fleste trinnene er tilpasset produsentens instruksjoner. For å få data av høy kvalitet er følgende trinn mest avgjørende. Derfor bør det utvises ekstra forsiktighet mens du...

Proteomiske teknologier har potensial til å muliggjøre identifisering og kvantifisering av potensielle kandidatmarkører som kan hjelpe til med deteksjon og prognostisering av sykdommen1. Nylige fremskritt innen massespektrometri har akselerert klinisk forskning på proteinnivå. Forskere prøver å løse utfordringen med komplisert patobiologi av flere sykdommer ved hjelp av massespektrometribasert proteomikk, som nå gir økt følsomhet for proteinidentifikasjon og kvantifisering2. Nøyaktig kvantitativ måling av proteiner er avgjørende for å forstå det dynamiske og romlige samarbeidet mellom proteiner hos friske og syke individer3; Imidlertid er en slik analyse på en proteome-bred skala ikke lett.
En stor begrensning ved proteomisk profilering av kliniske prøver er kompleksiteten i biologiske prøver. Mange forskjellige typer prøver har blitt undersøkt for å studere sykdommen proteom, for eksempel cellelinjer, plasma og vev4,5. Cellelinjer er mye brukt som modeller i in vitro-eksperimenter for å etterligne ulike stadier av sykdomsprogresjon. En stor begrensning med cellelinjer er imidlertid at de lett får genotypiske og fenotypiske endringer under prosessen med cellekultur6. Kroppsvæsker som plasma kan være en attraktiv kilde for biomarkøroppdagelse; På grunn av de svært rikelige proteinene og det dynamiske spekteret av proteinkonsentrasjon, er plasmaproteomikk imidlertid litt mer utfordrende7. Her stammer peptider fra de mest tallrike proteinene kan undertrykke de som er avledet fra de lave rikelige proteinene, selv om masse / ladningsforholdet er det samme6. Selv om det har vært fremskritt i uttømmings- og fraksjoneringsteknologiene de siste årene, er det fortsatt en stor begrensning av plasmaproteomikk8,9. Bruk av vev for proteomisk undersøkelse av sykdomsbiologi foretrekkes da vevsprøver er mest proksimale for sykdomsstedene og tilbyr høy fysiologisk og patologisk informasjon for å gi bedre innsikt i sykdomsbiologien10,11.
I dette manuskriptet har vi gitt en forenklet protokoll for kvantitativ proteomikk av vevsprøver. Vi har brukt en buffer som inneholder 8 M urea for vevslyspreparatet, da denne bufferen er kompatibel med massespektrometribaserte undersøkelser. Det er imidlertid obligatorisk å rengjøre peptidene for å fjerne salter før du injiserer dem i massespektrometeret. Et viktig poeng å huske er å redusere ureakonsentrasjonen til mindre enn 1 M før du legger til trypsin for protein fordøyelse som trypsin viser lav aktivitet ved 8 M urea konsentrasjon. Vi har forklart to tilnærminger til kvantitativ global proteomikk: etikettbasert kvantifisering ved hjelp av iTRAQ (isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering) og etikettfri kvantifisering (LFQ). ITRAQ-basert kvantitativ proteomikk brukes hovedsakelig til å sammenligne flere prøver som varierer i deres biologiske tilstand (f.eks. normal versus sykdom eller behandlede prøver). Tilnærmingen benytter isobariske reagenser for å merke N-terminal primære aminer av peptider12. ITRAQ-reagensene inneholder en N-metyl piperazinreportergruppe, en balansergruppe og en N-hydroksy succinimide estergruppe som reagerer med N-terminal primære aminer av peptider13. Fordøyde peptider fra hver tilstand er merket med et bestemt iTRAQ-reagens. Etter merkingen stoppes reaksjonen og merkede peptider fra forskjellige forhold samles i et enkelt rør. Denne kombinerte prøveblandingen analyseres av massespektrometer for identifisering og kvantifisering. Etter MS/MS-analysen genereres reporterionfragmenter med lave molekylære masser, og ionintensitetene til disse reporterionene brukes til kvantifisering av proteinene.
