Name: high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines
Uploaded: 2020-11-09T15:15:00
Duration: 5 min 33 s
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के.एम.आर., एस.डी.एम., एम.यू. और डी.एल.डी. सभी प्रोमेगा कॉर्पोरेशन के कर्मचारी हैं

Promega Corporation HiBiT और NanoLuc प्रौद्योगिकियों और अनुप्रयोगों के पेटेंट के असाइनमेंट द्वारा वाणिज्यिक मालिक है।

हम यहां एंडपॉइंट लिटिक प्रारूप या लाइव-सेल काइनेटिक मोड में गिरावट यौगिक गतिविधि की स्क्रीनिंग के दो तरीकों को प्रस्तुत करते हैं। ये दृष्टिकोण एक ही लुमिनेसेंट माप सिद्धांतों पर आधारित हैं, फिर भी विस्तार और समझ के विभिन्न स्तर प्रदान करते हैं। किसी भी दृष्टिकोण का विकल्प स्क्रीनिंग लक्ष्यों और यौगिक पुस्तकालय के आकार पर निर्भर करेगा। किसी भी पता लगाने योग्य गिरावट का निरीक्षण करने के लिए बड़े यौगिक स्क्रीनिंग डेक या प्राथमिक स्क्रीन के लिए, एंडपॉइंट लिटिक स्क्रीनिंग संवेदनशील और कुशल उच्च-थ्रूपुट संगतता प्रदान करती है जहां अन्य समापन बिंदु दृष्टिकोण, जैसे कि पश्चिमी धब्बा या मास स्पेक्ट्रोमेट्रीया तो अव्यावहारिक या अनुकूलन करना मुश्किल हो सकता है। इन स्क्रीन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु सीमित सांद्रता और समय बिंदुओं के साथ किया जा सकता है। परीक्षण के लिए अनुशंसित प्रारंभिक सांद्रता 100 एनएम -10 μM की सीमा में हैं, जो कम शक्ति, खराब पारगम्यता, या कुछ मामलों में अत्यधिक शक्तिशाली यौगिकों के साथ, हुक प्रभाव की उपस्थिति वाले प्रारंभिक अवक्रमकों के लिए जिम्मेदार हैं। यह भी सिफारिश की जाती है कि 4-6 घंटे पर प्रारंभिक शुरुआती गिरावट और 18-24 घंटे पर अव्यक्त या निरंतर गिरावट स्थापित करने के लिए कम से कम दो अलग-अलग समय बिंदुओं का परीक्षण किया जाना चाहिए। उच्च अवक्रमण शक्ति और ऑन-टारगेट तंत्र प्रदर्शित करने वाले यौगिक 4-6 घंटे की समय सीमा के भीतर आसानी से देखे जाते हैं, जबकि केवल बाद के समय बिंदुओं पर देखी गई गिरावट या स्पष्ट प्रोटीन हानि विभिन्न तंत्रों के कारण हो सकती है। प्रारंभिक और देर से दोनों समय बिंदुओं पर सेल व्यवहार्यता की निगरानी करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, जैसे कि प्रोटीन हानि को कोशिका मृत्यु के कारण नुकसान से अलग किया जा सकता है। किसी भी प्रकार के लुमिनेसेंट या फ्लोरोसेंट परख के समान, पुस्तकालयों के भीतर यौगिकों के लिए सिग्नल में हस्तक्षेप करने या बाधित करने की क्षमता है, इसलिए, प्रोटीन स्तर की निगरानी के लिए असंबंधित संलयन या वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग करके लीड यौगिकों के साथ ऑर्थोगोनल अनुवर्ती प्रयोग यह आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण होंगे कि इन परखों में आरएलयू का नुकसान सीधे लक्ष्य प्रोटीन क्षरण से जुड़ा हुआ है।
विस्तारित अवधि में लाइव सेल गतिज प्रारूप में स्क्रीन करने की क्षमता पृष्ठभूमि (एस: बी) के परख संकेत पर बहुत अधिक निर्भर करती है। एस: बी में योगदान करने वाले कारकों में लक्ष्य प्रोटीन का अभिव्यक्ति स्तर शामिल है, जो परिमाण के कई आदेशों को फैला सकता है, पेप्टाइड सम्मिलन के लिए चुनी गई सेल लाइन में एलजीबीआईटी अभिव्यक्ति की दक्षता, और इसके विभिन्न देशी परिसरों में पूरक के लिए टैग किए गए लक्ष्य की उपलब्धता। हमने एंडुराज़िन या विवाज़िन के साथ गतिज मोड में गिरावट को सफलतापूर्वक मापने के लिए 15 के एस: बी से युक्त एक सामान्य कटऑफ आवश्यकता स्थापित की है। एस: बी को एंडुराजिन या विवाज़िन लाइव सेल सब्सट्रेट्स की उपस्थिति में अकेले एलजीबीआईटी व्यक्त करने वाली असंपादित पैतृक कोशिकाओं के सापेक्ष एलजीबीआईटी को सह-व्यक्त करने वाली एचआईबीआईटी-संपादित कोशिकाओं के बेसलाइन सिग्नल को मापकर निर्धारित किया जाता है। विवाज़िन एक उच्च लुमिनेसेंट सिग्नल का उत्पादन करेगा लेकिन एंडुराज़िन की तुलना में तेजी से क्षय होगा और सिग्नल अधिग्रहण को 24 घंटे या उससे कम तक सीमित कर सकता है। इसके अलावा, एस: बी इस बात पर भी अत्यधिक निर्भर हो सकता है कि सीआरआईएसपीआर पूल या