Name: high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines
Uploaded: 2020-11-09T15:15:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

K.M.R, S.D.M, M.U. og D.L.D er alle ansatte i Promega Corporation

1. Endepunktsnedbrytningsstudier med HiBiT CRISPR-målproteiner i lytisk format med valgfri celle levedyktighet fluorescensanalyse
<ol><li>Forberedelse og plating av pattedyrs tilhenger eller suspensjonscellelinje<ol><li>Juster celletettheten til 2,22 x 105/ml ved fortynning i passende cellemedier som brukes til passasje og cellevekst.</li>
		<li>Dispenser celler i plater med minimum 3 brønner per eksperimentell og kontrolltilstand. Dispenser 90 μL (20 000 celler) per brønn av cellesuspensjon i 96-brønns hvite plater. For 384-brønns format, dispenser 36 μL (8000 celler) per brønn av cellesuspensjon i 384-brønns hvite plater.</li>
	</ol></li>
	<li>Fremstilling og tilsetning av forbindelser<ol><li>Forbered serielt fortynnet PROTAC- eller degraderingstestforbindelsesplater ved 1,000x endelig konsentrasjon i 100% DMSO. Fortynn den deretter til 10x endelig konsentrasjon i cellekulturmediet. Legg til et likt volum av DMSO til mediet, som skal brukes som en ikke-sammensatt DMSO-kontroll.</li>
		<li>For 96-brønnsformat legg til 10 μL 10x forbindelses- og kontrollløsninger til 90 μL celler. For 384-brønnformat legg til 4 μL 10x forbindelses- og kontrollløsninger til 36 μL celler.</li>
		<li>Inkuber platene i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i ønsket tid eller under forhold som er optimale for veksten. MERK: Siden dette er en endepunktanalyse, vil testing av flere tidspunkter kreve klargjøring av separate nedbrytningsplater for hvert tidspunkt, som beskrevet i trinn 1.1.2 ovenfor. Inkubasjonstider for å oppdage forbindelsesmediert nedbrytning er svært variabel og er også sannsynligvis avhengig av sammensatt konsentrasjon. Foreslåtte innledende tidspunkter vil være 6 timer og 24 timer.</li>
		<li>Hvis måling av endepunkts selvlysende deteksjon uten valgfri måling av cellens levedyktighet, går du direkte til trinn 1.3 nedenfor. Hvis du utfører multipleksing med måling av cellens levedyktighet, går du videre til neste avsnitt 1.4 nedenfor.</li>
	</ol></li>
	<li>Lytisk måling av celler<ol><li>Umiddelbart før HiBiT-lytiske målinger, tilbered 2x lytisk deteksjonsreagens ved å tilsette 20 μL lytisk substrat og 10 μL LgBiT-protein per hver 1 ml av den lytiske bufferen. Forbered nok 2x deteksjonsreagens for antall brønner som skal analyseres, inkludert ekstra volum for å ta hensyn til pipetteringsfeil (dvs. antall brønner + 10%).</li>
		<li>Tilsett forberedt lytisk deteksjonsreagens til celler. For 96-brønns format, tilsett 100 μL 2x lytisk deteksjonsreagens til hver brønn som inneholder 100 μL celler. For 384-brønnformat, tilsett 40 μL 2x lytisk deteksjonsreagens til hver brønn som inneholder 40 μL celler. Bland platen på en mikroplatevirvelblander i 10-20 minutter ved 350 o / min.</li>
		<li>Mål luminescens på et luminometer som er i stand til å lese luminescens i en 96- eller 384-brønnplate.</li>
	</ol></li>
	<li>Valgfri celle levedyktighet multipleksing MERK: Dette trinnet utføres ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig CellTiter-Fluor (CTF) sett (se Materialfortegnelse).<ol><li>30-40 minutter før ønsket endepunktmåling, klargjør en 6x celle levedyktighetsdeteksjonsreagensløsning ved å tilsette 10 μL av substratet til 2 ml av analysebufferen. Forbered nok 6x reagens for hver brønn som skal analyseres, inkludert ekstra volum for pipetteringsfeil (dvs. antall brønner + 10%).</li>
