Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Vi bekräftar MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB till SS och MASSFIITB Facility vid IIT Bombay med stöd av institutionen för bioteknik (BT/PR13114/INF/22/206/2015) för att utföra alla MS-relaterade experiment.

Denna studie granskades och godkändes av institutionella granskningsnämnder och etikkommittén vid Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). Patienterna/deltagarna gav sitt skriftliga samtycke till att delta i denna studie.
1. Beredning av vävnadslyat
OBS: Utför alla följande steg på isen för att hålla proteaserna inaktiva. Se till att skalpellerna och eventuella rör som används är sterila för att undvika korskontaminering...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

Vävnadsproteomik av biologiska prover gör det möjligt för oss att utforska nya potentiella biomarkörer associerade med olika stadier av sjukdomsprogression. Det förklarar också mekanismen för signalering och vägar i samband med sjukdomsprogression. Det beskrivna protokollet för vävnad kvantitativ proteomics analys ger reproducerbara bra täckning data. De flesta stegen har anpassats från tillverkarens instruktioner. För att få data av hög kvalitet är följande steg mest avgörande. Därför bör extra fö...

Proteomikteknik har potential att göra det möjligt att identifiera och kvantifiera potentiella kandidatmarkörer som kan bidra till att upptäcka och prognostifiera sjukdomen1. De senaste framstegen inom masspektrometri har påskyndat klinisk forskning på proteinnivå. Forskare försöker ta itu med utmaningen med komplicerad patobiologi av flera sjukdomar med hjälp av masspektrometribaserad proteomik, som nu erbjuder ökad känslighet för proteinidentifiering och kvantifiering2. Noggrann kvantitativ mätning av proteiner är avgörande för att förstå det dynamiska och rumsliga samarbetet mellan proteiner hos friska och sjuka individer3. En sådan analys i proteomomfattande skala är dock inte lätt.
En stor begränsning av proteomisk profilering av kliniska prover är komplexiteten hos biologiska prover. Många olika typer av prover har undersökts för att studera sjukdomen proteome, såsom cellinjer, plasma ochvävnader 4,5. Cellinjer används ofta som modeller i in vitro-experiment för att efterlikna olika stadier av sjukdomsprogression. En stor begränsning med cellinjer är dock att de enkelt förvärvar genotypiska och fenotypiska förändringar under cellkulturens process6. Kroppsvätskor som plasma kan vara en attraktiv källa för biomarkörupptäckt; Men på grund av de mycket rikliga proteinerna och det dynamiska intervallet av proteinkoncentration är plasmaproteomik lite mer utmanande7. Här kan peptider som härstammar från de mest rikliga proteinerna undertrycka de som härrör från de låga rikliga proteinerna även om massa / laddningsförhållandet är detsamma6. Även om det har gjorts framsteg i utarmnings- och fraktioneringstekniken under de senaste åren, är det fortfarande en stor begränsning av plasmaproteomics8,9. Användningen av vävnader för proteomisk undersökning av sjukdomsbiologi föredras eftersom vävnadsprover är mest proximala för sjukdomsplatserna och erbjuder hög fysiologisk och patologisk information för att ge bättre insikter isjukdomsbiologin 10,11.
I detta manuskript har vi tillhandahållit ett förenklat protokoll för kvantitativ proteomik av vävnadsprover. Vi har använt en buffert som innehåller 8 M urea för vävnad lysat beredning eftersom denna buffert är kompatibel med masspektrometri-baserade undersökningar. Det är dock obligatoriskt att rengöra peptiderna för att ta bort salter innan du injicerar dem i masspektrometern. En viktig punkt att komma ihåg är att minska ureakoncentrationen till mindre än 1 M innan trypsin tillsätts för proteinsammanfattning eftersom trypsin uppvisar låg aktivitet vid 8 M ureakoncentration. Vi har förklarat två metoder för kvantitativ global proteomik: etikettbaserad kvantifiering med iTRAQ (isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering) och etikettfri kvantifiering (LFQ). Den iTRAQ-baserade kvantitativa proteomiken används främst för att jämföra flera prover som varierar i deras biologiska tillstånd (t.ex. normal kontra sjukdom eller behandlade prover). Metoden använder isobaric reagenser för att märka N-terminal primära aminer av peptider12. ITRAQ-reagenserna innehåller en N-metyl piperazin reportergrupp, en balansgrupp och en N-hydroxy succinimide ester grupp som reagerar med N-terminal primära aminer av peptider13. Smälta peptider från varje villkor är märkta med ett visst iTRAQ-reagens. Efter märkningen stoppas reaktionen och märkta peptider från olika förhållanden slås samman till ett enda rör. Denna kombinerade provblandning analyseras med masspektrometer för identifiering och kvantifiering. Efter MS/MS-analysen genereras reporterjonfragment med låga molekylära massor och jonintensiteterna hos dessa reporterjoner används för kvantifiering av proteinerna.
Ett annat tillvägagångssätt, etikettfri kvantifiering används för att bestämma det relativa antalet proteiner i komplexa prover utan att märka peptider med stabila isotoper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

