Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
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Reconocemos el Proyecto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), proyecto #34_IITB a las instalaciones de SS y MASSFIITB en IIT Bombay con el apoyo del Departamento de Biotecnología (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para llevar a cabo todos los experimentos relacionados con la EM.

Este estudio fue revisado y aprobado por las juntas de revisión institucional y el comité de ética del Instituto Indio de Tecnología de Bombay (IITB-IEC/2016/026). Los pacientes/participantes dieron su consentimiento por escrito para participar en este estudio.
1. Preparación de lisato tisular
NOTA: Realice todos los pasos siguientes en el hielo para mantener las proteasas inactivas. Asegúrese de que los bisturíes y los tubos utilizados sean es...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

La proteómica tisular de muestras biológicas nos permite explorar nuevos biomarcadores potenciales asociados con diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. También explica el mecanismo de señalización y las vías asociadas con la progresión de la enfermedad. El protocolo descrito para el análisis proteómico cuantitativo de tejidos proporciona buenos datos de cobertura reproducibles. La mayoría de los pasos se han adaptado de las instrucciones del fabricante. Para obtener datos de alta calidad, los sig...

Las tecnologías proteómicas tienen el potencial de permitir la identificación y cuantificación de posibles marcadores candidatos que pueden ayudar en la detección y pronóstico de la enfermedad1. Los recientes avances en el campo de la espectrometría de masas han acelerado la investigación clínica a nivel de proteínas. Los investigadores están tratando de abordar el desafío de la patobiología complicada de varias enfermedades utilizando proteómica basada en espectrometría de masas, que ahora ofrece una mayor sensibilidad para la identificación y cuantificación de proteínas2. La medición cuantitativa precisa de las proteínas es crucial para comprender la cooperación dinámica y espacial entre las proteínas en individuos sanos y enfermos3; sin embargo, tal análisis a escala de proteoma no es fácil.
Una limitación importante del perfil proteómico de las muestras clínicas es la complejidad de las muestras biológicas. Se han investigado muchos tipos diferentes de muestras para estudiar el proteoma de la enfermedad, como líneas celulares, plasma y tejidos4,5. Las líneas celulares son ampliamente utilizadas como modelos en experimentos in vitro para imitar diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. Sin embargo, una limitación importante con las líneas celulares es que adquieren fácilmente cambios genotípicos y fenotípicos durante el proceso de cultivo celular6. Los fluidos corporales como el plasma podrían ser una fuente atractiva para el descubrimiento de biomarcadores; sin embargo, debido a las proteínas altamente abundantes y al rango dinámico de concentración de proteínas, la proteómica plasmática es un poco más desafiante7. Aquí, los péptidos originados a partir de las proteínas más abundantes pueden suprimir los derivados de las proteínas poco abundantes, incluso si la relación masa/carga es la misma6. Aunque ha habido avances en las tecnologías de agotamiento y fraccionamiento en los últimos años, obtener una buena cobertura sigue siendo una limitación importante de la proteómica plasmática8,9. Se prefiere el uso de tejidos para la investigación proteómica de la biología de la enfermedad, ya que las muestras de tejido son más proximales a los sitios de la enfermedad y ofrecen alta información fisiológica y patológica para proporcionar una mejor comprensión de la biología de la enfermedad10,11.
En este manuscrito, hemos proporcionado un protocolo simplificado para la proteómica cuantitativa de muestras de tejido. Hemos utilizado un tampón que contiene 8 M de urea para la preparación de lisato tisular, ya que este tampón es compatible con las investigaciones basadas en espectrometría de masas. Sin embargo, es obligatorio limpiar los péptidos para eliminar las sales antes de inyectarlas en el espectrómetro de masas. Un punto importante a recordar es reducir la concentración de urea a menos de 1 M antes de agregar tripsina para la digestión de proteínas, ya que la tripsina exhibe baja actividad a una concentración de urea de 8 M. Hemos explicado dos enfoques de la proteómica global cuantitativa: la cuantificación basada en etiquetas utilizando iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) y la cuantificación sin etiquetas (LFQ). La proteómica cuantitativa basada en iTRAQ se utiliza principalmente para comparar múltiples muestras que varían en su condición biológica (por ejemplo, muestras normales versus de enfermedades o tratadas). El enfoque utiliza reactivos isobáricos para etiquetar las aminas primarias N-terminales de los péptidos12. Los reactivos iTRAQ contienen un grupo reportero N-metil piperazina, un grupo equilibrador y un grupo éster N-hidroxi succinimida que reacciona con aminas primarias N-terminales de péptidos13. Los péptidos digeridos de cada afección se etiquetan con un reactivo iTRAQ particular. Después del etiquetado, la reacción se detiene y los péptidos etiquetados de diferentes condiciones se agrupan en un solo tubo. Esta mezcla de muestra combinada se analiza mediante espectrómetro de masas para su identificación y cuantificación. Después del análisis MS/MS, se generan fragmentos de iones reporteros con bajas masas moleculares y se utilizan las intensidades iónicas de estos iones reporteros para la cuantificación de las proteínas.
Otro enfoque, la cuantificación sin etiquetas, se utiliza para determinar el número relativo de proteínas en muestras complejas sin etiquetar péptidos con isótopos estables.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

