Name: high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines
Uploaded: 2020-11-09T15:15:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

K.M.R, S.D.M, M.U. og D.L.D er alle ansatte i Promega Corporation

1. Slutpunktsnedbrydningsundersøgelser med HiBiT CRISPR-målproteiner i lytisk format med valgfri cellelevedygtighedsfluorescensanalyse
<ol><li>Forberedelse og plettering af pattedyrs klæbende eller suspensionscellelinje<ol><li>Celletætheden justeres til 2,22 x 105/ml ved fortynding i passende cellemedier, der anvendes til passaging og cellevækst.</li>
		<li>Dispenser celler i plader med mindst 3 brønde pr. Forsøgs- og kontroltilstand. Dispenser 90 μL (20.000 celler) pr. brønd cellesuspension i 96-brønds hvide plader. For 384-brøndformat dispenseres 36 μL (8.000 celler) pr. brønd cellesuspension i 384-brønds hvide plader.</li>
	</ol></li>
	<li>Fremstilling og tilsætning af forbindelser<ol><li>Der fremstilles serielt fortyndede PROTAC- eller nedbrydertestforbindelsesplader i 1.000x slutkoncentration i 100 % DMSO. Fortynd det derefter til 10x endelig koncentration i cellekulturmediet. Tilføj et tilsvarende volumen DMSO til mediet, der skal bruges som en ingen sammensat DMSO-kontrol.</li>
		<li>For 96-brøndformat tilsættes 10 μL 10x forbindelse og kontrolopløsninger til 90 μL celler. For 384-brøndformat tilsættes 4 μL 10x forbindelse og kontrolopløsninger til 36 μL celler.</li>
		<li>Pladerne inkuberes i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i den ønskede tid eller under forhold, der er optimale for deres vækst. BEMÆRK: Da dette er et endepunktsassay, vil test af flere tidspunkter kræve forberedelse af separate nedbrydningsplader for hvert tidspunkt, som beskrevet i ovenstående trin 1.1.2. Inkubationstider til påvisning af sammensat medieret nedbrydning er meget variable og afhænger sandsynligvis også af sammensat koncentration. Foreslåede indledende tidspunkter ville være 6 timer og 24 timer.</li>
		<li>Hvis du måler endepunkts selvlysende detektion uden den valgfri måling af cellelevedygtighed, skal du fortsætte direkte til trin 1.3 nedenfor. Hvis du udfører multiplexing med måling af cellelevedygtighed, skal du fortsætte til næste afsnit 1.4 nedenfor.</li>
	</ol></li>
	<li>Lytisk måling af celler<ol><li>Umiddelbart før HiBiT-lytiske målinger fremstilles 2x lytisk detektionsreagens ved at tilsætte 20 μL lytisk substrat og 10 μL LgBiT-protein pr. 1 ml af den lytiske buffer. Forbered nok 2x detektionsreagens til antallet af brønde, der skal analyseres, inklusive ekstra volumen til at tage højde for pipetteringsfejl (dvs. antal brønde + 10%).</li>
		<li>Tilsæt forberedt lytisk detektionsreagens til celler. For 96-brøndformat tilsættes 100 μL 2x lytisk detektionsreagens til hver brønd, der indeholder 100 μL celler. For 384-brøndformat tilsættes 40 μL 2x lytisk detektionsreagens til hver brønd, der indeholder 40 μL celler. Bland pladen på en microplate vortex mixer i 10-20 min ved 350 o / min.</li>
		<li>Mål luminescens på et luminometer, der er i stand til at aflæse luminescens i en 96- eller 384-brøndplade.</li>
	</ol></li>
	<li>Multiplexing af cellens levedygtighed (ekstraudstyr) BEMÆRK: Dette trin udføres ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt CellTiter-Fluor (CTF) kit (se Materialetabel).<ol><li>30-40 minutter før den ønskede endepunktsmåling fremstilles en 6x cellelevedygtighedsdetekteringsreagensopløsning ved at tilføje 10 μL af substratet til 2 ml af assaybufferen. Forbered nok 6x reagens til hver brønd, der skal analyseres, inklusive ekstra volumen til pipetteringsfejl (dvs. antal brønde + 10%).</li>
		<li>Tilsæt det forberedte reagens til brønde. For 96-brøndformat tilsættes 20 μL 6x reagens til hver brønd, der allerede indeholder et volumen på 100 μL. For 384-brøndformat tilsættes 8 μL 6x reagens til hver brønd, der indeholder 40 μL celler. Bland kort på en mikroplade hvirvelblander, og inkuber derefter pladen i 30 minutter i en 37 ° C inkubator.</li>
		<li>Ved det ønskede målepunkt (dvs. 6 eller 24 timer efter behandling, trin 1.2.3) måles fluorescens på et instrument, der er i stand til at læse fluorescens (380-400 nmEx/505 nmEm) i 96- eller 384-brøndformat.</li>
