Name: high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines
Uploaded: 2020-11-09T15:15:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

K.M.R, S.D.M, M.U. en D.L.D zijn allemaal werknemers van Promega Corporation

1. Eindpuntgradatiestudies met HiBiT CRISPR-doeleiwitten in lytisch formaat met optionele fluorescentieanalyse van de levensvatbaarheid van cellen
<ol><li>Bereiding en beplating van zoogdieraanhanger of suspensiecellijn<ol><li>Pas de celdichtheid aan op 2,22 x 105/ml door verdunning in geschikte celmedia die worden gebruikt voor passaging en celgroei.</li>
		<li>Doseer cellen in platen met een minimum van 3 putten per experimentele en controleconditie. Doseer 90 μL (20.000 cellen) per putje celsuspensie in 96-well witte platen. Voor 384-well formaat, dispense 36 μL (8.000 cellen) per put van cel suspensie in 384-well witte platen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding en toevoeging van verbindingen<ol><li>Bereid serieel verdunde PROTAC- of degradertestverbindingsplaten in 1.000x eindconcentratie in 100% DMSO. Verdun het vervolgens tot 10x uiteindelijke concentratie in het celkweekmedium. Voeg een gelijk volume DMSO toe aan het medium, te gebruiken als een dmso-controle zonder verbinding.</li>
		<li>Voeg voor 96-well formaat 10 μL 10x samengestelde en controleoplossingen toe aan 90 μL cellen. Voeg voor 384-well formaat 4 μL 10x samengestelde en controleoplossingen toe aan 36 μL cellen.</li>
		<li>Incubeer de platen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende de gewenste tijd of in omstandigheden die optimaal zijn voor hun groei. OPMERKING: Aangezien dit een eindpunttest is, vereist het testen van meerdere tijdspunten de voorbereiding van afzonderlijke degradatieplaten voor elk tijdstip, zoals beschreven in bovenstaande stap 1.1.2. Incubatietijden om samengestelde afbraak te detecteren zijn zeer variabel en zijn waarschijnlijk ook afhankelijk van de concentratie van de verbinding. Voorgestelde initiële tijdstippen zouden 6 uur en 24 uur zijn.</li>
		<li>Als u de luminescente detectie van eindpunten meet zonder de optionele cel levensvatbaarheidsmeting, gaat u direct verder met stap 1.3 hieronder. Als u multiplexing uitvoert met cel levensvatbaarheidsmeting, gaat u verder met de volgende paragraaf 1.4 hieronder.</li>
	</ol></li>
	<li>Lytische meting van cellen<ol><li>Bereid onmiddellijk voorafgaand aan HiBiT-lytische metingen 2x lytisch detectiereagens voor door 20 μL lytisch substraat en 10 μL LgBiT-eiwit toe te voegen per elke 1 ml van de lytische buffer. Bereid voldoende 2x detectiereagens voor om het aantal te testen putten voor, inclusief extra volume om rekening te houden met pipetteerfouten (d.w.z. aantal putten + 10%).</li>
		<li>Voeg voorbereid lytisch detectiereagens toe aan cellen. Voeg voor 96-well-formaat 100 μL 2x lytisch detectiereagens toe aan elke put die 100 μL cellen bevat. Voeg voor 384-well-formaat 40 μL 2x lytisch detectiereagens toe aan elke put die 40 μL cellen bevat. Meng de plaat op een microplaat vortex mixer gedurende 10-20 min bij 350 rpm.</li>
		<li>Meet luminescentie op een luminometer die luminescentie kan aflezen in een plaat met 96 of 384 putten.</li>
	</ol></li>
	<li>Optionele multiplexing van cel levensvatbaarheid OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare CellTiter-Fluor (CTF) kit (zie Materiaaltabel).<ol><li>Bereid 30-40 minuten voorafgaand aan de gewenste eindpuntmeting een 6x cel levensvatbaarheid detectie reagensoplossing voor door 10 μL van het substraat toe te voegen aan 2 ml van de assay buffer. Bereid voldoende 6x reagens voor elke te testen put, inclusief extra volume voor pipetteerfouten (d.w.z. aantal putjes + 10%).</li>
		<li>Voeg het bereide reagens toe aan de putjes. Voeg voor 96-well formaat 20 μL 6x reagens toe aan elke put die al een volume van 100 μL bevat. Voeg voor 384-well formaat 8 μL 6x reagens toe aan elke put die 40 μL cellen bevat. Meng kort op een microplaat vortex mixer en incubeer de plaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C.</li>
		<li>Meet op het gewenste meeteindpunt (d.w.z. 6 of 24 uur na de behandeling, stap 1.2.3) fluorescentie op een instrument dat fluorescentie kan lezen (380-400nmEx/505nmEm) in 96- of 384-well-formaat.</li>
		<li>Bereid 2x lytisch detectiereagens voor door 20 μL lytisch substraat en 10 μL LgBiT-eiwit per 1 ml lytische buffer toe te voegen. Bereid voldoende 2x detectiereagens voor om het aantal te testen putten voor, inclusief extra volume om rekening te houden met pipetteerfouten (bijv. Aantal putten + 10%).</li>
