Name: comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

MS ile ilgili tüm deneyleri gerçekleştirmek için Biyoteknoloji Bölümü (BT/PR13114/INF/22/206/2015) tarafından desteklenen IIT Bombay'daki SS ve MASSFIITB Tesisi'ne #34_IITB MHRD-UAY Projesi'ni (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA) kabul ediyoruz.

Bu çalışma kurumsal inceleme kurulları ve Hindistan Teknoloji Enstitüsü Bombay etik komitesi (IITB-IEC/2016/026) tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Hastalar/katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı onaylarını sundular.
1. Doku lysate hazırlığı
NOT: Proteazları etkin tutmamak için buz üzerinde aşağıdaki adımların tümlerini uygulayın. Çapraz bulaşmayı önlemek için neşterlerin ve kullanılan tüplerin...

<ol>
	<li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy.">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li><li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics:+a+new+window+on+cancer.">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology.">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li><li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research.">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum:+advances+and+challenges+ahead.">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li><li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics.">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li><li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity.">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li><li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria.">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557 (2016).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas.">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li><li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers.">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140 (2014).</li><li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+Technologies+and+their+applications.">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li><li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+(CPTAC)+common+data+analysis+pipeline.">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li></ol>

Biyolojik örneklerin doku proteomikleri, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarıyla ilişkili yeni potansiyel biyobelirteçleri keşfetmemizi sağlar. Ayrıca sinyalizasyon mekanizmasını ve hastalığın ilerlemesiyle ilişkili yolları açıklar. Doku nicel proteomik analizi için açıklanan protokol tekrarlanabilir iyi kapsama verileri sağlar. Adımların çoğu üreticinin talimatlarından uyarlanmıştır. Yüksek kaliteli veri elde etmek için aşağıdaki adımlar çok önemlidir. Bu nedenle, bu adıml...