		<li>Tilsett det forberedte reagenset til brønner. For 96-brønnsformat tilsett 20 μL 6x reagens til hver brønn som allerede inneholder et volum på 100 μL. For 384-brønnformat legg til 8 μL 6x reagens til hver brønn som inneholder 40 μL celler. Bland kort på en mikroplatevirvelblander, og inkluder deretter platen i 30 minutter i en 37 ° C inkubator.</li>
		<li>Ved ønsket målepunkt (dvs. 6 eller 24 timer etter behandling, trinn 1.2.3), måle fluorescens på et instrument som er i stand til å lese fluorescens (380-400 nmEx/505nmEm) i 96- eller 384- brønnformat.</li>
		<li>Forbered 2x lytisk deteksjonsreagens ved å tilsette 20 μL lytisk substrat og 10 μL LgBiT-protein per 1 ml lytisk buffer. Forbered nok 2x deteksjonsreagens for antall brønner som skal analyseres, inkludert ekstra volum for å ta hensyn til pipetteringsfeil (f.eks. antall brønner + 10%).</li>
		<li>Tilsett det forberedte lytiske deteksjonsreagenset til brønner. For 96-brønnformat legg til 120 μL 2x lytisk deteksjonsreagens til hver brønn som allerede inneholder et 120 μL volum. For 384-brønnformat legg til 48 μL 2x lytisk deteksjonsreagens til hver brønn som allerede inneholder et volum på 48 μL. Bland platen på en mikroplate vortex mikser i 10-20 min.</li>
		<li>Mål luminescens på et luminometer som er i stand til å lese luminescens i 96- eller 384- brønnplater.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantifisering av nedbrytning og celle levedyktighet<ol><li>Gjennomsnittlig de relative lysenhetene (RLU) fra DMSO-styringen på det målte tidspunktet. Bruk denne verdien som baseline proteinnivå for målet for å beregne fraksjonell nedbrytning ved å normalisere alle andre behandlinger testet samtidig. For eksempel, hvis gjennomsnittlig RLU for DMSO-kontrollbrønnene ved 6 timer var 10 000, og RLU for en gitt sammensatt behandling ved 6 timer var 5 000, ville fraksjonsnedbrytningen beregnes som 5 000 ÷ 10 000 = 0,5 (ligning 1). Ligning 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Bestem prosentvis degradering fra Fractional RLU: Ligning 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>Plott fraksjonell RLU eller% nedbrytning på bestemte tidspunkter for å rangere aktiviteten til forbindelser.</li>
		<li>Eventuelt kan du analysere data fra relativ fluoresecence unit (RFU) for måling av cellens levedyktighetsanalyse ved å sammenligne verdiene fra alle behandlinger med DMSO-kontrollen. Hvis en signifikant nedgang i RFU observeres for noen behandling i forhold til DMSO-kontrollen, kan nedbrytningsdataene i tillegg normaliseres til cellens levedyktighetsanalysedata for å bestemme endringer i proteinnivå i forhold til tap i celle levedyktighet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sanntids kinetisk nedbrytning av HiBiT CRISPR-målproteiner og valgfri celle levedyktighet luminescensanalyse
MERK: Evnen til å utføre kinetisk screening og nedbrytning krever LgBiT-protein-kopresjon i cellen, som tidligere er beskrevet 18,19,63. Dette kan oppnås via forbigående transfeksjon av en LgBiT-vektor, bruk av BacMam LgBiT, eller ved å utføre HiBiT CRISPR-innsetting i en LgBiT-stabil cellelinje.