De senaste framstegen inom masspektrometri har resulterat i djup proteomisk analys tillsammans med generering av robusta och reproducerbara datamängder. Men trots de betydande tekniska framstegen, prov förberedelse från biospecimens såsom patientens blod, CSF och vävnad fortfarande utgör betydande utmaningar. För att identifiera biomarkörer ger vävnadsproteomik ofta en attraktiv provkälla för att översätta forskningsresultat från bänken till kliniken. Det kan avslöja potentiella kandidatbiomarkörer för tidig diagnos av cancer och neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom etc. Vävnadsproteomik ger också en mängd systemisk information baserad på överflöd av proteiner och hjälper till att ta itu med intressanta biologiska frågor.
Kvantitativ proteomikanalys kan grupperas i två breda kategorier: ett etikettbaserat och ett etikettfritt tillvägagångssätt. I det etikettbaserade tillvägagångssättet är proteiner eller peptider märkta med stabila isotoper som SILAC (stabil isotopmärkning med aminosyror i cellkulturen) eller med kemiska taggar som ICAT (isotopkodade affinitetstaggar), TMT (tandemmassetikett) eller iTRAQ (isobarisk tagg för relativ och absolut kvantifiering). Etikettbaserade metoder har fördelen av mer exakt kvantifiering av proteiner och med hjälp av isobariska etiketter kan flera prover analyseras i ett enda experiment. Den etikettfria metoden är ett kostnadseffektivt alternativ till etikettbaserade metoder. Hundratals patientprover som tillhör en viss kohort kan analyseras och jämföras med andra kohorter baserade på kliniska egenskaper. Här har vi beskrivit ett optimerat kvantitativt proteomikarbetsflöde för vävnadsprover med hjälp av etikettfria och etikettbaserade proteomeprofileringsmetoder, vilket är avgörande för tillämpningar inom biovetenskap, särskilt biomarkörupptäcktsbaserade projekt.

Vi har använt två olika metoder för upptäcktsproteomik: etikettfria och etikettbaserade proteomikmetoder. Proteinprofilen för vävnadsprover på SDS-PAGE visade de intakta proteinerna och kunde övervägas för proteomisk analys (figur 2A). Instrumentets kvalitetskontroll övervakades via programvara för system lämplighet och visade den dagliga variationen i instrumentets prestanda (figur 2B). Vi observerade 91% sekvenstäckning av BSA-provet i 3...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Det beskrivna protokollet ger en optimerad kvantitativ proteomikanalys av vävnadsprover med hjälp av två metoder: etikettbaserad och etikettfri kvantifiering. Etikettbaserade metoder har fördelen av mer exakt kvantifiering av proteiner, medan ett etikettfritt tillvägagångssätt är mer kostnadseffektivt och används för att analysera hundratals prover av en kohort.

Omfattande arbetsflöde för masspektrometribaserade hagelgevärsproteomik av vävnadsprover