		<li>Forbered 2x lytisk detektionsreagens ved at tilsætte 20 μL lytisk substrat og 10 μL LgBiT-protein pr. 1 ml lytisk buffer. Forbered nok 2x detektionsreagens til antallet af brønde, der skal analyseres, inklusive ekstra volumen for at tage højde for pipetteringsfejl (f.eks. Antal brønde + 10%).</li>
		<li>Tilsæt det forberedte lytiske detektionsreagens til brønde. For 96-brøndformat tilsættes 120 μL 2x lytisk detektionsreagens til hver brønd, der allerede indeholder et volumen på 120 μL. For 384-brøndformat tilsættes 48 μL 2x lytisk detektionsreagens til hver brønd, der allerede indeholder et volumen på 48 μL. Bland pladen på en microplate vortex mixer i 10-20 min.</li>
		<li>Mål luminescens på et luminometer, der er i stand til at læse luminescens i 96- eller 384- brøndplader.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantificering af nedbrydning og cellelevedygtighed<ol><li>Gennemsnit af de relative lysenheder (RLU) fra DMSO-styringen på det målte tidspunkt. Brug denne værdi som basisproteinniveau for målet til at beregne fraktioneret nedbrydning ved at normalisere alle andre behandlinger, der testes på samme tidspunkt, til denne værdi. For eksempel, hvis den gennemsnitlige RLU for DMSO-kontrolbrøndene ved 6 timer var 10.000, og RLU for en given sammensat behandling ved 6 timer var 5.000, ville den fraktionerede nedbrydning blive beregnet som 5.000 ÷ 10.000 = 0,5 (ligning 1). Ligning 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Bestem den procentvise nedbrydning fra fraktioneret RLU: Ligning 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>Fraktioneret RLU eller % nedbrydning afbildes på bestemte tidspunkter for at rangordne forbindelsernes aktivitet.</li>
		<li>Du kan også analysere data for relativ fluoresecence unit (RFU) til måling af cellelevedygtighedsanalyse ved at sammenligne værdierne fra alle behandlinger med DMSO-kontrollen. Hvis der observeres et signifikant fald i RFU for enhver behandling i forhold til DMSO-kontrollen, kan nedbrydningsdataene yderligere normaliseres til cellelevedygtighedsanalysedataene for at bestemme ændringer i proteinniveau i forhold til tab i cellelevedygtighed.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kinetisk nedbrydning i realtid af HiBiT CRISPR-målproteiner og valgfri cellelevedygtighedsluminescensanalyse
BEMÆRK: Evnen til at udføre kinetisk screening og nedbrydning kræver LgBiT-protein-co-ekspression i cellen, som tidligere er beskrevet18,19,63. Dette kan opnås via forbigående transfektion af en LgBiT-vektor, brug af BacMam LgBiT eller ved at udføre HiBiT CRISPR-indsættelse i en LgBiT-stabil cellelinje.
<ol><li>Plating af klæbende cellelinjer.<ol><li>Fjern medium fra cellekolbe ved aspiration, vask celler med DPBS, dissocier celler med 0,05% trypsin-EDTA, og lad celler adskille sig fra kolbens bund. For suspensionscellelinjer fortsættes til punkt 2.2.</li>
		<li>Neutraliser trypsin ved hjælp af serumholdigt cellekulturmedium, bland for at indsamle og resuspendere celler og overføre cellesuspension til et konisk rør.</li>
		<li>Drej cellerne ned ved 125 x g i 5 min. Cellekulturmediet kasseres, og det resuspenderes i et tilsvarende volumen frisk cellekulturmedium.</li>
		<li>Pladeceller i analyseplader med mindst tredobbelte brønde pr. Forsøgs- og kontroltilstand. For 96-brønds format tæller for at estimere celletæthed, juster densitet til 2 x 105 celler / ml i assay medium og dispenser 100 μL (20.000 celler) pr. brønd i en 96-brøndplade. For 384-brønds format tæller for at estimere celletæthed, juster densitet til 4,44 x 105 celler / ml i analysemediet og dispenser 18 μL (8,000 celler) pr. Brønd.</li>
		<li>Inkubere pladerne ved 37 °C, 5 % CO2 natten over eller under forhold, der er optimale for deres vækst.</li>
	</ol></li>
	<li>Plating af suspensionsceller<ol><li>Juster celletætheden til 2,22 x 105 celler/ml i CO2 -uafhængigt medium suppleret med 10 % FBS og 1x Endurazin (1:100 fortynding af stamreagenset).</li>
		<li>Pladeceller i analyseplader med mindst 3 brønde pr. Forsøgs- og kontroltilstand. For 96-brøndformat dispenseres 90 μL (20.000 celler) pr. Brønd. For 384-brøndformat dispenseres 36 μL (8.000 celler) pr. Brønd. BEMÆRK: For suspensionscellelinjer, der har lav signal til baggrund (S: B) luminescens, f.eks. når man arbejder med CRISPR-puljer i stedet for kloner, er det muligt at øge luminescensen ved at øge antallet af celler belagt, op til 100.000 celler / brønd i 96-brøndformat eller 40.000 celler / brønd i 384-brøndformat.</li>