<ol><li>Plating av adherente cellelinjer.<ol><li>Fjern medium fra cellekolbe ved aspirasjon, vask celler med DPBS, dissosier celler med 0,05% trypsin-EDTA, og la celler dissosiere fra kolbebunnen. For suspensjonscellelinjer, fortsett til seksjon 2.2.</li>
		<li>Nøytraliser trypsin ved hjelp av serumholdig cellekulturmedium, bland for å samle og resuspendere celler, og overfør cellesuspensjon til et konisk rør.</li>
		<li>Spinn ned celler ved 125 x g i 5 minutter. Kast cellekulturmediet og resuspender i et like stort friskcellekulturmedium.</li>
		<li>Plateceller i analyseplater med minimum triplikatbrønner per eksperimentell og kontrolltilstand. For 96-brønns formattelling for å estimere celletetthet, juster tettheten til 2 x 105 celler / ml i analysemedium og dispenser 100 μL (20 000 celler) per brønn i en 96-brønnplate. For 384-brønns formattelling for å estimere celletetthet, juster tettheten til 4,44 x 105 celler / ml i analysemediet og dispenser 18 μL (8,000 celler) per brønn.</li>
		<li>Inkuber plater ved 37 °C, 5 % CO2 over natten eller under forhold som er optimale for veksten.</li>
	</ol></li>
	<li>Plating av suspensjonsceller<ol><li>Juster celletettheten til 2,22 x 105 celler / ml i CO2-uavhengig medium supplert med 10% FBS og 1x Endurazine (1:100 fortynning av stamreagenset).</li>
		<li>Plateceller i analyseplater med minimum 3 brønner per forsøks- og kontrolltilstand. For 96-brønns format dispensere 90 μL (20 000 celler) per brønn. For 384-brønns format dispensere 36 μL (8000 celler) per brønn. MERK: For suspensjonscellelinjer som har lavt signal til bakgrunn (S: B) luminescens, for eksempel når du arbeider med CRISPR-bassenger i stedet for kloner, er det mulig å øke luminescensen ved å øke antall celler belagt, opptil 100 000 celler / brønn i 96-brønnformat eller 40 000 celler / brønn i 384-brønnformat.</li>
	</ol></li>
	<li>Kinetiske nedbrytningsanalyser ved bruk av HiBiT CRISPR-celler som uttrykker LgBiT<ol><li>For suspensjonsceller som allerede inneholder Endurazine, som ble inkludert i pletteringstrinnet i 2.2., fortsett direkte til trinn 2.3.3. For tilhenger celle linjer forberede Nano-Glo Endurazine løsning. For 96-brønnsformat, lag en 1x-løsning av Endurazine ved å fortynne stamreagens 1:100 til CO2-uavhengig medium supplert med 10% FBS. For 384-brønnformat, lag en 2x løsning av Endurazine ved å fortynne stamreagens 1:50 til CO2-uavhengig medium supplert med 10% FBS.</li>
		<li>Tilsett Endurazine-løsning til hver brønn av adherente celler. For 96-brønns format aspiratmedium og tilsett 90 μL 1x Endurazine-løsning. For 384-brønnformat, tilsett 18 μL 2x Endurazine-løsning til 18 μL celler. Ikke aspirer medium da nedbrytningsanalysen utføres i en 50:50 blanding av kulturmedium og CO2 uavhengig medium i 384-brønnformat.</li>
		<li>Inkuber suspensjon eller festecelleplater som inneholder Endurazine i 2,5 timer i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 for å tillate luminescens å balansere.</li>
		<li>Forbered en 10x konsentrasjon av test PROTAC-titrering i CO2-uavhengig medium og tilsett 10 μL til hver brønn på 96-brønnplate eller 4 μL for 384-brønnplate. For forbindelser med ukjent effekt anbefales utgangspunktet en endelig konsentrasjon på 1-10 μM på høyeste punkt.</li>
		<li>Samle kinetiske målinger av luminescens i luminometer som er likestilt til 37 °C i en periode mellom 0-48 timer. Måletidsintervallene kan tilpasses for hvert eksperiment, men et anbefalt innledende eksperiment vil være luminescensmålinger hvert 5-15 minutt i 24 timer eller ønsket tid.</li>
	</ol></li>
	<li>Valgfri celle levedyktighet samme brønn multiplex analyse etter endelig kinetisk måling MERK: Denne analysen utføres med et kommersielt tilgjengelig CellTiter-Glo (CTG) sett (se Materialfortegnelse).<ol><li>Likevekt CTG-reagens til romtemperatur.</li>
		<li>Etter degraderingsmåling ved siste tidspunkt for kinetisk analyse, tilsett 100 μL (96-brønnplate) eller 40 μL (384-brønnplate) av reagenset per plate brønn, og bland på en plateskaker ved 500-700 o / min (96-brønnplate) eller en mikroplatevirvelblander (384-brønnplate) i 5 minutter.</li>