		<li>Voeg het bereide lytische detectiereagens toe aan putten. Voeg voor 96-well formaat 120 μL 2x lytisch detectiereagens toe aan elke put die al een volume van 120 μL bevat. Voeg voor 384-well formaat 48 μL 2x lytisch detectiereagens toe aan elke put die al een volume van 48 μL bevat. Meng de plaat op een microplaat vortex mixer gedurende 10-20 min.</li>
		<li>Meet luminescentie op een luminometer die luminescentie kan aflezen in platen met 96 of 384 putten.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificering van afbraak en levensvatbaarheid van cellen<ol><li>Gemiddelde van de relatieve lichteenheden (RLU) van de DMSO-regeling op het gemeten tijdstip. Gebruik deze waarde als het basiseiwitniveau van het doel om fractionele afbraak te berekenen door alle andere behandelingen die op hetzelfde tijdstip zijn getest, te normaliseren naar deze waarde. Als de gemiddelde RLU voor de DMSO-controleputten na 6 uur bijvoorbeeld 10.000 was en de RLU voor een bepaalde samengestelde behandeling na 6 uur 5.000, zou de fractionele afbraak worden berekend als 5.000 ÷ 10.000 = 0,5 (vergelijking 1). Vergelijking 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Bepaal het percentage degradatie van fractionele RLU: Vergelijking 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>Plot fractionele RLU of % afbraak op specifieke tijdstippen om de activiteit van verbindingen te rangschikken.</li>
		<li>Analyseer optioneel de gegevens van de relatieve fluorsecence unit (RFU) voor de meting van de levensvatbaarheidstest van de cel door de waarden van alle behandelingen te vergelijken met de DMSO-controle. Als een significante afname van RFU wordt waargenomen voor elke behandeling ten opzichte van de DMSO-controle, kunnen de afbraakgegevens bovendien worden genormaliseerd naar de testgegevens van de levensvatbaarheid van de cel om veranderingen in eiwitniveau te bepalen ten opzichte van verliezen in de levensvatbaarheid van cellen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Real-time kinetische afbraak van HiBiT CRISPR-doeleiwitten en optionele cel levensvatbaarheid luminescentietest
OPMERKING: Het vermogen om kinetische screening en afbraak uit te voeren vereist lgbit-eiwit co-expressie in de cel, die eerder is beschreven 18,19,63. Dit kan worden bereikt via transiënte transfectie van een LgBiT-vector, gebruik van BacMam LgBiT of door HiBiT CRISPR-insertie uit te voeren in een LgBiT-stabiele cellijn.
<ol><li>Plating van adherente cellijnen.<ol><li>Verwijder medium uit de celkolf door aspiratie, was cellen met DPBS, dissociëer cellen met 0,05% trypsine-EDTA en laat cellen dissociëren van de kolfbodem. Voor suspensiecellijnen gaat u verder met punt 2.2.</li>
		<li>Neutraliseer trypsine met behulp van serumbevattend celkweekmedium, meng om cellen te verzamelen en te resuspenderen en breng celsuspensie over naar een conische buis.</li>
		<li>Spin cellen op 125 x g gedurende 5 min. Gooi het celkweekmedium weg en resuspenseer in een gelijk volume vers celkweekmedium.</li>
		<li>Plaatcellen in testplaten met een minimum aan drievoudige putten per experimentele en controleconditie. Voor het aantal 96-wells formaten om de celdichtheid te schatten, past u de dichtheid aan op 2 x 105 cellen / ml in testmedium en geeft u 100 μL (20.000 cellen) per put af in een 96-well plaat. Voor het aantal 384-well formaten om de celdichtheid te schatten, past u de dichtheid aan op 4,44 x 105 cellen / ml in het testmedium en geeft u 18 μL (8.000 cellen) per put af.</li>
		<li>Incubeer platen bij 37 °C, 5% CO2 's nachts of in omstandigheden die optimaal zijn voor hun groei.</li>
	</ol></li>
	<li>Plating van suspensiecellen<ol><li>Pas de celdichtheid aan op 2,22 x 105 cellen/ml in CO2-onafhankelijk medium aangevuld met 10% FBS en 1x Endurazine (1:100 verdunning van het stamreagens).</li>
		<li>Plaatcellen in testplaten met minimaal 3 putten per experimentele en controleconditie. Voor 96-well formaat doseer je 90 μL (20.000 cellen) per put. Voor 384-well formaat doseer je 36 μL (8.000 cellen) per put. OPMERKING: Voor suspensiecellijnen met een lage signaal-naar-achtergrond (S: B) luminescentie, bijvoorbeeld bij het werken met CRISPR-pools in plaats van klonen, is het mogelijk om de luminescentie te verhogen door het aantal vergulde cellen te verhogen, tot 100.000 cellen / put in 96-well-formaat, of 40.000 cellen / put in 384-well-formaat.</li>
	</ol></li>