Proteomik teknolojiler, hastalığın tespiti ve prognostikasyonuna yardımcı olabilecek potansiyel aday belirteçlerinin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlama potansiyeline sahiptir1. Kütle spektrometresi alanındaki son gelişmeler protein düzeyinde klinik araştırmaları hızlandırmıştır. Araştırmacılar, şimdi protein tanımlama ve niceleme için daha fazla hassasiyet sunan kütle spektrometrisi bazlı proteomik kullanarak birkaç hastalığın karmaşık patobiyolojisinin zorluğunu ele almaya çalışıyorlar2. Proteinlerin doğru nicel ölçümü, sağlıklı ve hastalıklı bireylerde proteinler arasındaki dinamik ve mekansal işbirliğini anlamak için çok önemlidir3; ancak, proteome çapında bu tür bir analiz kolay değildir.
Klinik örneklerin proteomik profillemesinin önemli bir sınırlaması biyolojik örneklerin karmaşıklığıdır. Hücre hatları, plazma ve dokular4,5gibi hastalık proteomunun incelenmesi için birçok farklı örnek türü araştırılmıştır. Hücre hatları, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarını taklit etmek için in vitro deneylerde model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, hücre hatları ile ilgili önemli bir sınırlama, hücre kültürü sürecinde genotipik ve fenotipik değişiklikleri kolayca edinmeleridir6. Plazma gibi vücut sıvıları biyobelirteç keşfi için çekici bir kaynak olabilir; bununla birlikte, oldukça bol proteinler ve dinamik protein konsantrasyonu aralığı nedeniyle, plazma proteomik biraz daha zordur7. Burada, en bol proteinlerden kaynaklanan peptitler, kütle / yük oranı aynı olsa bile düşük bol proteinlerden elde edilenleri bastırabilir6. Son birkaç yılda tükenme ve fraksiyonasyon teknolojilerinde gelişmeler olmasına rağmen, iyi kapsama almak hala plazma proteomik8,9'un önemli bir sınırlaması olmaya devam etmektedir. Doku örnekleri hastalık bölgelerine en proksimal olduğu ve hastalık biyolojisi hakkında daha iyi içgörüler sağlamak için yüksek fizyolojik ve patolojik bilgiler sunduğu için dokuların hastalık biyolojisinin proteomik araştırılması için kullanılması tercih edilir10,11.
Bu yazıda doku örneklerinin nicel proteomikleri için basitleştirilmiş bir protokol sağladık. Bu tampon kütle spektrometresi bazlı incelemelerle uyumlu olduğu için doku lysate hazırlığı için 8 M üre içeren bir tampon kullandık. Bununla birlikte, tuzları kütle spektrometresine enjekte etmeden önce çıkarmak için peptitlerin temizlenmesi zorunludur. Unutulmaması gereken önemli bir nokta, trypsin 8 M üre konsantrasyonunda düşük aktivite sergilediğinden protein sindirimi için tripsin eklemeden önce üre konsantrasyonunu 1 M'nin altına düşürmektir. Nicel küresel proteomik iki yaklaşımı açıkladık: iTRAQ (göreceli ve mutlak niceleme için izobarik etiketler) ve etiketsiz nicelik (LFQ) kullanılarak etiket tabanlı nicelik. iTRAQ tabanlı nicel proteomik esas olarak biyolojik durumlarına göre değişen birden fazla numuneyi (örneğin, normal ve hastalık veya tedavi edilen örnekler) karşılaştırmak için kullanılır. Yaklaşım peptitlerin N-terminal birincil aminlerini etiketlemek için izobarik reaktifleri kullanır12. iTRAQ reaktifleri bir N-metil piperazin muhabir grubu, bir dengeleyici grubu ve N-terminal birincil peptit aminleri13ile reaksiyona sokulan bir N-hidroksi süksinid ester grubu içerir. Her durumdan sindirilmiş peptitler belirli bir iTRAQ reaktifi ile etiketlenir. Etiketlemenin ardından reaksiyon durdurulur ve farklı koşullardan etiketli peptitler tek bir tüpte biriktirilir. Bu kombine numune karışımı, tanımlama ve nicelik için kütle spektrometresi ile analiz edilir. MS/MS analizinden sonra düşük moleküler kütleli muhabir iyon parçaları üretilir ve proteinlerin nicelleştirilmesinde bu muhabir iyonlarının iyon yoğunlukları kullanılır.
Başka bir yaklaşım, etiketsiz niceleme, peptitleri kararlı izotoplarla etiketlemeden karmaşık numunelerdeki proteinlerin göreceli sayısını belirlemek için kullanılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FSN 10452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EASY-nLC1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer</td>
			<td>Thrermo</td>
			<td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples

Kütle spektrometreslerindeki son gelişmeler, sağlam ve tekrarlanabilir veri kümelerinin üretimiyle birlikte derin proteomik analizlerle sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, önemli teknik gelişmelere rağmen, hasta kanı, CSF ve doku gibi biyospepsimenlerden örnek hazırlama hala önemli zorluklar oluşturmaktadır. Biyobelirteçleri tanımlamak için, doku proteomik genellikle araştırma bulgularını kürsüden kliniğe çevirmek için çekici bir örnek kaynak sağlar. Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı gibi kanser ve nörodejeneratif hastalıkların erken tanısı için potansiyel aday biyobelirteçleri ortaya alabilir. Doku proteomik ayrıca proteinlerin bolluğuna dayanan çok sayıda sistemik bilgi verir ve ilginç biyolojik soruların ele alınmasına yardımcı olur.
Nicel proteomik analiz iki geniş kategoride gruplandırılabilir: etiket tabanlı ve etiketsiz bir yaklaşım. Etiket tabanlı yaklaşımda, proteinler veya peptitler SILAC (hücre kültüründe amino asitlerle kararlı izotop etiketlemesi) gibi kararlı izotoplar veya ICAT (izotop kodlu benzeşim etiketleri), TMT (tandem kütle etiketi) veya iTRAQ (göreceli ve mutlak nicelik için izobarik etiket) gibi kimyasal etiketler kullanılarak etiketlenir. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahiptir ve izobarik etiketler kullanılarak, tek bir deneyde birden fazla örnek analiz edilebilir. Etiketsiz yaklaşım, etiket tabanlı yaklaşımlara uygun maliyetli bir alternatif sağlar. Belirli bir kohorta ait yüzlerce hasta örneği, klinik özelliklere göre analiz edilebilir ve diğer kohortlarla karşılaştırılabilir. Burada, yaşam bilimlerindeki uygulamalar, özellikle biyobelirteç keşfi tabanlı projeler için çok önemli olan etiketsiz ve etiket tabanlı proteom profilleme yöntemlerini kullanan doku örnekleri için optimize edilmiş bir nicel proteomik iş akışı tanımladık.