En annen tilnærming, etikettfri kvantifisering, brukes til å bestemme det relative antallet proteiner i komplekse prøver uten å merke peptider med stabile isotoper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

Nylige fremskritt innen massespektrometri har resultert i dyp proteomisk analyse sammen med generering av robuste og reproduserbare datasett. Til tross for de betydelige tekniske fremskrittene, gir prøvepreparering fra biospecimens som pasientblod, CSF og vev fortsatt betydelige utfordringer. For å identifisere biomarkører gir vevsproteomikk ofte en attraktiv prøvekilde for å oversette forskningsfunnene fra benken til klinikken. Det kan avsløre potensielle kandidatbiomarkører for tidlig diagnose av kreft og nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, etc. Vevsproteomikk gir også et vell av systemisk informasjon basert på overflod av proteiner og bidrar til å løse interessante biologiske spørsmål.
Kvantitativ proteomikkanalyse kan grupperes i to brede kategorier: en etikettbasert og en etikettfri tilnærming. I den etikettbaserte tilnærmingen er proteiner eller peptider merket med stabile isotoper som SILAC (stabil isotopmerking med aminosyrer i cellekulturen) eller av kjemiske koder som ICAT (isotopkodede affinitetskoder), TMT (tandemmassemerke) eller iTRAQ (isobarisk tag for relativ og absolutt kvantitet). Etikettbaserte tilnærminger har fordelen av mer nøyaktig mengde proteiner og ved hjelp av isobariske etiketter, kan flere prøver analyseres i et enkelt eksperiment. Den etikettfrie tilnærmingen gir et kostnadseffektivt alternativ til etikettbaserte tilnærminger. Hundrevis av pasientprøver som tilhører en bestemt kohort kan analyseres og sammenlignes med andre kohorter basert på kliniske egenskaper. Her har vi beskrevet en optimalisert kvantitativ proteomisk arbeidsflyt for vevsprøver ved hjelp av etikettfrie og etikettbaserte proteomprofileringsmetoder, som er avgjørende for anvendelser i biovitenskap, spesielt biomarkøroppdagelsesbaserte prosjekter.

Vi har brukt to forskjellige tilnærminger for oppdagelsesproteomikk: etikettfrie og etikettbaserte proteomiske tilnærminger. Proteinprofilen til vevsprøver på SDS-PAGE viste de intakte proteinene og kunne vurderes for proteomisk analyse (figur 2A). Kvalitetskontrollkontrollen av instrumentet ble overvåket via programvare for systemtilførbarhet, og den viste den daglige variasjonen i instrumentytelsen (Figur 2B). Vi observerte 91 % sekvensdekning a...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Den beskrevne protokollen gir en optimalisert kvantitativ proteomikkanalyse av vevsprøver ved hjelp av to tilnærminger: etikettbasert og etikettfri kvantasjon. Etikettbaserte tilnærminger har fordelen av mer nøyaktig mengde proteiner, mens en etikettfri tilnærming er mer kostnadseffektiv og brukes til å analysere hundrevis av prøver av en kohort.

Omfattende arbeidsflyt av massespektrometribasert hagleproteomikk av vevsprøver

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Nøyaktige kvantitative målinger av proteiner er avgjørende for å forstå det dynamiske og romlige samarbeidet mellom proteiner for å forstå sykdommen tilbake til biologi. Det overordnede målet med dette eksperimentet er å gi en integrert kvantitativ proteomisk arbeidsflyt for vevsprøver, som kombinerer etikettfri og etikettbasert proteinprofilering for biomarkøroppdagelse. I denne studien har vi brukt instrumentet Orbitrap Fusion til å kvantifisere proteinene ved hjelp av etikettbaserte og etikettfrie tilnærminger.Tissue lysis er et av de mest avgjørende trinnene for suksessen til et LC-MS-MS-eksperiment. Ta 30 mg vev i et perleslagrør. Etter vask med PBS, tilsett 300 mikroliter urea lysis buffer som inneholder åtte molar urea, Tris, NaCl og MgCl2.Bruk en sonde soniker, lyse innholdet i vevet. Gjenta dette for en annen syklus. Hvis du observerer noe intakt vev på bunnen av røret, legg zirkoniumperler til røret og homogeniser vevet ved hjelp av en perle beater i 90 sekunder, med fem minutters inkubasjon på is.Sentrifuger prøvene rundt 6000 G i 15 minutter ved fire grader Celsius for å skille celleavfallet fra supernatanten. Samle supernatanten i et friskt rør og bland løsningen