क्लोन का उपयोग किया जाता है या नहीं। सेल लाइनों में लक्ष्यों के लिए जो अधिक उत्तरदायी हैं और सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 इंजीनियरिंग के लिए उच्च दक्षता रखते हैं, संपादित कोशिकाओं की एक विषम सीआरआईएसपीआर पूल आबादी में गतिज विश्लेषण के लिए पर्याप्त एस: बी हो सकता है। अधिक कठिन सेल लाइनों में लक्ष्यों के लिए जहां सीआरआईएसपीआर के माध्यम से कम कुशल जीनोमिक एकीकरण के परिणामस्वरूप कम एस: बी वाले पूल होते हैं, संपादित आबादी को समृद्ध करने और गतिज विश्लेषण के लिए पर्याप्त रूप से उच्च एस: बी प्राप्त करने के लिए सीआरआईएसपीआर क्लोन को अलग करना आवश्यक हो सकता है। इनमें से किसी भी परिदृश्य के लिए, यदि एस: बी एंडुराज़िन या विवाज़िन सब्सट्रेट्स के साथ 15 से कम है, तो एंडपॉइंट लिटिक स्क्रीनिंग की सलाह दी जाती है।
यौगिकों की बेहतर समझ और लक्षण वर्णन के लिए, मात्रात्मक मापदंडों के साथ गिरावट प्रोफ़ाइल का निर्धारण सहित, जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय गतिज विश्लेषण अनुशंसित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण14,18 है। ऊपर चर्चा किए गए समापन बिंदु विश्लेषण की तरह, प्रारंभिक गतिज स्क्रीनिंग उच्च-थ्रूपुट फैशन में 100 एनएम-10 किमी की सीमा में सीमित सांद्रता के साथ की जा सकती है। 384-वेल प्रारूप में, 100 से अधिक यौगिकों को आसानी से एक प्लेट पर एक एकाग्रता पर तीन प्रतियों में जांचा जा सकता है। परिणामी अवक्रमण प्रोफाइल न केवल देखे गए क्षरण की सीमा पर मार्गदर्शन प्रदान करेंगे, बल्कि गिरावट की दर, गिरावट की अवधि और प्रोटीन14,18 की संभावित वसूली (चित्रा 2 और चित्रा 3)। अवक्रमण प्रोफ़ाइल के आकार भी मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं। विशिष्ट और शक्तिशाली डिग्रेडर्स अक्सर18,53 घंटों में एक पठार में लक्ष्य प्रोटीन का प्रारंभिक तेजी से नुकसान दिखाते हैं, जबकि ट्रांसक्रिप्शनल फीडबैक या यौगिक विषाक्तता जैसे अन्य तंत्र आमतौर पर समय के साथ प्रोटीन के अधिक रैखिक नुकसान का परिणाम देते हैं। इन विवरणों और बारीकियों को समापन बिंदु लिटिक विश्लेषण के साथ याद किया जाता है, और 24-48 घंटों में वास्तविक समय के विश्लेषण के साथ, किसी को नए या अज्ञात यौगिकों के सेट के भीतर सच्चे डीमैक्स को पकड़ने के लिए समय की भविष्यवाणी करने की आवश्यकता नहीं होती है।
वास्तविक समय कैनेटीक्स यौगिक प्रभावकारिता को बेहतर ढंग से समझने के लिए कुशल खुराक प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग की भी अनुमति देता है, यौगिक एकाग्रता प्रारंभिक गिरावट दर को कैसे प्रभावित करती है, और एक से अधिक पैरामीटर के आधार पर यौगिकों को रैंक करने की संभावनाएं प्रदान करती है। अवक्रमण क्षमता के शास्त्रीय माप में स्पष्ट अवक्रमण मैक्सिमा के आधार पर एक विशिष्ट बिंदु पर डीसी50 गणना शामिल होती है। इसके विपरीत, शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए हमारा गतिज दृष्टिकोण प्रत्येक एकाग्रता पर वास्तविक गिरावट को अधिकतम शामिल करता है, भले ही यह समय18 में हो। हम गतिज अवक्रमण शक्ति के इस माप को डीमैक्स5018 कहते हैं। इस फैशन में विश्लेषण उन यौगिकों के लिए जिम्मेदार है जो कम सांद्रता पर अधिक धीरे-धीरे गिरावट शुरू कर सकते हैं और इसलिए अपने डीमैक्स तक पहुंचने के लिए उपचार के बाद लंबा समय लेते हैं। यह गिरावट दर और डीमैक्स दोनों पर यौगिकों को रैंक करने के लिए विशेष रूप से जानकारीपूर्ण हो सकता है। सबसे शक्तिशाली डिग्रेडर्स के लिए यह उन लोगों से धीमी, लेकिन शक्तिशाली डिग्रेडर्स को अलग करेगा जो तेज और शक्तिशाली दोनों हैं। साथ में, हाईबिट सीआरआईएसपीआर सेल लाइनों का उपयोग करके लिटिक और लाइव सेल काइनेटिक स्क्रीनिंग दोनों शक्तिशाली दृष्टिकोण हैं जो लक्षित प्रोटीन क्षरण, यौगिक कार्य की अधिक व्यापक तस्वीर उत्पन्न करते हैं, और प्रमुख गिरावट मापदंडों को बढ़ाने के माध्यम से प्रारंभिक गतिविधि मूल्यांकन से डाउनस्ट्रीम रासायनिक अनुकूलन तक स्क्रीनिंग प्रक्रिया को सक्षम करते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