Los avances recientes en espectrometría de masas han dado como resultado un análisis proteómico profundo junto con la generación de conjuntos de datos robustos y reproducibles. Sin embargo, a pesar de los considerables avances técnicos, la preparación de muestras a partir de bioespecímenes como la sangre del paciente, el CSF y el tejido todavía plantea desafíos considerables. Para identificar biomarcadores, la proteómica tisular a menudo proporciona una fuente de muestra atractiva para traducir los hallazgos de la investigación del banco a la clínica. Puede revelar posibles biomarcadores candidatos para el diagnóstico precoz del cáncer y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, etc. La proteómica tisular también produce una gran cantidad de información sistémica basada en la abundancia de proteínas y ayuda a abordar preguntas biológicas interesantes.
El análisis proteómico cuantitativo se puede agrupar en dos grandes categorías: un enfoque basado en etiquetas y un enfoque sin etiquetas. En el enfoque basado en etiquetas, las proteínas o péptidos se etiquetan utilizando isótopos estables como SILAC (etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular) o mediante etiquetas químicas como ICAT (etiquetas de afinidad codificadas por isótopos), TMT (etiqueta de masa en tándem) o iTRAQ (etiqueta isobárica para cuantificación relativa y absoluta). Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas y, utilizando etiquetas isobáricas, se pueden analizar múltiples muestras en un solo experimento. El enfoque sin etiquetas proporciona una alternativa rentable a los enfoques basados en etiquetas. Cientos de muestras de pacientes pertenecientes a una cohorte en particular pueden ser analizadas y comparadas con otras cohortes en función de las características clínicas. Aquí, hemos descrito un flujo de trabajo de proteómica cuantitativa optimizada para muestras de tejido utilizando métodos de perfiles de proteoma sin etiquetas y basados en etiquetas, que es crucial para las aplicaciones en ciencias de la vida, especialmente los proyectos basados en el descubrimiento de biomarcadores.

Hemos utilizado dos enfoques diferentes para la proteómica de descubrimiento: enfoques proteómicos sin etiquetas y basados en etiquetas. El perfil proteico de muestras de tejido en SDS-PAGE mostró las proteínas intactas y pudo ser considerado para el análisis proteómico(Figura 2A). La verificación de control de calidad del instrumento se monitoreó a través del software de idoneidad del sistema y mostró la variación diaria en el rendimiento del instrumento<strong class="xf...