Keşif proteomik için iki farklı yaklaşım kullandık: etiketsiz ve etiket tabanlı proteomik yaklaşımlar. SDS-PAGE'deki doku örneklerinin protein profili bozulmamış proteinleri göstermiştir ve proteomik analiz için düşünülebilir (Şekil 2A). Cihazın kalite kontrol kontrolü sistem uygunluk yazılımı ile izlendi ve cihaz performansındaki günsel varyasyonu gösterdi (Şekil 2B). BSA örneğinin 30 dakikalık LC gradyanı<strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples at JoVE.com

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Açıklanan protokol, iki yaklaşım kullanarak doku örneklerinin optimize edilmiş bir nicel proteomik analizini sağlar: etiket bazlı ve etiketsiz nicellik. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahipken, etiketsiz bir yaklaşım daha uygun maliyetlidir ve bir kohorttan yüzlerce örneği analiz etmek için kullanılır.

Doku Örneklerinin Kütle Spektrometresi Bazlı Av Tüfeği Proteomik Kapsamlı İş Akışı

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Proteinlerin doğru nicel ölçümleri, hastalığı biyolojiye geri anlamak için proteinler arasındaki dinamik ve mekansal işbirliğini anlamak için çok önemlidir. Bu deneyin genel amacı, doku örnekleri için entegre bir nicel proteomik iş akışı sağlamak ve biyobelirteç keşfi için etiketsiz ve etiket tabanlı protein profillemeyi birleştirmektir. Bu çalışmada, etiket tabanlı ve etiketsiz yaklaşımlar kullanarak proteinleri ölçmek için Orbitrap Fusion enstrümanını kullandık.Doku lizisi, bir LC-MS-MS deneyinin başarısı için en önemli adımlardan biridir. Boncuk dövme tüpüne 30 mg doku alın. PBS ile yıkadıktan sonra, sekiz azı dişi üre, Tris, NaCl ve MgCl2 içeren 300 mikroliter üre liziz tamponu ekleyin.Sonda sonicator kullanarak, dokunun içeriğini çiy. Bunu başka bir döngü için tekrarlayın. Tüpün dibinde sağlam bir doku gözlemlerseniz, tüpe zirkonyum boncuklar ekleyin ve dokuyu buz üzerinde beş dakika inkübasyon ile 90 saniye boyunca boncuk çırpıcı kullanarak homojenize edin.Hücre kalıntılarını üstndan ayırmak için örnekleri 6000 G civarında 15 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatant'ı taze bir tüpte toplayın ve çözeltiyi düzgün bir şekilde karıştırın. Bradford reaktifini kullanarak dokudaki protein konsantrasyonu ölçülsün.Bunun için, numunenin OD'sini 595 nanometre olarak ölçün ve bu ekranda gösterildiği gibi standart bir grafik kullanarak tahmin edin. Protein nicelimini takiben, lysates kalitesini kontrol etmek için% 12 SDS-PAGE jel üzerinde 10 mikrogram doku lysate çalıştırın. Çözelti içi sindirimin ilk adımı, TCEP kullanılarak disülfid bağların azaltılmasını içerir.TCEP'in eklenmesinden sonra, tüpün içeriğini 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Bir sonraki adım, azaltılmış disülfid bağların yeniden oluşmasını önlemek için alkilasyon içerir. İodoasetamid gibi bir alkilasyon maddesi ekleyin ve tüpü 10 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya bırakın.Kuluçkadan sonra, dört ila sekiz hacimli seyreltme tamponu ile seyrelterek son üre konsantrasyonunu bir azı dişinden daha az bire düşürür. Bu noktada, pH'ı kontrol etmeniz önerilir. Bir sonraki adım, tüpe tripsin eklenmesini ve verimli sindirim için tüpün bir gecede kuluçkaya yatırılmasını içerir.Ertesi gün, sindirilen peptitleri bir vakum konsantratöründe kurutun ve tuzdan arındırma adımına devam edin. Peptitlerin tuzdan arındırmasını gerçekleştirmek için C18 sahne uçlarını kullanın. 