	</ol></li>
	<li>Kinetiske nedbrydningsassays ved hjælp af HiBiT CRISPR-celler, der udtrykker LgBiT<ol><li>For suspensionsceller, der allerede indeholder Endurazine, og som blev medtaget ved pletteringstrinnet i punkt 2.2., fortsættes direkte til trin 2.3.3. For vedhæftede cellelinjer forberede Nano-Glo Endurazine opløsning. For 96-brøndformat fremstilles en 1x opløsning af Endurazin ved at fortynde stamreagens 1:100 til CO2 -uafhængigt medium suppleret med 10% FBS. For 384-brøndformat fremstilles en 2x opløsning af Endurazin ved at fortynde stamreagens 1:50 til CO2 -uafhængigt medium suppleret med 10% FBS.</li>
		<li>Tilsæt Endurazinopløsning til hver brønd af klæbende celler. Til 96-brøndformat aspiratmedium og tilsæt 90 μL 1x Endurazin-opløsning. For 384-brøndformat tilsættes 18 μL 2x Endurazinopløsning til 18 μL celler. Aspirer ikke medium, da nedbrydningsanalysen udføres i en 50:50 blanding af kulturmedium og CO2 uafhængigt medium i 384-brøndformat.</li>
		<li>Inkubere suspensions- eller klæbende celleplader indeholdende Endurazin i 2,5 timer i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 for at tillade luminescens at balancere.</li>
		<li>Der fremstilles en 10x koncentration af test-PROTAC-titrering i CO2 -uafhængigt medium, og der tilsættes 10 μL til hver brønd med 96 brøndplader eller 4 μL til 384-brøndspladen. For forbindelser med ukendt effekt anbefales en endelig koncentration på 1-10 μM ved det højeste punkt som udgangspunkt.</li>
		<li>Der indsamles kinetiske målinger af luminescens i luminometer, der er præ-ligestillet til 37 °C i en periode mellem 0-48 timer. Tidsintervallerne for måling kan tilpasses til hvert eksperiment, men et anbefalet indledende eksperiment ville være luminescensmålinger hvert 5-15 minut i 24 timer eller den ønskede tid.</li>
	</ol></li>
	<li>Valgfri cellelevedygtighedsmultiplexanalyse i samme brønd efter endelig kinetisk måling BEMÆRK: Dette assay udføres med et kommercielt tilgængeligt CellTiter-Glo (CTG) kit (se Materialetabel).<ol><li>Ligevægtig CTG-reagens til stuetemperatur.</li>
		<li>Efter nedbrydningsmåling på det sidste tidspunkt for den kinetiske analyse tilsættes 100 μL (96-brøndsplade) eller 40 μL (384-brøndsplade) reagens pr. pladebrønd og blandes på en pladeryster ved 500-700 o / min (96-brøndsplade) eller en mikropladehvirvelblander (384-brøndplade) i 5 minutter.</li>
		<li>Inkuber pladen ved stuetemperatur i 30 minutter for at muliggøre cellelysis og slukning af HiBiT-signal.</li>
		<li>Mål den samlede luminescens på et luminometer ved at følge producentens anbefaling.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantificering af kinetiske nedbrydningsprofiler<ol><li>Ved hjælp af de indsamlede kinetiske luminescensmålinger normaliseres de rå RLU'er for hver PROTAC-koncentration til replikatgennemsnittet DMSO-tilstand på hvert tidspunkt for at tage højde for ændringer i fri furimazinkoncentration over tid. Beregn fraktioneret RLU ved hjælp af ligning 1. Ligning 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Fra nedbrydningskurverne skal du tilpasse en enkeltkomponent eksponentiel henfaldsmodel ved hjælp af ligning 2 til den indledende nedbrydningsdel af hver kurve til det punkt, hvor dataene når et plateau. BEMÆRK: Det kan være nyttigt at udelukke de første par datapunkter fra pasformen, da der kan være en kort forsinkelse, før nedbrydning observeres. Ligning 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>Fra ligning 2 bestemmes parameteren ƛ, som repræsenterer nedbrydningshastighedskonstanten og plateauet, som repræsenterer den laveste mængde protein, der er tilbage.</li>
		<li>Beregn Dmax, som er den maksimale fraktionerede mængde nedbrudt protein og beregnes som 1-Plateau.</li>
		<li>Dmax afbildes for hver koncentration af PROTAC for at bestemme en tidsuafhængig nedbrydningsstyrkekurve.</li>
		<li>Dmax50-værdien for plottet bestemmes i 2.3.5 for at analysere effektiviteten af forbindelser. BEMÆRK: For at bestemme en DC50 på et bestemt tidspunkt skal du afbilde den beregnede procentvise nedbrydning for hver koncentration på det valgte tidspunkt. Dette kan angives som DC 50 t = 4 h eller DC50 t = 12 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