	<li>Kinetische afbraaktests met behulp van HiBiT CRISPR-cellen die LgBiT tot expressie brengen<ol><li>Voor suspensiecellen die al Endurazine bevatten, dat bij de platingstap in 2.2. was opgenomen, gaat u direct verder met stap 2.3.3. Bereid voor adherente cellijnen Nano-Glo Endurazine-oplossing voor. Bereid voor 96-well formaat een 1x-oplossing van Endurazine door voorraadreagens 1:100 te verdunnen tot CO2-onafhankelijk medium aangevuld met 10% FBS. Bereid voor 384-well formaat een 2x-oplossing van Endurazine door voorraadreagens 1:50 te verdunnen tot CO2-onafhankelijk medium aangevuld met 10% FBS.</li>
		<li>Voeg Endurazine-oplossing toe aan elk putje van aanhangende cellen. Voor 96-well formaat aspirateer medium en voeg 90 μL 1x Endurazine oplossing toe. Voeg voor 384-well-formaat 18 μL 2x Endurazine-oplossing toe aan 18 μL cellen. Aspirateer medium niet omdat de afbraaktest wordt uitgevoerd in een 50:50 mengsel van kweekmedium en CO2 onafhankelijk medium in 384-well formaat.</li>
		<li>Incubeer suspensie of aanhangende celplaten die Endurazine bevatten gedurende 2,5 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 om luminescentie in evenwicht te brengen.</li>
		<li>Bereid een 10x-concentratie protac-titratie van de test voor in CO2-onafhankelijk medium en voeg 10 μL toe aan elke put van 96-well plaat of 4 μL voor 384-well plaat. Voor verbindingen met een onbekende werkzaamheid wordt een eindconcentratie van 1-10 μM op het hoogste punt als uitgangspunt aanbevolen.</li>
		<li>Verzamel kinetische metingen van luminescentie in luminometer vooraf gebalanceerd tot 37 °C gedurende een periode tussen 0-48 uur. De tijdsintervallen van de meting kunnen voor elk experiment worden aangepast, maar een aanbevolen eerste experiment zou luminescentiemetingen zijn elke 5-15 minuten gedurende 24 uur of de gewenste hoeveelheid tijd.</li>
	</ol></li>
	<li>Optionele cel levensvatbaarheid same-well multiplex analyse na definitieve kinetische meting OPMERKING: Deze test wordt uitgevoerd met een in de handel verkrijgbare CellTiter-Glo (CTG) kit (zie Materiaaltabel).<ol><li>Breng CTG-reagens in evenwicht met kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg na de degradatiemeting op het laatste tijdstip van de kinetische analyse 100 μL (96-well plaat) of 40 μL (384-well plaat) van het reagens per put van de plaat toe en meng op een platenschudder bij 500-700 rpm (96-well plaat) of een microplaat vortex mixer (384-well plaat) gedurende 5 min.</li>
		<li>Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om cellysis en doven van hibit-signaal mogelijk te maken.</li>
		<li>Meet de totale luminescentie op een luminometer door de aanbeveling van de fabrikant op te volgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificering van kinetische afbraakprofielen<ol><li>Met behulp van de verzamelde kinetische luminescentiemetingen normaliseert u de ruwe RLU's voor elke PROTAC-concentratie tot de gerepliceerde gemiddelde DMSO-conditie op elk tijdstip om rekening te houden met veranderingen in de vrije furimazineconcentratie in de loop van de tijd. Bereken fractionele RLU met behulp van vergelijking 1. Vergelijking 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Van de degradatiecurven, monteer een exponentieel vervalmodel met één component met behulp van vergelijking 2 op het initiële degradatiegedeelte van elke curve tot het punt waar de gegevens een plateau bereiken. OPMERKING: Het kan nuttig zijn om de eerste paar gegevenspunten uit te sluiten van de pasvorm, omdat er een korte vertraging kan zijn voordat degradatie wordt waargenomen. Vergelijking 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>Bepaal in vergelijking 2 de parameter ƛ, die de afbraaksnelheidsconstante vertegenwoordigt en het plateau, dat de laagste hoeveelheid overgebleven eiwit vertegenwoordigt.</li>
		<li>Bereken Dmax, dat is de maximale fractionele hoeveelheid afgebroken eiwit en wordt berekend als 1-Plateau.</li>
		<li>Zet Dmax uit voor elke concentratie PROTAC om een tijdonafhankelijke degradatiepotentiecurve te bepalen.</li>
		<li>Bepaal de Dmax50-waarde voor het plot in 2.3.5 om de werkzaamheid van verbindingen te analyseren. OPMERKING: Om een DC50 op een specifiek tijdstip te bepalen, plott u het berekende percentage afbraak voor elke concentratie op het gekozen tijdstip. Dit kan worden gespecificeerd als DC50 t = 4 h of DC50 t = 12 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

Promega Corporation is de commerciële eigenaar door toewijzing van patenten van de HiBiT- en NanoLuc-technologieën en -toepassingen.