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Exakta kvantitativa mätningar av proteiner är avgörande för att förstå det dynamiska och rumsliga samarbetet mellan proteiner för att förstå sjukdomen tillbaka till biologin. Det övergripande målet med detta experiment är att tillhandahålla ett integrerat kvantitativt proteomikarbetsflöde för vävnadsprover, som kombinerar etikettfri och etikettbaserad proteinprofilering för biomarkörupptäckt. I denna studie har vi använt instrumentet Orbitrap Fusion för att kvantifiera proteinerna med hjälp av etikettbaserade och etikettfria metoder.Vävnadslys är ett av de viktigaste stegen för framgången med ett LC-MS-MS-experiment. Ta 30 mg vävnad i ett pärlslagsrör. Efter tvättning med PBS, tillsätt 300 mikroliter urea lysis buffert som innehåller åtta molar urea, Tris, NaCl och MgCl2.Lys innehållet i vävnaden med hjälp av en sondsonicator. Upprepa detta för en annan cykel. Om du observerar intakt vävnad längst ner i röret, tillsätt zirkoniumpärlor i röret och homogenisera vävnaden med en pärlvib i 90 sekunder, med fem minuters inkubation på is.Centrifugera proverna runt 6000 G i 15 minuter vid fyra grader Celsius för att separera cellskräpet från supernaten. Samla supernaten i ett nytt rör och blanda lösningen jämnt. Kvantifiera proteinkoncentrationen i vävnadslysatet med Hjälp av Bradford-reagens.För detta mäter du provet od vid 595 nanometer och extrapolerar det med hjälp av ett standarddiagram som visas på denna skärm. Efter proteink kvantifieringen, kör 10 mikrogram vävnad lysat på 12%SDS-PAGE gel för att kontrollera kvaliteten på lysates. Det första steget i matsmältningen i lösningen innebär att man minskar disulfidbindningarna med hjälp av TCEP.Efter tillsats av TCEP, inkubera innehållet i röret i en timme vid 37 grader Celsius. Nästa steg innebär alkylering för att förhindra att de reducerade disulfidbindningarna bildas om. Tillsätt ett alkylerande medel som jodacetamid och inkubera röret i mörker i 10 minuter.Efter inkubation, sänk den slutliga koncentrationen av karbamid till mindre än en molar genom att späda med fyra till åtta volymer utspädningsbuffert. Vid denna tidpunkt är det lämpligt att kontrollera pH. Nästa steg innebär tillsats av trypsin till röret och inkubation av röret över natten för effektiv matsmältning.Nästa dag torka de smälta peptiderna i en vakuumkoncentrator och fortsätt för avsaltning steg. För att utföra avsaltning av peptider, använd C18 stegspetsar. Aktivera C18-scenspetsen genom att tillsätta 50 mikroliter metanol, centrifugera spetsen vid 1000 G i två minuter.Tillsätt nu 50 mikroliter acetonitril i 0,1%myrsyra för att tvätta scenspetsen och återigen centrifugera spetsen. Reconstitute de torkade smälta peptiderna i 50 mikroliter av 0,1% myrsyra. Tillsätt de rekonstituerade peptiderna i den aktiverade scenspetsen.Upprepa det här steget minst fyra gånger. För att tvätta provet, tillsätt 50 mikroliter 0,1%myrsyra och upprepa centrifugeringssteget. För eluering av peptider, tillsätt 50 mikroliter av 40% ACN i 0,1% myrsyra och passera den genom scenspetsen genom centrifugation.Upprepa det här steget med 50% och 60% ACN i 0,1% myrsyra och samla filtratet i ett nytt rör. Torka desaltade peptiderna med hjälp av en vakuumkoncentrator. Kvantifiera peptiderna med hjälp av Scopes-metoden före LC-MS-MS-körning.För detta ladda två mikroliter rekonstituerat prov i brunnen på en mikrodroppplatta och mät absorbansen vid 205 nanometer och 280 nanometer. Beräkna koncentrationen från formeln som beskrivs på den här bilden. När de avsaltade peptiderna har torkats är de redo för etikettbaserad kvantifiering.För iTRAQ-märkning måste de torkade peptiderna rekonstitueras i 20 mikroliter upplösningsbuffert, som anges i iTRAQ-märkningssatsen. Rekonstruera etiketterna genom att tillsätta etanol från injektionsflaskan som medföljer satsen och blanda noggrant. Det är tillrådligt att alla steg utförs enligt tillverkarens instruktioner.Tillsätt de homogent blandade iTRAQ-etiketterna i sina respektive rör och låt märkningsreaktionen äga rum. I slutet av reaktionen, släcka eventuell överflödig obunden etikett i röret genom att tillsätta MS-vatten och inkubera i en halvtimme till en timme. Överför nu allt märkt innehåll till ett enda rör och torka de märkta peptiderna.Efter att proverna har rekonstruerats i 0,1% myrsyra, öppna autosamplern av NanoLC och placera proverna inuti autosamplern. När proverna har placerats i autosamplern är det viktigt att ställa in rätt parametrar för vätskekromatografi och masspektrometri. Här beskriver vi parametrarna för både etikettfri kvantifiering och iTRAQ-baserad kvantifiering med hjälp av LC-MS.Vid etikettfri kvantifiering har en 120 minuters lutning använts som ett enda icke-befraktat prov injiceras. Denna varaktighet kan ökas eller minskas baserat på prov komplexiteten. I detta experiment har ett flöde på 300 nanoliter per minut ställts in med följande lutning för lösning B, som är 