Promega Corporation er den kommercielle ejer ved tildeling af patenter af HiBiT og NanoLuc teknologier og applikationer.

Vi præsenterer her to metoder til screening af nedbrydningsforbindelsesaktivitet i enten endepunktslytisk format eller levende cellekinetisk tilstand. Disse tilgange er baseret på de samme selvlysende måleprincipper, men giver alligevel forskellige detaljeringsniveauer og forståelse. Valget af en af tilgangene vil sandsynligvis afhænge af screeningsmål og størrelsen af det sammensatte bibliotek. For store sammensatte screeningsdæk eller primære skærme til at observere enhver påviselig nedbrydning tilbyder endpoint lytisk screening følsom og effektiv kompatibilitet med høj kapacitet, hvor andre endepunktstilgange, såsom western blot eller massespektrometri, kan være enten upraktiske eller vanskelige at tilpasse14. Et udgangspunkt for disse skærme kunne udføres med et begrænset antal koncentrationer og tidspunkter. Anbefalede indledende koncentrationer til test ligger i området 100 nM-10 μM for at tage højde for indledende nedbrydere med lav styrke, dårlig permeabilitet eller i nogle tilfælde med meget potente forbindelser, tilstedeværelsen af en krogeffekt. Det anbefales endvidere, at mindst to forskellige tidspunkter testes for at fastslå tidlig nedbrydning ved 4-6 timer og latent eller vedvarende nedbrydning ved 18-24 timer. Forbindelser, der udviser høj nedbrydningsstyrke og on-target-mekanisme, observeres let inden for en tidsramme på 4-6 timer, mens nedbrydning eller tilsyneladende proteintab, der kun observeres på senere tidspunkter, kan skyldes en række mekanismer. Det anbefales stærkt at overvåge cellens levedygtighed på både tidlige og sene tidspunkter, således at proteintab kan afkobles fra tab på grund af celledød. I lighed med enhver form for selvlysende eller fluorescerende assay er der et potentiale for forbindelser i biblioteker til at forstyrre eller hæmme signal, derfor vil ortogonale opfølgningseksperimenter med blyforbindelser ved hjælp af ikke-relaterede fusioner eller alternative tilgange til overvågning af proteinniveau være vigtige for at vurdere, at tab af RLU i disse assays er direkte forbundet med målproteinnedbrydning.
Evnen til at screene i levende cellekinetisk format over længere perioder afhænger i høj grad af analysesignalet til baggrunden (S: B). Faktorer, der bidrager til S: B, inkluderer ekspressionsniveauet for selve målproteinet, som kan spænde over flere størrelsesordener, effektiviteten af LgBiT-ekspression i cellelinjen valgt til peptidindsættelse, og tilgængeligheden af det mærkede mål til komplementering i dets forskellige indfødte komplekser. Vi har etableret et generelt afskæringskrav bestående af en S: B på 15 for med succes at måle nedbrydning i kinetisk tilstand med enten Endurazine eller Vivazin. S:B bestemmes ved at måle basissignalet for de HiBiT-redigerede celler, der co-udtrykker LgBiT i forhold til uredigerede forældreceller, der udtrykker LgBiT alene i nærværelse af enten Endurazin eller Vivazine levende cellesubstrater. Vivazin vil producere et højere selvlysende signal, men vil henfalde hurtigere end Endurazin og kan begrænse signaloptagelse til 24 timer eller mindre. Desuden kan S:B også være meget afhængig af, om der anvendes CRISPR-puljer eller kloner. For mål i cellelinjer, der er mere modtagelige og har høj effektivitet til CRISPR / Cas9-teknik, kan en heterogen CRISPR-poolpopulation af redigerede celler have tilstrækkelig S: B til kinetisk analyse. For mål i vanskeligere cellelinjer, hvor mindre effektiv genomisk integration via CRISPR resulterer i puljer med lav S: B, kan det være nødvendigt at isolere CRISPR-kloner for at berige redigerede populationer og opnå en tilstrækkelig høj S: B til kinetisk analyse. For ethvert af disse scenarier, hvis S: B er mindre end 15 med enten Endurazin- eller Vivazin-substrater, anbefales endepunktslytisk screening.
For bedre forståelse og karakterisering af forbindelser, herunder bestemmelse af en nedbrydningsprofil med kvantitative parametre, er kinetisk analyse i realtid i levende celler den anbefalede screeningsmetode14,18. Ligesom endepunktsanalyse diskuteret ovenfor kan indledende kinetisk screening udføres med et begrænset antal koncentrationer i området 100nM-10μM på høj kapacitet. I 384-brøndformat kan over 100 forbindelser let screenes i tre eksemplarer i en koncentration på en enkelt plade. De resulterende nedbrydningsprofiler vil ikke kun give vejledning om omfanget af den observerede nedbrydning, men også nedbrydningshastigheden, nedbrydningens varighed og potentiel genvinding af proteinet14,18 (figur 2 og figur 3). Nedbrydningsprofilens former giver også værdifuld information. Specifikke og potente nedbrydere viser ofte et indledende hurtigt tab af målproteinet til et plateau i løbet af få timer18,53, mens andre mekanismer såsom transkriptionel feedback eller sammensat toksicitet typisk resulterer i mere lineært tab af proteinet over tid. Disse detaljer og nuancer savnes med slutpunktslytisk analyse, og med realtidsanalyse over 24-48 timer behøver man ikke at forudsige tiden for at fange den sande Dmax inden for sæt af nye eller ukendte forbindelser.
Kinetik i realtid giver også mulighed for effektiv dosisresponsscreening for bedre at forstå forbindelseseffektivitet, hvordan sammensat koncentration påvirker den indledende nedbrydningshastighed og giver muligheder for at rangere forbindelser baseret på mere end en parameter. Klassiske målinger af nedbrydningsstyrke involverer DC50-beregninger på et bestemt tidspunkt baseret på tilsyneladende nedbrydningsmaksima. I modsætning hertil inkorporerer vores kinetiske tilgang til evaluering af styrke det sande nedbrydningsmaksimum ved hver koncentration, uanset hvornår det sker i tid18. Vi kalder denne måling af kinetisk nedbrydningsstyrke, Dmax5018. Analyse på denne måde tegner sig for forbindelser, der kan initiere nedbrydning langsommere ved lavere koncentrationer og derfor tager længere tid efter behandling for at nå deres Dmax. Det kan være særligt informativt at rangere forbindelser på både nedbrydningshastighed og Dmax. For de mest potente nedbrydere vil dette yderligere differentiere langsomme, men potente nedbrydere fra dem, der er både hurtige og potente. Sammen er både lytisk og levende cellekinetisk screening ved hjælp af HiBiT CRISPR-cellelinjer kraftfulde tilgange, der giver et mere omfattende billede af målrettet proteinnedbrydning, sammensat funktion og muliggør screeningsprocessen fra indledende aktivitetsvurdering til nedstrøms kemisk optimering gennem forbedring af nøglenedbrydningsparametre.