		<li>Inkuber platen ved romtemperatur i 30 minutter for å tillate cellelyse og slukking av HiBiT-signal.</li>
		<li>Mål total luminescens på et luminometer ved å følge produsentens anbefaling.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantifisering av kinetiske nedbrytningsprofiler<ol><li>Ved å bruke de innsamlede kinetiske luminescensmålingene, normaliserer du de rå RLUene for hver PROTAC-konsentrasjon til den replikerende gjennomsnittlige DMSO-tilstanden ved hvert tidspunkt for å ta hensyn til endringer i fri furimazinkonsentrasjon over tid. Beregn brøk RLU ved hjelp av ligning 1. Ligning 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Fra degraderingskurvene tilpasser du en enkeltkomponent eksponentiell forfallsmodell ved hjelp av ligning 2 til den første nedbrytningsdelen av hver kurve til det punktet der dataene når et platå. MERK: Det kan være nyttig å ekskludere de første datapunktene fra passformen, da det kan være en kort forsinkelse før nedbrytning observeres. Ligning 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>Fra ligning 2, bestem parameteren ƛ, som representerer nedbrytningshastighetskonstanten og platået, som representerer den laveste mengden protein som er igjen.</li>
		<li>Beregn Dmax, som er den maksimale fraksjonelle mengden nedbrytt protein og beregnes som 1-platå.</li>
		<li>Plot Dmax for hver konsentrasjon av PROTAC for å bestemme en tidsuavhengig nedbrytningsstyrkekurve.</li>
		<li>Bestem Dmax50-verdien for tomten i 2.3.5 for å analysere effekten av forbindelser. MERK: For å bestemme en DC50 på et bestemt tidspunkt, plott den beregnede prosentvise nedbrytningen for hver konsentrasjon på det valgte tidspunktet. Dette kan angis som DC 50 t = 4 h eller DC50 t = 12 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

Promega Corporation er kommersiell eier ved tildeling av patenter av HiBiT og NanoLuc teknologier og applikasjoner.

Vi presenterer her to metoder for screening av nedbrytningsforbindelsesaktivitet i enten endepunktlytisk format eller live-celle kinetisk modus. Disse tilnærmingene er basert på de samme selvlysende måleprinsippene, men gir forskjellige detaljnivåer og forståelse. Valget av enten tilnærming vil trolig være avhengig av screening mål og størrelsen på sammensatte biblioteket. For store sammensatte screeningdekk eller primærskjermer for å observere påvisbar nedbrytning, tilbyr endepunktlytisk screening sensitiv og effektiv kompatibilitet med høy gjennomstrømning der andre endepunktstilnærminger, for eksempel western blot eller massespektrometri, kan være enten upraktiske eller vanskelige å tilpasse14. Et utgangspunkt for disse skjermbildene kan utføres med et begrenset antall konsentrasjoner og tidspunkter. Anbefalte innledende konsentrasjoner for å teste er i området 100 nM-10 μM, for å ta hensyn til innledende degraders som har lav styrke, dårlig permeabilitet, eller i noen tilfeller med svært potente forbindelser, tilstedeværelsen av en krokeffekt. Det anbefales videre at minst to forskjellige tidspunkter testes for å etablere tidlig nedbrytning ved 4-6 timer og latent eller vedvarende nedbrytning ved 18-24 timer. Forbindelser som utviser høy nedbrytningsstyrke og on-target mekanisme observeres lett innen en tidsramme på 4-6 timer, mens nedbrytning eller tilsynelatende proteintap observert bare ved senere tidspunkter kan skyldes en rekke mekanismer. Det anbefales sterkt å overvåke cellens levedyktighet på både tidlige og sene tidspunkter, slik at proteintap kan frikobles fra tap på grunn av celledød. I likhet med alle typer luminescerende eller fluorescerende analyser, er det et potensial for forbindelser i biblioteker for å forstyrre eller hemme signal, derfor vil ortogonale oppfølgingseksperimenter med blyforbindelser ved bruk av ikke-relaterte fusjoner eller alternative tilnærminger til overvåking av proteinnivå være viktig for å vurdere at tap av RLU i disse analysene er direkte forbundet med målproteinnedbrytning.