jevnt. Kvantifisere proteinkonsentrasjonen i vevslyset ved hjelp av Bradford reagens.For dette måler du OD for prøven ved 595 nanometer og ekstrapolerer den ved hjelp av en standardgraf som vist på denne skjermen. Etter protein kvantifisering, kjør 10 mikrogram vev lysat på 12%SDS-PAGE gel for å sjekke kvaliteten på lysater. Det første trinnet i fordøyelsen i løsningen innebærer reduksjon av disulfidbindinger, ved hjelp av TCEP.Etter tilsetning av TCEP, inkuber innholdet i røret i en time ved 37 grader Celsius. Det neste trinnet innebærer alkylering for å forhindre at de reduserte disulfidbindingene dannes på nytt. Tilsett et alkyleringsmiddel som iodoacetamid og inkuber røret i mørket i 10 minutter.Etter inkubasjon, senk den endelige konsentrasjonen av urea til mindre enn en molar ved å fortynne med fire til åtte volumer fortynningsbuffer. På dette tidspunktet er det tilrådelig å sjekke pH. Det neste trinnet innebærer tilsetning av trypsin til røret, og inkubering av røret over natten for effektiv fordøyelse.På neste dag tørker du de fordøyde peptidene i en vakuumkonsentrator, og fortsetter med avsaltingstrinn. For å utføre avsalting av peptider, bruk C18 trinntips. Aktiver C18-trinnsspissen ved å tilsette 50 mikroliter metanol, sentrifuger spissen ved 1000 G i to minutter.Tilsett nå 50 mikroliter acetonitril i 0,1% maursyre for å vaske scenespissen, og igjen sentrifuger spissen. Rekonstituer de tørkede fordøyde peptidene i 50 mikroliter 0,1% maursyre. Legg de rekonstituerte peptidene i den aktiverte trinnspissen.Gjenta dette trinnet minst fire ganger. For å vaske prøven, tilsett 50 mikroliter 0,1% maursyre, og gjenta sentrifugeringstrinnet. For elution av peptider, tilsett 50 mikroliter på 40% ACN i 0,1% maursyre, og send den gjennom trinnspissen ved sentrifugering.Gjenta dette trinnet med 50% og 60% ACN i 0,1% maursyre og samle filtratet i et friskt rør. Tørk de avsaltede peptidene ved hjelp av en vakuumkonsentrator. Før LC-MS-MS kjøres, kvantifiserer du peptidene ved hjelp av Scopes -metoden.For dette, last to mikroliter rekonstituert prøve i brønnen til en mikrodropplate, og mål absorbansen ved 205 nanometer og 280 nanometer. Beregn konsentrasjonen fra formelen som er beskrevet på dette lysbildet. Når de avsaltede peptidene er tørket, er de klare for etikettbasert kvantifisering.For iTRAQ-merking må de tørkede peptidene rekonstitueres i 20 mikroliter oppløsningsbuffer, som følger med i iTRAQ-merkingssettet. Rekonstituer etikettene ved å tilsette etanol fra hetteglasset som følger med i settet, og bland grundig. Det anbefales at alle trinnene utføres i henhold til produsentens instruksjoner.Legg de homogent blandede iTRAQ-etikettene til sine respektive rør og la merkingsreaksjonen finne sted. På slutten av reaksjonen slukker du overflødig ubundet etikett i røret ved å tilsette MS-grade vann, og inkubere i en halv time til en time. Overfør nå alt merket innhold til et enkelt rør og tørk de merkede peptidene.Etter rekonstituering av prøvene i 0,1% maursyre, åpne autosampleren til NanoLC, og plasser prøvene inne i autosampleren. Når prøvene er plassert i autosampleren, er det viktig å angi de riktige parametrene for væskekromatografi og massespektrometri. Her beskriver vi parametrene for både etikettfri kvantifisering og iTRAQ-basert kvantifisering ved hjelp av LC-MS.Ved etikettfri kvantasjon har en 120 minutters gradient blitt brukt som en enkelt overtredelsesprøve injiseres. Denne varigheten kan økes eller reduseres basert på utvalgskompleksiteten. I dette eksperimentet er det satt en strøm på 300 nanoliter per minutt med følgende gradient for løsning B, som er 80% acetonitril i 1% maursyre, i dette tilfellet.På samme måte kan vi sette en gradient for et iTRAQ-eksperiment. Siden prøvene ikke er fraksjonert, har en 90-minutters gradient blitt brukt. MS-parametrene for både etikettfri kvantifisering, samt iTRAQ-etikettbasert kvantifisering, kan ses her.Det første trinnet innebærer å stille inn applikasjonsmodus ved å klikke på de globale parametrene. Velg peptidmodus, og angi metodevarigheten i henhold til LC-gradienten som brukes. Definer skanneparameterne for eksperimentet.Når du klikker på MS-OT-alternativet, blir