Målrettet proteinnedbrydning har vist sig at være et af de hurtigst voksende områder inden for opdagelse af småmolekyler, stærkt styrket af den terapeutiske succes med immunmodulerende molekylære limforbindelser (f.eks. IMiD) til kræftbehandling og lovende tidlige kliniske forsøgsdata for proteolyse Målretning af kimærforbindelser 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Målrettede proteinnedbrydningsforbindelser fungerer ved at bringe et målprotein i nærheden med E3 ligase maskinproteiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Denne sammensatte rekruttering af målproteinet til E3-ligasen fører til målproteinets ubiquitination og nedbrydning via ubiquitin proteasomal vej (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historisk set har screeningsprogrammer for små molekyler til opdagelse af lægemidler været afhængige af indledende biokemiske assays for at vurdere aktivitet og rangordensforbindelser. Dette har imidlertid givet en betydelig udfordring for målrettede proteinnedbrydere, hvis ultimative aktivitet, nedbrydning via proteasomet, er afhængig af en kaskade af cellulære hændelser 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. De mange veje og kompleksiteten af proteinkomplekser, der kræves for den vellykkede målnedbrydning, nødvendiggør cellulære assaymetoder til tidlig screening og triaging af indledende forbindelser. I øjeblikket mangler tilgængeligheden af teknologier til overvågning af målproteinnedbrydning på en måde med høj kapacitet i forbindelse med det cellulære miljøalvorligt 14. Her vil vi præsentere protokoller for realtids kinetisk levende celle eller endepunkts lytisk nedbrydningsaktivitetsvurdering ved hjælp af CRISPR / Cas9 endogent mærket HiBiT-målcellelinjer 18,19,20 for at overvåge tabet af målproteinet via selvlysende måling efter behandling med nedbrydende forbindelser10,11,18,19.
For at opnå en vellykket nedbrydning af terapeutiske mål og for at udvide det lægemiddelbare proteom er der opstået adskillige tilgange og typer af nedbrydere, som kan målrette mod en bred vifte af proteiner til destruktion, herunder dem, der er lokaliseret ved eller i plasmamembranen, lysosomer, mitokondriemembraner, cytoplasma og kernen 21-57. De to primære klasser af forbindelser, der er mest grundigt undersøgt, er molekylære lim og protein rettet mod cimeras 2,4,5,6,7,12,26. Molekylære lim er monovalente, således typisk mindre i størrelse, og letter en ny protein: protein interaktion grænseflade med et målprotein ved binding til en E3 ligase komponent 2,12,26. De er oftest nedbrydere, der binder til Cereblon (CRBN) E3 ligase komponent 2,12,26,55,56,57. For nylig viser spændende nye eksempler, der bruger andre E3 ligasemaskiner, såsom DCAF1558,59,60 og CDK/cyclin rekruttering til DDB145, potentialet for udvidelse af denne klasse af forbindelser. I modsætning hertil er PROTAC'er større, bivalente molekyler, der består af en målbindende ligand, oftest en hæmmer, der via en kemisk linker er forbundet til et E3-ligasehåndtag 1,3,4,5,7,13. Som sådan er disse forbindelser i stand til direkte binding til både E3-ligasen og målproteinet 1,3,4,5,7,13. Talrige proteiner har vist sig at være nedbrudt via disse bivalente molekyler, og de mest anvendte E3 ligase håndtag rekrutterer enten CRBN eller Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Antallet af tilgængelige håndtag til E3 ligaserekruttering i kimærer rettet mod proteolysedesign vokser imidlertid hurtigt, hvilket udvider kapaciteten i denne klasse af forbindelser med potentiale til at nedbryde forskellige målklasser samt forbedre celle- eller vævstypespecificitet 24,48,61,62 . Kombineret med det minimale krav om at engagere et målprotein, selv med marginal affinitet, har nedbrydningsforbindelser løfte om at udvide det lægemiddelbare proteom.
Karakterisering af den cellulære dynamik i proteintab såvel som potentiel proteingendannelse efter behandling er afgørende for at forstå nedbrydningsforbindelsens funktion og effektivitet. Selvom det er muligt at studere endogene ændringer i proteinniveauet i relevante cellulære systemer med western blot-antistofassays eller massespektrometri, er disse tilgange vanskelige at tilpasse til screeningsformater med høj kapacitet, har begrænset kvantificeringskapacitet eller evne til at måle kinetiske ændringer på mange tidspunkter14. For at løse disse udfordringer har vi udviklet et pladebaseret cellulært selvlysende system til overvågning af ændringer i endogene proteinniveauer, som anvender genomisk indsættelse via CRISPR / Cas9 af 11 aminosyremærket, HiBiT, til stedet for ethvert centralt nedbrydningsmål18,19,20. Dette peptid supplerer med høj affinitet til sin bindingspartner, LgBiT, for at producere lys luminescens i nærværelse af dets substrat 18,19,20,63, hvorved disse mærkede endogene proteiner lyser i celler eller lysater18,19,20,63 . De relative lysenheder (RLU'er) målt med et luminometerinstrument er direkte proportionale med de mærkede målproteinniveauer 18,19,20,63. Med udviklingen af stabiliserede luciferasesubstrater er kinetiske proteinniveaumålinger i realtid over 24-48 timers tidsrammer mulige 18,53,64. Dette gør det muligt at bestemme en fuldstændig nedbrydningsprofil for et givet mål ved en given sammensat koncentration, herunder kvantitativ analyse af initial nedbrydningshastighed, nedbrydningsmaksimum (Dmax) og genopretning efter sammensat behandling18,53. Hvis man screener store biblioteker af nedbrydningsforbindelser, kan slutpunktsanalyse imidlertid også let udføres i 384-brøndformat ved forskellige lægemiddelkoncentrationer og udpegede tidspunkter.
De protokoller, der præsenteres i dette manuskript, repræsenterer cellulære screeningsstrategier for målrettede proteinnedbrydningsforbindelser, der gælder for alle typer nedbrydere. Brugen af HiBiT CRISPR-cellelinjer sammen med disse protokoller er imidlertid ikke begrænset til proteinnedbrydning, snarere er de generelle værktøjer til overvågning af ethvert endogent målproteinniveau, som kan moduleres efter behandling for at studere virkningen af forbindelser eller endda resistensmekanismer 20,65,66. En forudsætning for disse selvlysende baserede detektionsmetoder er en CRISPR-endogent mærket HiBiT-målcellelinje, hvilket er kritisk, da det muliggør følsom selvlysende detektion, samtidig med at der opretholdes endogen målekspression og indfødt promotorregulering18,19,20. Der er gjort betydelige fremskridt med at anvende CRISRP/Cas9 til indsættelse af genomiske tags, især i skalerbarhed 20 og med høj detektionsfølsomhed, i forskellige formater, herunder CRISPR-puljer eller kloner med enten heterozygote eller homozygote alleliske indsættelser18,19,20. Det er muligt at anvende eksogen ekspression af HiBiT eller andre reporterfusioner i celler i stedet for endogen mærkning, men der bør udvises betydelig forsigtighed ved hjælp af systemer med proteinoverekspression14,18. Disse kan føre til artefakter i forståelsen af ægte sammensat styrke og proteingendannelsesdynamik14,18, herunder potentielle transkriptionelle feedback-sløjfer aktiveret efter målnedbrydning. Derudover kan forbindelser i tidlig fase med lav styrke gå glip af og præsentere sig som falske negativer i screening. Da proteintab kan skyldes sammensat induceret toksicitet og celledød, indeholder de her beskrevne protokoller stærkt anbefalede, men valgfri cellelevedygtighed selvlysende eller fluorescerende assays parret med nedbrydningsprotokollen. Der er to hovedafsnit til protokollen, lytisk endepunkt og levende cellekinetisk screening. Inden for hver af disse sektioner er der inkluderet indstillinger for multipleksede cellelevedygtighedsmålinger i slutpunkts- eller kinetiske formater. Overvågning af ændringerne af det mærkede endogene protein kræver komplementering med LgBiT i celler. Derfor henviser afsnittet om kinetisk screening til vigtige protokoller for introduktionen af dette, som kan opnås via forbigående eller stabil ekspression og er afgørende for at udføre de levende celle selvlysende målinger. Alle tilgange, der præsenteres her, muliggør hurtig rangordinering og aktivitetsvurdering af forbindelser, hvilket muliggør tidlig fase sammensat screeningsindsats og hurtigere identifikation af blynedbrydere.
Denne protokol er designet til undersøgelse af nedbrydningsforbindelser i forbindelse med en HiBiT CRISPR-cellelinje. Protokoller til generering af HiBiT CRISPR-indsættelser til adskillige mål er blevet skitseret i flere nylige publikationer18,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