Evnen til å skjerme i levende cellekinetisk format over lengre perioder er avhengig av analysesignalet til bakgrunnen (S: B). Faktorer som bidrar til S: B inkluderer ekspresjonsnivået til selve målproteinet, som kan spenne over flere størrelsesordener, effektiviteten av LgBiT-uttrykk i cellelinjen valgt for peptidinnsetting, og tilgjengeligheten av det merkede målet for komplementering i sine forskjellige innfødte komplekser. Vi har etablert et generelt grensekrav som består av en S:B på 15 for å kunne måle nedbrytning i kinetisk modus med enten Endurazine eller Vivazine. S:B bestemmes ved å måle baselinesignalet til de HiBiT-redigerte cellene som uttrykker LgBiT i forhold til uredigerte foreldreceller som uttrykker LgBiT alene i nærvær av enten Endurazine eller Vivazine levende cellesubstrater. Vivazine vil produsere et høyere selvlysende signal, men vil forfalle raskere enn Endurazine og kan begrense signalinnsamlingen til 24 timer eller mindre. Videre kan S:B også være svært avhengig av om CRISPR-bassenger eller kloner brukes. For mål i cellelinjer som er mer mottagelige og har høy effektivitet for CRISPR / Cas9-prosjektering, kan en heterogen CRISPR-bassengpopulasjon av redigerte celler ha tilstrekkelig S: B for kinetisk analyse. For mål i vanskeligere cellelinjer der mindre effektiv genomisk integrasjon via CRISPR resulterer i bassenger med lav S:B, kan det være nødvendig å isolere CRISPR-kloner for å berike redigerte populasjoner og oppnå en tilstrekkelig høy S:B for kinetisk analyse. For noen av disse scenariene, hvis S:B er mindre enn 15 med enten Endurazine- eller Vivazine-substrater, anbefales endepunktlytisk screening.
For bedre forståelse og karakterisering av forbindelser, inkludert bestemmelse av en nedbrytningsprofil med kvantitative parametere, er sanntidskinetisk analyse i levende celler den anbefalte screeningtilnærmingen 14,18. I likhet med endepunktsanalyse diskutert ovenfor, kan innledende kinetisk screening gjøres med et begrenset antall konsentrasjoner i området 100nM-10μM på høy gjennomstrømningsmåte. I 384-brønnformat kan over 100 forbindelser lett screenes i tre eksemplarer i en konsentrasjon på en enkelt plate. De resulterende nedbrytningsprofilene vil gi veiledning ikke bare om omfanget av degradering observert, men graden av nedbrytning, varigheten av nedbrytningen og potensiell gjenvinning av proteinet14,18 (figur 2 og figur 3). Formene på nedbrytningsprofilen gir også verdifull informasjon. Spesifikke og potente degraders viser ofte et innledende raskt tap av målproteinet til et platå i løpet av timer18,53, mens andre mekanismer som transkripsjonell tilbakemelding eller sammensatt toksisitet vanligvis resulterer i mer lineært tap av proteinet over tid. Disse detaljene og nyansene blir savnet med endepunktlytisk analyse, og med sanntidsanalyse over 24-48 timer trenger man ikke å forutsi tiden for å fange den sanne Dmax innenfor sett med nye eller ukjente forbindelser.