लक्षित प्रोटीन क्षरण यौगिक, जिसमें आणविक गोंद या चिमेरा को लक्षित करने वाले प्रोटियोलिसिस शामिल हैं, छोटे अणु दवा की खोज में एक रोमांचक नई चिकित्सीय पद्धति है। यौगिकों का यह वर्ग लक्ष्य प्रोटीन और ई 3 लिगेज मशीनरी प्रोटीन को निकटता में लाकर प्रोटीन क्षरण को प्रेरित करता है जो यूबिकिटिन-प्रोटीसोमल मार्ग (यूपीपी) के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन को सर्वव्यापी और अंततः नीचा दिखाने के लिए आवश्यक होता है। हालांकि, उच्च-थ्रूपुट फैशन में लक्ष्य प्रोटीन गिरावट की रूपरेखा, गिरावट प्राप्त करने के लिए आवश्यक सेलुलर मार्गों की जटिलता को देखते हुए अत्यधिक चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। यहां हम 11 एमिनो एसिड हाईबीआईटी टैग के साथ लक्ष्य प्रोटीन के सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 अंतर्जात टैगिंग के उपयोग के आधार पर एक प्रोटोकॉल और स्क्रीनिंग रणनीति प्रस्तुत करते हैं, जो एक लुमिनेसेंट प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एलजीबीआईटी प्रोटीन के लिए उच्च आत्मीयता के साथ पूरक है। अंतर्जात टैग के साथ इन सीआरआईएसपीआर लक्षित सेल लाइनों का उपयोग ल्यूमिनेसेंट प्लेट-आधारित रीडर का उपयोग करके लुमिनेसेंट सिग्नल की निगरानी करके वास्तविक समय, गतिज लाइव सेल या एंडपॉइंट लिटिक मोड में यौगिक प्रेरित गिरावट को मापने के लिए किया जा सकता है। यहां हम विभिन्न प्रारूपों के लिए अनुशंसित स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल को रेखांकित करते हैं, और दर, डीमैक्स, डीसी50, डीमैक्स50 के प्रमुख गिरावट मापदंडों की गणना के साथ-साथ सेल व्यवहार्यता परख के साथ मल्टीप्लेक्सिंग का भी वर्णन करते हैं। ये दृष्टिकोण प्रासंगिक सेलुलर पृष्ठभूमि में लक्ष्य प्रोटीन की अंतर्जात अभिव्यक्ति और विनियमन को बनाए रखते हुए प्रारंभिक चरण के यौगिकों की तेजी से खोज और ट्राइएजिंग को सक्षम करते हैं, जिससे लीड चिकित्सीय यौगिकों के कुशल अनुकूलन की अनुमति मिलती है।

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High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

यह प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन डिग्रेडेशन कैनेटीक्स के मात्रात्मक लुमिनेसेंट डिटेक्शन का वर्णन करता है, जिसे एक लक्ष्य प्रोटीन से जुड़े एंटीबॉडी मुक्त अंतर्जात प्रोटीन डिटेक्शन टैग को व्यक्त करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 का उपयोग करके इंजीनियर किया गया है। मात्रात्मक गिरावट मापदंडों, दर, डीमैक्स, डीसी 50 और डीमैक्स50 की गणना और प्राप्तकरने के लिए विस्तृत निर्देश शामिल हैं।

HiBiT CRISPR सेल लाइनों का उपयोग करके लक्षित प्रोटीन अवक्रमण यौगिकों की उच्च-थ्रूपुट सेलुलर प्रोफाइलिंग

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

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Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

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The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

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Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

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CRISPR-मध्यस्थता आधार संपादकों का उपयोग कर BRCA1 वेरिएंट का कार्यात्मक मूल्यांकन

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

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रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके विट्रो परख में उच्च-थ्रूपुट

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

प्रोफाइलिंग ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स में लक्षित उपचारों के लिए संवेदनशीलता

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

बाह्य प्रवाह विश्लेषण का उपयोग करके एकल 3 डी माइक्रोटिशू स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की खोज करना

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड पीढ़ी

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...