Målrettede proteinnedbrydningsforbindelser, herunder molekylær lim eller proteolyse rettet mod kimærer, er en spændende ny terapeutisk modalitet inden for opdagelse af lægemidler med små molekyler. Denne klasse af forbindelser inducerer proteinnedbrydning ved at bringe målproteinet og E3-ligasemaskineriproteinerne i nærheden, der kræves for at ubiquitinere og i sidste ende nedbryde målproteinet gennem ubiquitin-proteasomal vej (UPP). Profilering af målproteinnedbrydning på en måde, der er høj kapacitet, er imidlertid fortsat meget udfordrende i betragtning af kompleksiteten af cellulære veje, der kræves for at opnå nedbrydning. Her præsenterer vi en protokol og screeningsstrategi baseret på brugen af CRISPR/Cas9 endogen mærkning af målproteiner med 11 aminosyren HiBiT-tag, som supplerer med høj affinitet til LgBiT-proteinet, for at producere et selvlysende protein. Disse CRISPR-målrettede cellelinjer med endogene tags kan bruges til at måle sammensat induceret nedbrydning i enten realtids, kinetisk levende celle eller slutpunktslytiske tilstande ved at overvåge selvlysende signal ved hjælp af en selvlysende pladebaseret læser. Her skitserer vi de anbefalede screeningsprotokoller for de forskellige formater og beskriver også beregningen af nøglenedbrydningsparametre for hastighed, Dmax, DC 50, Dmax50 samt multiplexing med cellelevedygtighedsassays. Disse tilgange muliggør hurtig opdagelse og triaging af forbindelser i det tidlige stadium, samtidig med at endogen ekspression og regulering af målproteiner opretholdes i relevante cellulære baggrunde, hvilket muliggør effektiv optimering af blyterapeutiske forbindelser.