50 mikroliter metanol ekleyerek C18 sahne ucunu etkinleştirin, ucu iki dakika boyunca 1000 G'de santrifüjleyin.Şimdi, sahne ucunu yıkamak için % 0.1 formik aside 50 mikroliter asetonitril ekleyin ve yine ucu santrifüjleyin. Kurutulmuş sindirilmiş peptitleri% 0.1 formik asit 50 mikroliterde yeniden inşa edin. Yeniden inşa edilen peptitleri etkinleştirilmiş sahne ucuna ekleyin.Bu adımı en az dört kez yineleyin. Numuneyi yıkamak için% 0.1 formik asit 50 mikroliter ekleyin ve santrifüjasyon adımını tekrarlayın. Peptitlerin salınımı için, % 0.1 formik aside% 40 ACN'lik 50 mikroliter ekleyin ve santrifüjleme ile sahne ucundan geçirin.Bu adımı % 50 ve% 60 ACN ile% 0.1 formik asitte tekrarlayın ve filtratları taze bir tüpte toplayın. Tuzdan arındırımış peptitleri vakumlu bir konsantratör kullanarak kurutun. LC-MS-MS çalıştırmadan önce Scopes yöntemini kullanarak peptitleri ölçün.Bunun için, bir mikro damla plakasının kuyusuna iki mikrolitre yeniden inşa edilmiş numune yükleyin ve emiciliği 205 nanometre ve 280 nanometre olarak ölçün. Konsantrasyonu bu slaytta açıklanan formülden hesaplayın. Tuzdan arındırılanmış peptitler kurutulduktan sonra etiket bazlı niceleme için hazırdır.iTRAQ etiketleme için, kurutulmuş peptitler iTRAQ etiketleme kitinde sağlanan 20 mikroliter çözünme tamponunda yeniden inşa edilmelidir. Kitte bulunan şişeden etanol ekleyerek etiketleri yeniden inşa edin ve iyice karıştırın. Tüm adımların üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilmesi tavsiye edilir.Homojen bir şekilde karıştırılan iTRAQ etiketlerini ilgili tüplerine ekleyin ve etiketleme reaksiyonun gerçekleşmesine izin verin. Reaksiyonun sonunda, MS sınıfı su ekleyerek tüpteki fazla sınırsız etiketi söndürin ve yarım saat ila bir saat kuluçkaya yatırın. Şimdi, etiketli tüm içeriği tek bir tüpe aktarın ve etiketli peptitleri kurutun.Örnekleri% 0.1 formik asitte yeniden inşa ettikten sonra, NanoLC'nin otosamplerini açın ve örnekleri otomatik örnekleyicinin içine yerleştirin. Numuneler otosampe yerleştirildikten sonra sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi için doğru parametrelerin belirlenmesi önemlidir. Burada, LC-MS kullanarak hem etiketsiz nicelik hem de iTRAQ tabanlı nicelik için parametreleri açıklıyoruz.Etiketsiz nicelik durumunda, tek bir kırılmamış numune enjekte edilirken 120 dakikalık bir degrade kullanılmıştır. Bu süre, örnek karmaşıklığına bağlı olarak artırılabilir veya azaltılabilir. Bu deneyde, %1 formik asitte %80 asetonitril olan B çözeltisi için aşağıdaki gradyan ile dakikada 300 nanoliterlik bir akış ayarlanmıştır.Aynı şekilde, bir iTRAQ deneyi için bir degrade ayarlayabiliriz. Numuneler kırılmadığı için 90 dakikalık bir degrade kullanılmıştır. Hem etiketsiz niceleme hem de iTRAQ etiket tabanlı niceleme için MS parametreleri burada görülebilir.İlk adım, genel parametrelere tıklayarak uygulama modunu ayarlamayı içerir. Peptit modunu seçin ve yöntem süresini kullanılan LC degradeye göre ayarlayın. Deneme için tarama parametrelerini tanımlayın.MS-OT seçeneği tıklatınce parametreler görünür hale gelir. Kullanılan dedektör türü Orbitrap olarak ayarlanır. Bu cihazdaki diğer seçenek bir iyon tuzağı içerir.