We presenteren hier twee methoden voor het screenen van de activiteit van degradatieverbindingen in eindpuntlytisch formaat of live-cel kinetische modus. Deze benaderingen zijn gebaseerd op dezelfde luminescerende meetprincipes, maar bieden verschillende niveaus van detail en begrip. De keuze van een van beide benaderingen zal waarschijnlijk afhankelijk zijn van screeningsdoelen en de grootte van de samengestelde bibliotheek. Voor grote samengestelde screeningdekken of primaire schermen om detecteerbare degradatie waar te nemen, biedt eindpuntlytische screening gevoelige en efficiënte compatibiliteit met hoge doorvoer, waarbij andere eindpuntbenaderingen, zoals western blot of massaspectrometrie, onpraktisch of moeilijk aan te passen kunnen zijn14. Een startpunt voor deze schermen zou kunnen worden uitgevoerd met een beperkt aantal concentraties en tijdspunten. De aanbevolen initiële concentraties om te testen liggen in het bereik van 100 nM-10 μM, om rekening te houden met initiële degradanten met een lage potentie, slechte permeabiliteit of, in sommige gevallen met zeer krachtige verbindingen, de aanwezigheid van een haakeffect. Voorts wordt aanbevolen om ten minste twee verschillende tijdstippen te testen om vroeg beginnende afbraak bij 4-6 uur en latente of aanhoudende afbraak bij 18-24 uur vast te stellen. Verbindingen die een hoge afbraakpotentie en een doelmechanisme vertonen, worden gemakkelijk waargenomen binnen een tijdsbestek van 4-6 uur, terwijl afbraak of schijnbaar eiwitverlies dat alleen op latere tijdstippen wordt waargenomen, te wijten kan zijn aan een verscheidenheid aan mechanismen. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de levensvatbaarheid van cellen op zowel vroege als late tijdstippen te controleren, zodat eiwitverlies kan worden losgekoppeld van verlies als gevolg van celdood. Net als bij elk type luminescerende of fluorescerende assay, is er een potentieel voor verbindingen binnen bibliotheken om het signaal te verstoren of te remmen, daarom zullen orthogonale follow-upexperimenten met loodverbindingen met behulp van niet-gerelateerde fusies of alternatieve benaderingen voor het bewaken van het eiwitniveau belangrijk zijn om te beoordelen dat verlies van RLU in deze assays direct geassocieerd is met doeleiwitafbraak.
Het vermogen om gedurende langere tijd in live celkinetisch formaat te screenen, is sterk afhankelijk van het testsignaal naar de achtergrond (S: B). Factoren die bijdragen aan S: B omvatten het expressieniveau van het doeleiwit zelf, dat verschillende ordes van grootte kan omvatten, de efficiëntie van LgBiT-expressie in de cellijn die is gekozen voor het inbrengen van peptiden, en de beschikbaarheid van het getagde doel voor complementatie in de verschillende native complexen. We hebben een algemene cutoff-eis vastgesteld bestaande uit een S:B van 15 om met succes degradatie in kinetische modus te meten met Endurazine of Vivazine. De S:B wordt bepaald door het basissignaal te meten van de HiBiT-bewerkte cellen die LgBiT co-expresseren ten opzichte van onbewerkte oudercellen die alleen LgBiT tot expressie brengen in de aanwezigheid van Endurazine of Vivazine levende celsubstraten. Vivazine zal een hoger luminescerend signaal produceren, maar zal sneller vervallen dan Endurazine en kan de signaalacquisitie beperken tot 24 uur of minder. Bovendien kan S:B ook sterk afhankelijk zijn van het feit of CRISPR-pools of klonen worden gebruikt. Voor doelen in cellijnen die beter vatbaar zijn en een hoge efficiëntie hebben voor CRISPR/Cas9-engineering, kan een heterogene CRISPR-poolpopulatie van bewerkte cellen voldoende S:B hebben voor kinetische analyse. Voor doelen in moeilijkere cellijnen waar minder efficiënte genomische integratie via CRISPR resulteert in pools met lage S:B, kan het isoleren van CRISPR-klonen nodig zijn om bewerkte populaties te verrijken en een voldoende hoge S:B te bereiken voor kinetische analyse. Voor elk van deze scenario's, als S:B minder dan 15 is met endurazine- of vivazinesubstraten, wordt eindpuntlytische screening geadviseerd.
Voor een beter begrip en karakterisering van verbindingen, met inbegrip van de bepaling van een afbraakprofiel met kwantitatieve parameters, is real-time kinetische analyse in levende cellen de aanbevolen screeningsaanpak14,18. Net als eindpuntanalyse die hierboven is besproken, kan de initiële kinetische screening worden uitgevoerd met een beperkt aantal concentraties in het bereik van 100nM-10μM op een manier met hoge doorvoer. In 384-well-formaat kunnen meer dan 100 verbindingen gemakkelijk in drievoud worden gescreend in één concentratie op een enkele plaat. De resulterende afbraakprofielen zullen niet alleen richtlijnen geven voor de mate van waargenomen afbraak, maar ook voor de snelheid van afbraak, de duur van de afbraak en het potentiële herstel van het eiwit14,18 (figuur 2 en figuur 3). Ook de vormen van het afbraakprofiel leveren waardevolle informatie op. Specifieke en krachtige degraders vertonen vaak een initieel snel verlies van het doeleiwit naar een plateau in een kwestie van uren18,53, terwijl andere mechanismen zoals transcriptionele feedback of samengestelde toxiciteit meestal resulteren in meer lineair verlies van het eiwit in de loop van de tijd. Deze details en nuances worden gemist met eindpuntlytische analyse, en met real-time analyse gedurende 24-48 uur hoeft men de tijd niet te voorspellen om de ware Dmax vast te leggen in sets van nieuwe of onbekende verbindingen.