For at demonstrere enkeltkoncentrationsslutpunkts lytisk nedbrydningsanalyse er flere CDK-målproteiner; CDK2, CDK4, CDK7 og CDK10 blev endogent mærket med HiBiT ved deres C-endestation i HEK293-celler og behandlet med en 1 μM-koncentration af den pankinase Cereblon-baserede PROTAC, TL12-18654 (figur 1A). Niveauet af CDK-protein blev målt på forskellige tidspunkter, og den fraktionerede RLU i forhold til DMSO-kontrollen blev bestemt (figur 1A). Hvert CDK-protein viste forskellige grader af nedbrydning som reaktion på den sammensatte behandling og de forskellige tidspunkter (figur 1A). For at forstå, hvordan CDK-proteiner sammenlignede direkte med hinanden med hensyn til proteintab, blev de fraktionerede RLU'er i figur 1A beregnet som total % nedbrydning og plottet for hvert tidspunkt i figur 1B. Dette viser, at selv på tidlige tidspunkter, 2 eller 4 timer, viser nogle af CDK-familiemedlemmerne høje niveauer af nedbrydning, som fortsætter med at udvikle sig opad over tid (figur 1B).
For at demonstrere kinetisk nedbrydningsanalyse, hvert af BET-familiemedlemsproteinerne; BRD2, BRD3 og BRD4 blev endogent mærket med HiBiT ved deres N-endestation i HEK293-celler, der stabilt udtrykte LgBiT-proteinet18. Disse blev derefter behandlet med tre forskellige koncentrationer af pan-BET PROTAC'erne; den Cereblon-baserede dBET650 (figur 2A) og den VHL-baserede ARV-77141 (figur 2B). Kinetiske målinger blev indsamlet over en periode på 24 timer, og fra profilerne ved hver koncentration er forskellene i BET-familiemedlems respons let synlige. BRD2's evne til at initiere en hurtigere genopretningsrespons efter nedbrydning af sammensat behandling (figur 2A, B) er tidligere blevet observeret med andre pan-BET PROTAC'er og skyldes sandsynligvis et transkriptionelt feedbackrespons, der er konkurrencedygtigt over for nedbrydningsprocessen18.
Både endepunkts- og kinetisk analyse kan udføres med fuld sammensat dosisresponsbehandling. Vist i figur 3 er kinetiske dosisresponsnedbrydningsprofiler for behandling af Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat-celler, der stabilt udtrykker LgBiT-protein med fire forskellige molekylære limforbindelser 2,26,55,57; lenalidomid (figur 3A), iberdomid (CC-220) (figur 3B), thalidomid (figur 3C) og pomalidomid (figur 3D). Disse nedbrydninger viser signifikante forskelle i nedbrydningsrespons blandt forbindelserne såvel som på tværs af koncentrationsserien (figur 3).
For kvantitativt at vurdere nedbrydning og rangorden blev forbindelserne i figur 3 anvendt dosisresponsprofilerne til at beregne vigtige nedbrydningsparametre, herunder nedbrydningshastigheden (figur 4A), Dmax (figur 4B) og Dmax50 værdier (figur 4B). Disse analyser viser, at iberdomid (CC-220) og pomalidomid har meget lignende hurtige indledende nedbrydningshastigheder (figur 4A), men iberdomid (CC-220) har den højeste styrke, som det tidligere er set i ortogonale undersøgelser55,57 (figur 4B). Da Iberdomid udviser så høj styrke, og alle testede koncentrationer viser større end 50% nedbrydning, repræsenterer Dmax50-værdien opnået for Iberdomid et skøn baseret på begrænsningen ved nøjagtig tilpasning af dataene. Ud fra graferne i figur 3C, D og figur 4B nedbryder hverken lenalidomid eller thalidomid Ikaros/IKZF1-målet til færdiggørelse i de højeste testede koncentrationer. På grund af meget lidt nedbrydning observeret med thalidomid kunne nedbrydningssporene ikke være nøjagtigt egnede til en eksponentiel henfaldsmodel, derfor blev nedbrydningshastigheden ikke kvantificeret for denne behandling. For den mest potente nedbrydning, iberdomid (CC-220)55,57 (figur 4B). Cellelevedygtighedsmultiplexassays viste intet tab i cellelevedygtighed for de testede koncentrationer (figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Figur 1: CDK-endepunktsnedbrydning og toksicitet med pankinase PROTAC, TL12-18654. (A) Udvalgt panel af endogene CDK-målproteiner smeltet sammen med HiBiT på C-terminalen via CRISPR/Cas9 og vurderet til nedbrydning med 1 μM TL12-186 PROTAC 54 ved 2 timer, 4 timer, 8 timer og24 timers behandling. Værdier repræsenteres som fraktioneret RLU i forhold til et DMSO-kontrolelement, der måles på hvert tidspunkt. Fejllinjer repræsenterer SD af gennemsnittet af 3 tekniske replikater. (B) Procentvis nedbrydning af panel af CDK-målproteiner beregnet ud fra (A), der