80% acetonitril i 1%myrsyra, i detta fall.På samma sätt kan vi ställa in en lutning för ett iTRAQ-experiment. Eftersom proverna är ofraktionerade har en 90-minuters lutning använts. MS-parametrarna för både etikettfri kvantifiering, liksom iTRAQ-etikettbaserad kvantifiering, kan ses här.Det första steget innebär att ställa in applikationsläget genom att klicka på de globala parametrarna. Välj peptidläget och ställ in metodens varaktighet enligt den LC-gradient som används. Definiera genomsökningsparametrarna för experimentet.När du klickar på alternativet MS-OT blir parametrarna synliga. Den detektortyp som används är inställd på Orbitrap. Det andra alternativet som finns på detta instrument inkluderar en jonfälla.Upplösningen har ställts in på 60 000, och man kan välja mellan olika tillgängliga alternativ, beroende på experimentens behov och typ. Massintervallet är normalt och skanningsområdet är inställt från 375 till 1700. De andra parametrarna är standard för MS-programmet.Intensitetströskeln har ställts in och laddningstillståndet har angetts i intervallet två till sex. Dynamisk uteslutning har ställts in på 40 sekunder och masstoleransen har hållits till 10. Nästa uppsättning parametrar inkluderar MS-MS-parametrarna.Isoleringsläget har valts med fyrdubbelt isoleringsfönster inställt på två, isoleringsförskjutningen har ställts in på av och aktiveringstypen är vanligtvis HCD för proteomikexperimentet. Kollisionsenergi kan antingen fixas eller så kan den assisteras. Märkta prover kräver högre kollisionsenergier, därför är det lämpligt att kollisionsenergin ställs in på 35, medan den för LFQ-experiment kan ställas in på 30.Detektortypen som används här är Orbitrap. Skanningsintervallläget kommer att vara automatiskt. De andra parametrarna är standard för iTRAQ-experiment och etikettfria kvantitativa experiment.Om du klickar på sammanfattningen får du en översikt över alla LC- och MS-parametrar som används för experimentet. Du kan titta på varje parameter och göra korrekturläsningen. När det är klart klickar du på filen och sparar den som en metodfil.När du har sparat kan du köra metoden och du får de råa filerna. Och sedan kan dessa råa filer analyseras med Proteome Discoverer-programvara. Den här siffran visar sekvenstäckningen för BSA i tre tekniska replikat, vilket är 91% i de tre replikaterna.Detta indikerar instrumentets reproducerbarhet. Nu visar denna siffra enhetligheten i antalet peptidspektrala matchningar, peptider och proteiner som identifierats i tre olika biologiska prover, vilket återigen ger en uppfattning om instrumentets reproducerbarhet. Här representerar Venndiagrammet de vanliga och exklusiva proteiner som identifierats i tre olika prover i etikettfria experiment och etikettbaserade experiment.Dessa stapelgrafer visar antalet peptidspektrala matchningar, peptidgrupper, totala proteiner, proteingrupper och proteinnummer efter 1%FDR, identifierat i LFQ- och iTRAQ-experiment. Vävnadsproteomik av biologiska prover gör det möjligt för oss att utforska nya potentiella biomarkörer associerade med olika stadier av sjukdomsprogression. Det beskrivna protokollet för vävnad kvantitativ proteomisk analys ger reproducerbara bra täckning data.Användning av tekniska replikat säkerställer god reproducerbarhet, även om proverna körs vid olika tidpunkter. Här har vi visat analysen av vävnadsprover med hjälp av två kvantifieringsmetoder: etikettfri och etikettbaserad proteomik. Valet av kvantitativ proteomisk teknik kan bero på antalet prover, tillgången till MS-plattformar och den biologiska fråga som ska tas upp.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kvantifiering av proteiner med Peptide Immunoaffinity Anrikning kombination med masspektrometri

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomic Provberedning från formalinfixerade och paraffininbäddade vävnads

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol som matris för Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Imaging på en Fourier Trans ion Cyclotron Resonance Mäss Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up och Shotgun Proteomics att identifiera en omfattande Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound masspektrometri - Ett kraftfullt verktyg för att identifiera nya c-di-GMP effektorproteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Icke-enzymatiska, Serumfri Tissue Culture of Pre-invasiva bröstförändringar för spontan generation av Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Vald Reaction Monitoring masspektrometri för Absolute protein kvantifiering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av extracellulära matrixproteiner från vävnader och matsmältning i peptider för masspektrometri analys

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Heltäckande arbetsflöde för Genome-wide identifiering och uttryck Meta-analys av ATL E3 Ubiquitin Ligase gen familjen i Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...