Sanntidskinetikk gir også mulighet for effektiv doseresponsscreening for bedre å forstå forbindelseseffektivitet, hvordan sammensatt konsentrasjon påvirker innledende nedbrytningshastighet, og gir muligheter til å rangere forbindelser basert på mer enn én parameter. Klassiske målinger av nedbrytningsstyrke involverer DC50-beregninger på et bestemt tidspunkt basert på tilsynelatende nedbrytningsmaksimum. I motsetning til dette inkorporerer vår kinetiske tilnærming til å evaluere potens det sanne nedbrytningsmaksimumet ved hver konsentrasjon uavhengig av når det skjer i tid18. Vi kaller dette måling av kinetisk nedbrytningsstyrke, Dmax5018. Analyse på denne måten tar hensyn til forbindelser som kan initiere nedbrytning langsommere ved lavere konsentrasjoner og derfor ta lengre tid etter behandling for å nå Dmax. Det kan være spesielt informativt å rangere forbindelser på både nedbrytningshastighet og Dmax. For de mest potente degraderne vil dette ytterligere skille langsomme, men potente degradere fra de som er både raske og potente. Sammen er både lytisk og levende cellekinetisk screening ved bruk av HiBiT CRISPR-cellelinjer kraftige tilnærminger som gir et mer omfattende bilde av målrettet proteinnedbrytning, sammensatt funksjon og muliggjør screeningprosessen fra innledende aktivitetsvurdering til nedstrøms kjemisk optimalisering gjennom forbedring av viktige nedbrytningsparametere.

Målrettet proteinnedbrytning har dukket opp som et av de raskest voksende områdene i oppdagelse av små molekylmedikamenter, styrket sterkt av den terapeutiske suksessen til immunmodulerende molekylære limforbindelser (f.eks. IMiD) for kreftbehandling, og lovende tidlige kliniske studiedata for proteolyse Målretting av kimeraforbindelser 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Målrettede proteinnedbrytningsforbindelser fungerer ved å bringe i nærheten av et målprotein med E3 ligase maskinproteiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Denne forbindelsesinduserte rekrutteringen av målproteinet til E3-ligasen fører til målproteinet ubiquitinering og nedbrytning via ubiquitinproteasomal pathway (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historisk sett har screeningprogrammer for småmolekylære legemiddelfunn vært avhengige av innledende biokjemiske analyser for å vurdere aktivitet og rangordensforbindelser. Dette har imidlertid presentert en betydelig utfordring for målrettede proteindegradere hvis ultimate aktivitet, nedbrytning via proteasomet, er avhengig av en kaskade av cellulære hendelser 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. De mange veiene og kompleksiteten til proteinkomplekser som kreves for vellykket målforringelse, nødvendiggjør cellulære analysetilnærminger for tidlig screening og triaging av innledende forbindelser. For tiden mangler tilgjengeligheten av teknologier for å overvåke nedbrytning av målprotein på en høy gjennomstrømningsmåte i sammenheng med det cellulære miljøet alvorlig14. Her vil vi presentere protokoller for sanntids kinetisk levende celle eller endepunkt lytisk nedbrytningsaktivitetsvurdering ved bruk av CRISPR / Cas9 endogent merket HiBiT målcellelinjer 18,19,20 for å overvåke tapet av målproteinet via luminescerende måling etter behandling med degraderingsforbindelser10,11,18,19.