repræsenterer mængden af nedbrydning af hvert familiemedlem observeret ved 2, 4, 8 og 24 timers tidspunkter. Fejllinjer repræsenterer SD af gennemsnittet af 3 tekniske replikater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Figur 2: Profilering af kinetisk nedbrydningsselektivitet for BET-familiemedlemmer med BET-nedbrydere, dBET650 og ARV-77141. Kinetiske nedbrydningsprofiler for endogene BET-familiemedlemmer, BRD2, BRD3 og BRD4, mærket med HiBiT på N-terminalen via CRISPR/Cas9 med behandling af enkeltkoncentrationer på 1 nM (venstre), 10 nM (midten) eller 100 nM (højre) dBET650 (A) eller ARV-77141 (B) PROTAC'er. Værdier repræsenteres som fraktioneret RLU beregnet ud fra et DMSO-kontrolelement på hvert kinetisk tidspunkt. Fejllinjer repræsenterer SD af gennemsnittet af 4 tekniske replikater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Figur 3: Dosisresponsprofiler for levende cellers kinetiske nedbrydning af Ikaros/IKZF1-HiBiT med et molekylært limpanel 2,26,55,57. Jurkat-celler, der stabilt udtrykker LgBiT-proteinet, blev konstrueret ved hjælp af CRISPR / Cas9 til at mærke C-terminalen for Ikaros / IKZF1 med HiBiT-peptidet. Celler blev behandlet med en 8-punkts dosisresponskoncentrationsserie, herunder DMSO af fire forskellige molekylære limforbindelser 2,26,55,57: (A) lenalidomid, (B) iberdomid (CC-220), (C) thalidomid eller (D) pomalidomid. Luminescensen blev målt hvert 5. minut i alt 19,5 timer. Data for relativ lysenhed (RLU) fra (A-D) blev konverteret til fraktioneret RLU som beskrevet i trin 2.4.1 og tegnet som en funktion af tiden. Fejllinjer repræsenterer SD af 3 tekniske replikater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Figur 4: Beregning af nedbrydningshastighed og Dmax50 for Ikaros/IKZF1-HiBiT og multipleksende cellesundhedsanalyser. Kinetiske nedbrydningsdata fra figur 3 blev brugt til at beregne kvantitative nedbrydningsparametre. (A) Nedbrydningshastigheder og (B) nedbrydningsmaksimumværdier (Dmax) er tegnet ved hver lægemiddelkoncentration for de angivne molekylære limforbindelser 2,26,55,57. (B) Dmax50-værdier for hver forbindelse blev beregnet ved hjælp af en dosis-respons-model med begrænset Hill-hældning på 1, som kan bruges til at rangordne ordensnedbrydningsforbindelser for et mål. (C) Cellelevedygtighedsassays med iberdomid (CC-220)55,57 nedbrydningsdosisrespons fra figur 3B blev udført som en endepunktsmåling efter afslutningen af de kinetiske nedbrydningsmålinger. Fejllinjer repræsenterer SD af 3 tekniske replikater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Denne protokol beskriver den kvantitative selvlysende detektion af proteinnedbrydningskinetik i levende celler, der er konstrueret ved hjælp af CRISPR / Cas9 til at udtrykke antistoffri endogen proteindetektionsmærke smeltet sammen med et målprotein. Detaljerede instruktioner til beregning og opnåelse af kvantitative nedbrydningsparametre, hastighed, Dmax, DC 50 og Dmax50 er inkluderet.

Cellulær profilering med høj kapacitet af målrettede proteinnedbrydningsforbindelser ved hjælp af HiBiT CRISPR-cellelinjer

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

En metode til målrettet Cell Isolation via Glass overfladefunktionalisering

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Ved hjælp af Dot analyse til at analysere Migration af celle ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Røntgen følsomhed af kræft stamceller i lungekræft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering af små tarm neuroendokrine tumor Sfæroider

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse af sidepopulation i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Funktionel vurdering af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-medierede basiseditorer

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay ved hjælp af patient-afledte tumor organoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profilering af følsomhed over for målrettede terapier i EGFR-mutant NSCLC-patientafledte organoider

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Udforskning af mitokondrieenergimetabolisme af enkelt 3D-mikrotissu-sfroider ved hjælp af ekstracellulær fluxanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondrial Cybrid Generation ved hjælp af kræftcellelinjer

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...