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Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Las mediciones cuantitativas precisas de las proteínas son cruciales para comprender la cooperación dinámica y espacial entre las proteínas para comprender la enfermedad de vuelta a la biología. El objetivo general de este experimento es proporcionar un flujo de trabajo proteómico cuantitativo integrado para muestras de tejido, combinando perfiles de proteínas sin etiquetas y basados en etiquetas para el descubrimiento de biomarcadores. En este estudio, hemos utilizado el instrumento Orbitrap Fusion para cuantificar las proteínas utilizando enfoques basados en etiquetas y sin etiquetas.La lisis tisular es uno de los pasos más cruciales para el éxito de un experimento LC-MS-MS. Tome 30 mg de tejido en un tubo de batido de cuentas. Después del lavado con el PBS, agregue 300 microlitros de tampón de lisis de urea que contenga ocho urea molar, Tris, NaCl y MgCl2.Usando un sonicador de sonda, lise el contenido del tejido. Repita esto para otro ciclo. Si observa algún tejido intacto en la parte inferior del tubo, agregue perlas de circonio al tubo y homogeneice el tejido con un batidor de cuentas durante 90 segundos, con cinco minutos de incubación en hielo.Centrifugar las muestras alrededor de 6000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para separar los restos celulares del sobrenadante. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco y mezcle la solución uniformemente. Cuantificar la concentración de proteínas en el lisato tisular utilizando el reactivo Bradford.Para ello, mida el OD de la muestra a 595 nanómetros y extrapolíelo utilizando un gráfico estándar como se muestra en esta pantalla. Después de la cuantificación de proteínas, ejecute 10 microgramos de lisato tisular en gel 12% SDS-PAGE para verificar la calidad de los lisatos. El primer paso en la digestión en solución implica la reducción de los enlaces disulfuro, utilizando TCEP.Después de la adición de TCEP, incube el contenido del tubo durante una hora a 37 grados centígrados. El siguiente paso consiste en la alquilación para evitar que los enlaces disulfuro reducidos se vuelvan a formar. Agregue un agente alquilante como la yodoacetamida e incube el tubo en la oscuridad durante 10 minutos.Después de la incubación, reduzca la concentración final de urea a menos de un molar diluyendo con cuatro a ocho volúmenes de tampón de dilución. En este punto, es recomendable comprobar el pH. El siguiente paso implica la adición de tripsina al tubo y la incubación del tubo durante la noche para una digestión eficiente.Al día siguiente, seque los péptidos digeridos en un concentrador de vacío y proceda al paso de desalinación. Para realizar la desalinación de péptidos, use puntas de etapa C18. Active la punta de la etapa C18 agregando 50 microlitros de metanol, centrífuga la punta a 1000 G durante dos minutos.Ahora, agregue 50 microlitros de acetonitrilo en ácido fórmico al 0.1% para lavar la punta del escenario y, nuevamente, centrífuga la punta. Reconstituir los péptidos digeridos secos en 50 microlitros de ácido fórmico al 0,1%. Agregue los péptidos reconstituidos en la punta de la etapa activada.Repita este paso al menos cuatro veces. Para lavar la muestra, agregue 50 microlitros de ácido fórmico al 0,1% y repita el paso de centrifugación. Para la elución de péptidos, agregue 50 microlitros de 40% ACN en ácido fórmico al 0.1% y páselo a través de la punta de la etapa por centrifugación.Repita este paso con 50% y 60% de ACN en ácido fórmico al 0,1% y recoja el filtrado en un tubo fresco. Seque los péptidos desalados con un concentrador de vacío. Antes de ejecutar LC-MS-MS, cuantifique los péptidos utilizando el método Scopes.Para esto, cargue dos microlitros de muestra reconstituida en el pozo de una placa de microgotas, y mida la absorbancia a 205 nanómetros y 280 nanómetros. Calcule la concentración a partir de la fórmula descrita en esta diapositiva. Una vez que los péptidos desalados se secan, están listos para la cuantificación basada en etiquetas.Para el etiquetado iTRAQ, los péptidos secos deben reconstituirse en 20 microlitros de tampón de disolución, proporcionados en el kit de etiquetado iTRAQ. Reconstituya las etiquetas agregando etanol del vial proporcionado en el kit y mezcle bien. Es aconsejable que todos los pasos se lleven a cabo según las instrucciones del fabricante.Agregue las etiquetas iTRAQ mezcladas homogéneamente a sus respectivos tubos y permita que se produzca la reacción de etiquetado. Al final de la reacción, sucle cualquier exceso de etiqueta sin encuadernar en el tubo agregando agua de grado MS e incube durante media hora a una hora. Ahora, transfiera todo el contenido etiquetado en un solo tubo y seque los péptidos etiquetados.Después de reconstituir las muestras en ácido fórmico al 0,1%, abra el muestreador automático de NanoLC y coloque las muestras dentro del muestreador automático. Una vez que las muestras se han colocado en el muestreador automático, es importante establecer los parámetros correctos para la cromatografía líquida y la espectrometría de masas. Aquí, describimos los parámetros tanto para la cuantificación sin etiquetas como para la cuantificación basada en iTRAQ utilizando LC-MS.En caso de cuantificación sin etiqueta, se ha utilizado un gradiente de 120 minutos mientras se inyecta una sola muestra no fraccionada. Esta