Real-time kinetiek maakt ook efficiënte dosisresponsscreening mogelijk om de werkzaamheid van verbindingen beter te begrijpen, hoe de concentratie van verbindingen de initiële afbraaksnelheid beïnvloedt en biedt mogelijkheden om verbindingen te rangschikken op basis van meer dan één parameter. Klassieke metingen van degradatiepotentie omvatten DC50-berekeningen op een specifiek tijdstip op basis van schijnbare degradatiemaxima. Daarentegen omvat onze kinetische benadering om de potentie te evalueren het werkelijke afbraakmaximum bij elke concentratie, ongeacht wanneer deze zich voordoet in tijd18. We noemen deze meting van kinetische afbraakpotentie de Dmax5018. Analyse op deze manier houdt rekening met verbindingen die de afbraak langzamer kunnen initiëren bij lagere concentraties en daarom na de behandeling langer duren om hun Dmax te bereiken. Het kan bijzonder informatief zijn om verbindingen te rangschikken op zowel degradatiesnelheid als Dmax. Voor de meest krachtige degradanten zal dit langzame, maar krachtige degraders verder onderscheiden van degenen die zowel snel als krachtig zijn. Samen zijn zowel lytische als levende celkinetische screening met behulp van HiBiT CRISPR-cellijnen krachtige benaderingen die een uitgebreider beeld geven van gerichte eiwitafbraak, samengestelde functie en het screeningproces mogelijk maken van initiële activiteitsbeoordeling tot downstream chemische optimalisatie door verbetering van belangrijke afbraakparameters.

Gerichte eiwitafbraak is naar voren gekomen als een van de snelst groeiende gebieden in de ontdekking van geneesmiddelen met kleine moleculen, sterk ondersteund door het therapeutische succes van immunomodulerende moleculaire lijmverbindingen (bijv. IMiD) voor kankerbehandeling, en veelbelovende vroege klinische onderzoeksgegevens van Proteolyse Gericht op Chimera-verbindingen 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Gerichte eiwitafbraakverbindingen functioneren door een doeleiwit in de nabijheid te brengen met E3-ligasemachine-eiwitten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Deze door verbindingen geïnduceerde rekrutering van het doeleiwit naar het E3-ligase leidt tot de ubiquitinatie en afbraak van het doeleiwit via de proteasomale route van ubiquitine (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historisch gezien hebben screeningsprogramma's voor het ontdekken van geneesmiddelen met kleine moleculen vertrouwd op initiële biochemische assays om de activiteit te beoordelen en verbindingen te rangschikken. Dit heeft echter een belangrijke uitdaging opgeleverd voor gerichte eiwitdegradanten waarvan de uiteindelijke activiteit, afbraak via het proteasoom, afhankelijk is van een cascade van cellulaire gebeurtenissen 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. De meervoudige routes en complexiteit van eiwitcomplexen die nodig zijn voor de succesvolle doeldegradatie vereisen cellulaire testbenaderingen voor vroege screening en triage van initiële verbindingen. Momenteel ontbreekt de beschikbaarheid van technologieën om de eiwitafbraak van doelen op een high-throughput manier te monitoren in de context van de cellulaire omgeving ernstig14. Hier zullen we protocollen presenteren voor real-time kinetische live cell of endpoint lytische degradatie activiteitsbeoordeling met behulp van CRISPR / Cas9 endogeen gelabelde HiBiT-doelcellijnen 18,19,20 om het verlies van het doeleiwit te monitoren via luminescente meting na behandeling met degraderverbindingen 10,11,18,19.
Om succesvolle afbraak van therapeutische doelen te bereiken en het druggable proteoom uit te breiden, zijn er talloze benaderingen en soorten degradanten ontstaan die zich kunnen richten op een breed scala aan eiwitten voor vernietiging, waaronder die gelokaliseerd op of in het plasmamembraan, lysosomen, mitochondriale membranen, cytoplasma en de kern 21-57. De twee belangrijkste klassen van verbindingen die het meest uitgebreid zijn bestudeerd, zijn moleculaire lijmen en eiwitten gericht op cimera's 2,4,5,6,7,12,26. Moleculaire lijmen zijn monovalent, dus meestal kleiner van formaat, en vergemakkelijken een nieuwe eiwit:eiwitinteractie-interface met een doeleiwit bij binding aan een E3-ligasecomponent 2,12,26. Het zijn meestal degradanten die binden aan de Cereblon (CRBN) E3 ligasecomponent 2,12,26,55,56,57. Onlangs echter spannende nieuwe voorbeelden met behulp van andere E3 ligase machines zoals DCAF15 58,59,60 en CDK / Cyclin werving naar DDB145 tonen het potentieel voor uitbreiding van deze klasse van verbindingen. Protacs daarentegen zijn grotere, bivalente moleculen, bestaande uit een doelbindend ligand, meestal een remmer, overbrugd via een chemische linker naar een E3 ligase handvat 1,3,4,5,7,13. Als zodanig zijn deze verbindingen in staat om zich direct te binden aan zowel het E3-ligase als het doeleiwit 1,3,4,5,7,13. Van talrijke eiwitten is aangetoond dat ze via deze bivalente moleculen worden afgebroken en de meest gebruikte E3-ligasehandvatten rekruteren CRBN of Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Het aantal beschikbare handgrepen voor E3-ligaserekrutering in chimaera's gericht op proteolyseontwerp groeit echter snel, waardoor de mogelijkheden van deze klasse verbindingen worden uitgebreid met het potentieel om diverse doelklassen af te breken en de cel- of weefseltypespecificiteit te verbeteren 24,48,61,62 . Gecombineerd met de minimale vereiste om een doeleiwit te betrekken, zelfs met marginale affiniteit, zijn afbraakverbindingen veelbelovend voor het uitbreiden van het druggable proteoom.