Çözünürlük 60.000 olarak ayarlanmıştır ve denemenin ihtiyacına ve türüne bağlı olarak mevcut farklı seçenekler arasında seçim yapabilirsiniz. Kütle aralığı normaldir ve tarama aralığı 375 ile 1700 arasında ayarlanır. Diğer parametreler MS Uygulaması için varsayılandır.Yoğunluk eşiği ve şarj durumu iki ile altı arasında ayarlandı. Dinamik dışlama 40 saniye olarak ayarlandı ve kütle toleransı 10 olarak tutuldu. Sonraki parametre kümesi MS-MS parametrelerini içerir.İzolasyon modu dörtgen, yalıtım penceresi ikiye ayarlanmış, yalıtım uzaklığı kapalı olarak ayarlanmış ve etkinleştirme türü genellikle proteomik deney için HCD'dir. Çarpışma enerjisi sabitlenebilir veya yardımcı olabilir. Etiketli numuneler daha yüksek çarpışma enerjileri gerektirir, bu nedenle iTRAQ deneyleri için çarpışma enerjisinin 35'e ayarlanabilmesi tavsiye edilirken, LFQ deneyleri için 30 olarak ayarlanabilir.Burada kullanılan dedektör tipi Orbitrap'tır. Tarama aralığı modu otomatik olacaktır. Diğer parametreler iTRAQ denemeleri ve etiketsiz nicel denemeler için varsayılandır.Özete tıklanın, deneme için kullanılan tüm LC ve MS parametrelerine genel bir bakış sağlayacaktır. Her parametreye bir göz atabilir ve düzeltmeyi yapabilirsiniz. Bu yapıldıktan sonra, dosyaya tıklayın ve bir yöntem dosyası olarak kaydedin.Kaydettikten sonra, yöntemi çalıştırabilirsiniz ve ham dosyaları alırsınız. Ve sonra bu ham dosyalar Proteome Discoverer yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. Bu rakam, BSA'nın sıra kapsamını üç teknik yinelemede gösterir, bu da üç yinelemede% 91'dir.Bu, cihazın tekrarlanabilirliğini gösterir. Şimdi, bu rakam, üç farklı biyolojik örnekte tanımlanan peptit spektral eşleşmeleri, peptitler ve proteinlerin sayısındaki tekdüzeliği göstermektedir, bu da yine cihazın tekrarlanabilirliği hakkında bir fikir vermektedir. Burada, Venn diyagramı etiketsiz deney ve etiket tabanlı deneyde üç farklı örnekte tanımlanan yaygın ve özel proteinleri temsil eder.Bu çubuk grafikler, LFQ ve iTRAQ deneylerinde tanımlanan%1 FDR'den sonra peptit spektral eşleşmelerinin, peptit gruplarının, toplam proteinlerin, protein gruplarının ve protein sayısını gösterir. Biyolojik örneklerin doku proteomikleri, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarıyla ilişkili yeni potansiyel biyobelirteçleri keşfetmemizi sağlar. Doku nicel proteomik analizi için açıklanan protokol tekrarlanabilir iyi kapsama verileri sağlar.Teknik çoğaltmaların kullanımı, numuneler farklı zaman noktalarında çalıştırılsa bile iyi tekrarlanabilirlik sağlar. Burada, doku örneklerinin iki nicellik yöntemi kullanılarak analizini gösterdik: etiketsiz ve etiket bazlı proteomik. Nicel proteomik tekniklerin seçimi, numune sayısına, MS platformlarının kullanılabilirliğine ve ele alınacak biyolojik soruya bağlı olabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Kapsamlı Cochlear Proteome tanımak için aşağıdan yukarıya ve Shotgun Proteomiks

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Genom kapsamındaki bir tanımlama ve ifade Meta-Analizi ATL E3 Ubikuitin ligaz gen ailesinin asma için kapsamlı iş akışı

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...