duración se puede aumentar o disminuir en función de la complejidad de la muestra. En este experimento, se ha establecido un flujo de 300 nanolitros por minuto con el siguiente gradiente para la solución B, que es 80% acetonitrilo en ácido fórmico al 1%, en este caso.De la misma manera, podemos establecer un gradiente para un experimento iTRAQ. Dado que las muestras no están infraccionadas, se ha utilizado un gradiente de 90 minutos. Los parámetros de MS tanto para la cuantificación sin etiquetas, como para la cuantificación basada en etiquetas iTRAQ, se pueden ver aquí.El primer paso consiste en configurar el modo de aplicación haciendo clic en los parámetros globales. Seleccione el modo de péptido y establezca la duración del método según el gradiente LC que se está utilizando. Defina los parámetros de análisis para el experimento.Al hacer clic en la opción MS-OT, los parámetros se vuelven visibles. El tipo de detector en uso se establece en Orbitrap. La otra opción disponible en este instrumento incluye una trampa de iones.La resolución se ha establecido en 60, 000, y se puede elegir entre diferentes opciones disponibles, dependiendo de la necesidad y el tipo de experimento. El rango de masa es normal y el rango de escaneo se establece de 375 a 1700. Los otros parámetros son predeterminados para MS Application.Se ha establecido el umbral de intensidad y el estado de carga establecido en el rango de dos a seis. La exclusión dinámica se ha establecido en 40 segundos y la tolerancia de masa se ha mantenido en 10. El siguiente conjunto de parámetros incluye los parámetros MS-MS.El modo de aislamiento se ha seleccionado con cuadrupolo, la ventana de aislamiento se ha establecido en dos, el desplazamiento de aislamiento se ha desactivado y el tipo de activación suele ser HCD para el experimento de proteómica. La energía de colisión puede ser fija o puede ser asistida. Las muestras etiquetadas requieren energías de colisión más altas, por lo tanto, para los experimentos iTRAQ, es aconsejable que la energía de colisión se establezca en 35, mientras que para los experimentos LFQ, se puede establecer en 30.El tipo de detector utilizado aquí es Orbitrap. El modo de rango de escaneo será automático. Los otros parámetros son predeterminados para los experimentos iTRAQ y el experimento cuantitativo sin etiquetas.Al hacer clic en el resumen, se obtendrá una visión general de todos los parámetros LC y MS utilizados para el experimento. Puede echar un vistazo a todos y cada uno de los parámetros y hacer la revisión. Una vez hecho esto, haga clic en el archivo y guárdelo como un archivo de método.Una vez que guarde, puede ejecutar el método y obtendrá los archivos sin procesar. Y luego esos archivos sin procesar se pueden analizar utilizando el software Proteome Discoverer. Esta figura muestra la cobertura de secuencia de BSA en tres réplicas técnicas, que es del 91% en las tres réplicas.Esto indica la reproducibilidad del instrumento. Ahora, esta figura muestra la uniformidad en el número de coincidencias espectrales de péptidos, péptidos y proteínas identificadas en tres muestras biológicas diferentes, lo que, nuevamente, da una idea sobre la reproducibilidad del instrumento. Aquí, el diagrama de Venn representa las proteínas comunes y exclusivas identificadas en tres muestras diferentes en el experimento sin etiqueta y el experimento basado en etiquetas.Estos gráficos de barras muestran el número de coincidencias espectrales de péptidos, grupos peptídicos, proteínas totales, grupos de proteínas y número de proteínas después del 1% de FDR, identificados en el experimento LFQ e iTRAQ. La proteómica tisular de muestras biológicas nos permite explorar nuevos biomarcadores potenciales asociados con diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. El protocolo descrito para el análisis proteómico cuantitativo de tejidos proporciona buenos datos de cobertura reproducibles.El uso de réplicas técnicas garantiza una buena reproducibilidad, incluso si las muestras se ejecutan en diferentes puntos de tiempo. Aquí, hemos mostrado el análisis de muestras de tejido utilizando dos métodos de cuantificación: proteómica sin etiquetas y basada en etiquetas. La selección de las técnicas proteómicas cuantitativas puede depender del número de muestras, la disponibilidad de plataformas de EM y la cuestión biológica que se abordará.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Investigación

Biología

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

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There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

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El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

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Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

No enzimática, libre de suero Cultivo de Tejidos de lesiones de mama pre-invasivas para la generación espontánea de mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Enriquecimiento de la Matriz Extracelular Las proteínas de los tejidos y la digestión en péptidos para el análisis de espectrometría de masas

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Flujo de trabajo integral para la identificación de todo el genoma y Meta-análisis de la expresión de la familia del Gene del ATL E3 ubiquitina ligasa en Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...