Het karakteriseren van de cellulaire dynamiek van eiwitverlies, evenals potentieel eiwitherstel na de behandeling, is van cruciaal belang voor het begrijpen van de afbraakverbindingsfunctie en werkzaamheid. Hoewel het mogelijk is om endogene eiwitniveauveranderingen in relevante cellulaire systemen te bestuderen met western blot-antilichaamtests of massaspectrometrie, zijn deze benaderingen moeilijk aan te passen aan screeningformaten met hoge doorvoer, hebben ze een beperkt kwantificeringsvermogen of het vermogen om kinetische veranderingen op veel tijdstippen te meten14. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we een op platen gebaseerd cellulair luminescerend systeem ontwikkeld voor het monitoren van veranderingen in endogene eiwitniveaus, dat gebruik maakt van genomische insertie via CRISPR / Cas9 van de 11 aminozuurtag, HiBiT, tot de loci van belangrijke afbraakdoelen 18,19,20. Dit peptide vult met hoge affiniteit aan zijn bindende partner, LgBiT, aan om heldere luminescentie te produceren in aanwezigheid van zijn substraat 18,19,20,63, waardoor deze gelabelde endogene eiwitten luminescerend worden in cellen of lysaten 18,19,20,63 . De relatieve lichteenheden (RLU's) gemeten met een luminometerinstrument zijn recht evenredig met de gelabelde doeleiwitniveaus 18,19,20,63. Met de ontwikkeling van gestabiliseerde luciferasesubstraten zijn real-time kinetische eiwitniveaumetingen over 24-48 h tijdframes mogelijk 18,53,64. Dit maakt het mogelijk om een volledig afbraakprofiel te bepalen voor een bepaald doelwit bij een bepaalde concentratie van de verbinding, met inbegrip van kwantitatieve analyse van de initiële afbraaksnelheid, het afbraakmaxum (Dmax) en het herstel na samengestelde behandeling18,53. Bij het screenen van grote bibliotheken van afbraakverbindingen kan eindpuntanalyse echter ook gemakkelijk worden uitgevoerd in 384-well-formaat bij verschillende medicijnconcentraties en aangewezen tijden.
De protocollen die in dit manuscript worden gepresenteerd, vertegenwoordigen cellulaire screeningstrategieën voor gerichte eiwitafbraakverbindingen, toepasbaar voor alle soorten degradanten. Het gebruik van HiBiT CRISPR-cellijnen samen met deze protocollen is echter niet beperkt tot eiwitafbraak, maar het zijn algemene hulpmiddelen voor het bewaken van elk endogene doeleiwitniveau dat na de behandeling kan worden gemoduleerd om de impact van verbindingen of zelfs resistentiemechanismen te bestuderen 20,65,66. Een voorwaarde voor deze luminescerende detectiemethoden is een CRISPR endogeen gelabelde HiBiT-doelcellijn, die van cruciaal belang is omdat deze gevoelige luminescerende detectie mogelijk maakt, terwijl de endogene doelexpressie en native promotorregulatie 18,19,20 behouden blijven. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het gebruik van CRISRP/Cas9 voor het invoegen van genomische tags, met name in schaalbaarheid20 en met de hoge gevoeligheid van detectie, in verschillende formaten, waaronder CRISPR-pools of klonen met heterozygote of homozygote allel inserties 18,19,20. Gebruik van exogene expressie van HiBiT of andere reporterfusies in cellen in plaats van endogene tagging is mogelijk, maar er moet aanzienlijke voorzichtigheid worden betracht met behulp van systemen met eiwitoverexpressie14,18. Deze kunnen leiden tot artefacten in het begrijpen van echte samengestelde potentie en eiwithersteldynamiek14,18, inclusief potentiële transcriptionele feedbacklussen die na de degradatie van het doelwit worden geactiveerd. Bovendien kunnen verbindingen in een vroeg stadium met een lage potentie worden gemist en zich presenteren als vals negatieven bij screening. Aangezien eiwitverlies het gevolg kan zijn van door verbindingen geïnduceerde toxiciteit en celdood, bevatten de hier beschreven protocollen sterk aanbevolen, maar optionele cel levensvatbaarheid luminescerende of fluorescerende assays in combinatie met het afbraakprotocol. Er zijn twee belangrijke secties in het protocol, lytisch eindpunt en live cell kinetic screening. Binnen elk van deze secties zijn opties opgenomen voor metingen van de levensvatbaarheid van multiplexed cellen in eindpunt- of kinetische indelingen. Het monitoren van de veranderingen van het gelabelde endogene eiwit vereist complementatie met LgBiT in cellen. Daarom verwijst de kinetische screeningsectie naar belangrijke protocollen voor de introductie hiervan, die kunnen worden bereikt via voorbijgaande of stabiele expressie en essentieel zijn voor het uitvoeren van de luminescerende metingen van levende cellen. Alle hier gepresenteerde benaderingen maken een snelle rangorde en activiteitsbeoordeling van verbindingen mogelijk, waardoor vroege screeningsinspanningen voor verbindingen en snellere identificatie van looddegraders mogelijk worden.