parametrene synlige. Detektortypen som er i bruk er satt til Orbitrap. Det andre alternativet som er tilgjengelig på dette instrumentet inkluderer en ionfelle.Oppløsningen er satt til 60 000, og man kan velge mellom forskjellige tilgjengelige alternativer, avhengig av behov og type eksperiment. Masseområdet er normalt, og skanneområdet er satt fra 375 til 1700. De andre parameterne er standard for MS Application.Intensitetsterskelen er satt, og ladetilstanden er satt i området to til seks. Dynamisk utelukkelse er satt til 40 sekunder, og massetoleransen er holdt til 10. Det neste settet med parametere inkluderer MS-MS-parameterne.Isolasjonsmodusen er valgt med quadrupole, isolasjonsvindu satt til to, isolasjonsforskyvning er satt til av, og aktiveringstypen er vanligvis HCD for proteomics-eksperimentet. Kollisjonsenergi kan enten fikses, eller den kan assisteres. Merkede prøver krever høyere kollisjonsenergier, derfor, for iTRAQ-eksperimenter, anbefales det at kollisjonsenergien settes til 35, mens for LFQ-eksperimenter kan den settes til 30.Detektortypen som brukes her er Orbitrap. Skanneområdemodus vil være automatisk. De andre parametrene er standard for iTRAQ-eksperimenter og etikettfritt kvantitativt eksperiment.Ved å klikke på sammendraget vil du gi en oversikt over alle LC- og MS-parametrene som brukes til eksperimentet. Du kan ta en titt på hver eneste parameter og gjøre korrekturlesingen. Når det er gjort, klikker du på filen og lagrer den som en metodefil.Når du har lagret, kan du kjøre metoden, og du får raw-filene. Og så kan disse rå filene analyseres ved hjelp av Proteome Discoverer-programvare. Denne figuren viser sekvensdekningen av BSA i tre tekniske repliker, som er 91 % i de tre replikeringene.Dette indikerer instrumentets reproduserbarhet. Nå viser denne figuren ensartetheten i antall peptidspektralkamper, peptider og proteiner identifisert i tre forskjellige biologiske prøver, som igjen gir en ide om instrumentets reproduserbarhet. Her representerer Venn-diagrammet de vanlige og eksklusive proteinene som er identifisert i tre forskjellige prøver i etikettfritt eksperiment og etikettbasert eksperiment.Disse stolpediagrammene viser antall peptidspektrale treff, peptidgrupper, totale proteiner, proteingrupper og proteintall etter 1 % FDR, identifisert i LFQ- og iTRAQ-eksperiment. Vevsproteomikk av biologiske prøver gjør det mulig for oss å utforske nye potensielle biomarkører forbundet med ulike stadier av sykdomsprogresjon. Den beskrevne protokollen for vevse kvantitativ proteomisk analyse gir reproduserbare gode dekningsdata.Bruk av tekniske replikeringer sikrer god reproduserbarhet, selv om prøvene kjøres på forskjellige tidspunkter. Her har vi vist analysen av vevsprøver ved hjelp av to mengdemetoder: etikettfri og etikettbasert proteomikk. Valg av kvantitative proteomiske teknikker kan avhenge av antall prøver, tilgjengeligheten av MS-plattformer og biologisk spørsmål som skal håndteres.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomikk Prøvepreparering fra formalinfiksert og parafin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol som en matrise for Matrix Assisted Laser desorpsjon / Ionization Imaging på en Fourier Transform Ion syklotron Resonans Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up og Shotgun Proteomikk å identifisere en omfattende Cochlea Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound massespektrometri - et kraftig verktøy for å identifisere Novel c-di-GMP Effector Proteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Ikke-enzymatisk, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive brystlesjonene for Spontan generasjon Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Valgt Reaction Monitoring massespektrometri for Absolute Protein Kvantifisering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av Ekstracellulære Matrix Proteiner fra Vev og Fordøyelse inn Peptider for massespektrometrianalyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Omfattende arbeidsflyten for genomet-identifikasjon og uttrykk Meta-analyse av ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene familien i Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...