Dit protocol is ontworpen voor de studie van afbraakverbindingen in combinatie met een HiBiT CRISPR-cellijn. Protocollen voor het genereren van HiBiT CRISPR-invoegingen voor tal van doelen zijn geschetst in verschillende recente publicaties 18,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

Gerichte eiwitafbraakverbindingen, waaronder moleculaire lijmen of proteolyse gericht op chimaera's, zijn een opwindende nieuwe therapeutische modaliteit bij het ontdekken van geneesmiddelen met kleine moleculen. Deze klasse van verbindingen induceert eiwitafbraak door het doeleiwit en de E3 ligasemachine-eiwitten die nodig zijn om het doeleiwit te ubiquitineren en uiteindelijk af te breken via de ubiquitine-proteasomale route (UPP) in de nabijheid te brengen. Profilering van doeleiwitafbraak op een high-throughput manier blijft echter zeer uitdagend gezien de complexiteit van cellulaire routes die nodig zijn om afbraak te bereiken. Hier presenteren we een protocol en screeningstrategie gebaseerd op het gebruik van CRISPR/Cas9 endogene tagging van doeleiwitten met de 11 aminozuur HiBiT-tag die met hoge affiniteit het LgBiT-eiwit aanvult, om een luminescerend eiwit te produceren. Deze CRISPR-gerichte cellijnen met endogene tags kunnen worden gebruikt om samengestelde degradatie te meten in real-time, kinetische live cell- of eindpuntlytische modi door luminescerend signaal te bewaken met behulp van een luminescerende plaatgebaseerde lezer. Hier schetsen we de aanbevolen screeningprotocollen voor de verschillende formaten en beschrijven we ook de berekening van de belangrijkste degradatieparameters van snelheid, Dmax, DC50, Dmax50, evenals multiplexing met cel levensvatbaarheidstests. Deze benaderingen maken snelle ontdekking en triage van verbindingen in een vroeg stadium mogelijk met behoud van endogene expressie en regulatie van doeleiwitten in relevante cellulaire achtergronden, waardoor efficiënte optimalisatie van loodtherapeutische verbindingen mogelijk is.

Om de analyse van de enkelvoudige concentratie-eindpunt lytische afbraak aan te tonen, zijn verschillende CDK-doeleiwitten; CDK2, CDK4, CDK7 en CDK10 werden endogeen gelabeld met HiBiT op hun C-terminus in HEK293-cellen en behandeld met een 1 μM-concentratie van de pan-kinase Cereblon-gebaseerde PROTAC, TL12-18654 (figuur 1A). Het niveau van CDK-eiwit werd gemeten op verschillende tijdstippen en de fractionele RLU ten opzichte van de DMSO-controle werd bepaald (figuur 1A). Elk CDK-eiwit vertoonde verschillende gradaties als reactie op de samengestelde behandeling en de verschillende tijdstippen (figuur 1A). Om te begrijpen hoe CDK-eiwitten zich direct tot elkaar verhouden in termen van eiwitverlies, werden de fractionele RLU's in figuur 1A berekend als totale % afbraak en uitgezet voor elk tijdstip in figuur 1B. Dit toont aan dat zelfs op vroege tijdstippen, 2 of 4 uur, sommige van de CDK-familieleden hoge niveaus van degradatie vertonen die in de loop van de tijd blijven stijgen (figuur 1B).
Om kinetische afbraakanalyse aan te tonen, elk van de BET-familielideiwitten; BRD2, BRD3 en BRD4 werden endogeen gelabeld met HiBiT op hun N-eindpunt in HEK293-cellen die stabiel het LgBiT-eiwit18 tot expressie brachten. Deze werden vervolgens behandeld met drie verschillende concentraties van de pan-BET PROTACs; de cereblon-gebaseerde dBET650 (figuur 2A) en de VHL-gebaseerde ARV-77141 (figuur 2B). Kinetische metingen werden verzameld over een periode van 24 uur en uit de profielen bij elke concentratie zijn de verschillen in de respons van bet-familieleden duidelijk zichtbaar. Het vermogen van BRD2 om een snellere herstelrespons na degradatieverbindingsbehandeling te initiëren (figuur 2A, B) is eerder waargenomen bij andere pan-BET PROTACs en is waarschijnlijk te wijten aan een transcriptionele feedbackrespons die concurrerend is met het afbraakproces18.
Zowel eindpunt- als kinetische analyse kan worden uitgevoerd met volledige samengestelde dosisresponsbehandelingen. In figuur 3 zijn kinetische dosisresponsafbraakprofielen van de behandeling van Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat-cellen die stabiel LgBiT-eiwit tot expressie brengen met vier verschillende moleculaire lijmverbindingen 2,26,55,57; lenalidomide (figuur 3A), iberdomide (CC-220) (figuur 3B), thalidomide (figuur 3C) en pomalidomide (figuur 3D). Deze degradanten vertonen significante verschillen in afbraakrespons tussen de verbindingen en tussen de concentratiereeksen (figuur 3).
Om de afbraak kwantitatief te beoordelen en de verbindingen in figuur 3 te rangschikken, werden de dosisresponsprofielen gebruikt om de belangrijkste afbraakparameters te berekenen, waaronder de afbraaksnelheid (figuur 4A), Dmax (figuur 4B) en Dmax50-waarden (figuur 4B). Deze analyses tonen aan dat iberdomide (CC-220) en pomalidomide zeer vergelijkbare snelle initiële afbraaksnelheden hebben (figuur 4A), maar iberdomide (CC-220) heeft de hoogste potentie zoals eerder is gezien in orthogonale studies55,57 (figuur 4B). Aangezien Iberdomide een dergelijke hoge potentie vertoont en alle geteste concentraties een degradatie van meer dan 50% vertonen, vertegenwoordigt de Dmax50-waarde verkregen voor Iberdomide een schatting op basis van de beperking in het nauwkeurig aanpassen van de gegevens. Uit de grafieken in figuur 3C,D en figuur 4B blijkt dat noch lenalidomide noch thalidomide het Ikaros/IKZF1-doel afbreken tot voltooiing bij de hoogste geteste concentraties. Vanwege zeer weinig degradatie waargenomen met thalidomide, konden de afbraaksporen niet nauwkeurig worden aangepast aan een exponentieel vervalmodel, daarom werd de afbraaksnelheid niet gekwantificeerd voor deze behandeling. Voor de krachtigste degrader, iberdomide (CC-220)55,57 (figuur 4B). Multiplextests voor de levensvatbaarheid van cellen toonden geen verlies in levensvatbaarheid van de cellen voor de geteste concentraties (figuur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Figuur 1: CDK eindpunt degradatie en toxiciteit met pan-kinase PROTAC, TL12-18654. (A) Selecteer een panel van endogene CDK-doeleiwitten gefuseerd met HiBiT op de C-terminus via CRISPR/Cas9 en beoordeeld op afbraak met 1 μM TL12-186 PROTAC54 bij 2 h, 4 h, 8 h en 24 h behandeling. Waarden worden weergegeven als fractionele RLU ten opzichte van een DMSO-controle die op elk tijdstip wordt gemeten. Foutbalken vertegenwoordigen SD van het gemiddelde van 3 technische replicaties. (B) Procentuele afbraak van panel van CDK-doeleiwitten berekend op basis van (A) die de hoeveelheid afbraak van elk familielid vertegenwoordigt die is waargenomen op 2, 4, 8 en 24 uur tijdspunten. Foutbalken vertegenwoordigen SD van het gemiddelde van 3 technische replicaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Figuur 2: Profilering van kinetische degradatie selectiviteit van BET-familieleden met BET-degradanten, dBET650 en ARV-77141. Kinetische afbraakprofielen van endogene BET-familieleden, BRD2, BRD3 en BRD4, gelabeld met HiBiT op de N-terminus via CRISPR/Cas9 met behandeling van enkelvoudige concentraties van 1 nM (links), 10 nM (midden) of 100 nM (rechts) dBET650 (A) of ARV-77141 (B) PROTACs. Waarden worden weergegeven als fractionele RLU berekend op basis van een DMSO-controle op elk kinetisch tijdstip. Foutbalken vertegenwoordigen SD van het gemiddelde van 4 technische replicaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Figuur 3: Live cell kinetic degradation dose response profiles van Ikaros/IKZF1-HiBiT met een moleculair lijmpaneel 2,26,55,57. Jurkat-cellen die stabiel het LgBiT-eiwit tot expressie brengen, werden ontworpen met CRISPR / Cas9 om de C-terminus van Ikaros / IKZF1 te taggen met het HiBiT-peptide. Cellen werden behandeld met een 8-punts dosisresponsconcentratiereeks inclusief DMSO van vier verschillende moleculaire lijmverbindingen 2,26,55,57: (A) lenalidomide, (B) iberdomide (CC-220), (C) thalidomide of (D) pomalidomide. Luminescentie werd elke 5 minuten gemeten gedurende een totaal van 19,5 uur. Relatieve lichteenheid (RLU) gegevens van (A-D) werden geconverteerd naar fractionele RLU zoals beschreven in stap 2.4.1 en in een grafiek weergegeven als functie van de tijd. Foutbalken vertegenwoordigen SD van 3 technische replicaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Figuur 4: Berekening van de afbraaksnelheid en Dmax50 voor Ikaros/IKZF1-HiBiT, en multiplexing cell health assays. Kinetische afbraakgegevens uit figuur 3 werden gebruikt om kwantitatieve afbraakparameters te berekenen. (A) Afbraaksnelheden en (B) afbraakmax) worden weergegeven bij elke geneesmiddelconcentratie voor de aangegeven moleculaire lijmverbindingen 2,26,55,57. (B) Dmax50-waarden voor elke verbinding werden berekend met behulp van een dosis-responsmodel met een beperkte Heuvelhelling van 1, dat kan worden gebruikt om de volgorde van afbraakverbindingen voor een doelwit te rangschikken. (C) Cel levensvatbaarheidstests met de iberdomide (CC-220)55,57 afbraakdosisrespons uit figuur 3B werden uitgevoerd als eindpuntmeting na voltooiing van de kinetische degradatiemetingen. Foutbalken vertegenwoordigen SD van 3 technische replicaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Dit protocol beschrijft de kwantitatieve luminescerende detectie van eiwitafbraakkinetiek in levende cellen die zijn ontworpen met CRISPR / Cas9 om antilichaamvrije endogene eiwitdetectietag tot expressie te brengen die is gefuseerd tot een doeleiwit. Gedetailleerde instructies voor het berekenen en verkrijgen van kwantitatieve afbraakparameters, snelheid, Dmax, DC50 en Dmax50 zijn inbegrepen.

High-Throughput cellulaire profilering van gerichte eiwitafbraakverbindingen met behulp van HiBiT CRISPR-cellijnen

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Een werkwijze van gerichte Cell Isolation via Glasoppervlak functionalisering

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radio sensitiviteit van kanker stamcellen in longkanker cellijnen

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Oprichting en karakterisering van de neuro-endocriene tumor Spheroids van de kleine darm

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functionele beoordeling van BRCA1-varianten met CRISPR-gemedieerde basiseditors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profileringsgevoeligheid voor gerichte therapieën in EGFR-mutante NSCLC-patiënt-afgeleide organoïden

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...