For å oppnå vellykket nedbrytning av terapeutiske mål og for å utvide det medikamentbare proteomet, har det oppstått mange tilnærminger og typer degradere som kan målrette mot et bredt spekter av proteiner for destruksjon, inkludert de som er lokalisert ved eller i plasmamembranen, lysosomer, mitokondrielle membraner, cytoplasma og kjernen21-57. De to primære klassene av forbindelser som er mest omfattende studert er molekylære lim og protein rettet mot cimeras 2,4,5,6,7,12,26. Molekylære lim er monovalente, og dermed vanligvis mindre i størrelse, og letter et nytt protein: proteininteraksjonsgrensesnitt med et målprotein ved binding til en E3-ligasekomponent 2,12,26. De er oftest degraders som binder seg til Cereblon (CRBN) E3 ligase komponent 2,12,26,55,56,57. Nylig om spennende nye eksempler utnytte andre E3 ligase maskiner som DCAF1558,59,60 og CDK / Cyclin rekruttering til DDB145 viser potensialet for utvidelse av denne klassen av forbindelser. I motsetning til dette er PROTACs større, bivalente molekyler, bestående av en målbindende ligand, oftest en inhibitor, brokoblet via en kjemisk linker til et E3-ligasehåndtak 1,3,4,5,7,13. Som sådan er disse forbindelsene i stand til direkte binding til både E3-ligasen og målproteinet 1,3,4,5,7,13. Tallrike proteiner har vist seg å nedbrytes via disse bivalente molekylene, og de mest brukte E3-ligasehåndtakene rekrutterer enten CRBN eller Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Imidlertid vokser antallet tilgjengelige håndtak for E3-ligaserekruttering i kimærer rettet mot proteolysedesign raskt, og utvider egenskapene til denne klassen av forbindelser med potensial til å nedbryte ulike målklasser, samt forbedre celle- eller vevstypespesifisitet 24,48,61,62 . Kombinert med det minimale kravet om å engasjere et målprotein, selv med marginal affinitet, holder nedbrytningsforbindelser løfte om å utvide det medikamentbare proteomet.
Karakterisering av den cellulære dynamikken til proteintap, samt potensiell proteinutvinning etter behandling, er avgjørende for å forstå nedbrytningsforbindelsens funksjon og effekt. Selv om det er mulig å studere endogene proteinnivåendringer i relevante cellulære systemer med western blot-antistoffanalyser eller massespektrometri, er disse tilnærmingene vanskelige å tilpasse seg screeningformater med høy gjennomstrømning, har begrenset kvantifiseringsevne eller evne til å måle kinetiske endringer på mange tidspunkter14. For å møte disse utfordringene har vi utviklet et platebasert cellulært luminescerende system for overvåking av endringer i endogene proteinnivåer, som benytter genomisk innsetting via CRISPR / Cas9 av 11-aminosyre-taggen, HiBiT, til stedet for eventuelle viktige nedbrytningsmål18,19,20. Dette peptidet komplementerer med høy affinitet til sin bindingspartner, LgBiT, for å produsere lys luminescens i nærvær av substratet 18,19,20,63, og dermed gjøre disse merkede endogene proteinene luminescerende i celler eller lysater 18,19,20,63 . De relative lysenhetene (RLU) målt med et lumiometerinstrument er direkte proporsjonale med de merkede målproteinnivåene 18,19,20,63. Med utviklingen av stabiliserte luciferasesubstrater er sanntids kinetiske proteinnivåmålinger over 24-48 timers tidsrammer mulig 18,53,64. Dette gjør det mulig å bestemme en fullstendig nedbrytningsprofil for et gitt mål ved en gitt sammensatt konsentrasjon, inkludert kvantitativ analyse av innledende nedbrytningshastighet, nedbrytningsmaksimum (Dmax) og utvinning etter sammensatt behandling18,53. Ved screening av store biblioteker av nedbrytningsforbindelser kan endepunktsanalyse imidlertid også enkelt utføres i 384-brønnformat ved forskjellige legemiddelkonsentrasjoner og angitte tidspunkter.
Protokollene som presenteres i dette manuskriptet representerer cellulære screeningstrategier for målrettede proteinnedbrytningsforbindelser, som gjelder for alle typer degradere. Bruken av HiBiT CRISPR-cellelinjer sammen med disse protokollene er imidlertid ikke begrenset til proteinnedbrytning, men de er generelle verktøy for overvåking av endogene målproteinnivåer som kan moduleres etter behandling for å studere virkningen av forbindelser eller til og med motstandsmekanismer 20,65,66. En forutsetning for disse luminescerende baserte deteksjonsmetodene er en CRISPR endogent merket HiBiT-målcellelinje, noe som er kritisk da det muliggjør sensitiv luminescerende deteksjon, samtidig som den opprettholder endogent måluttrykk og innfødt promotorregulering18,19,20. Det er gjort betydelige fremskritt i bruken av CRISRP/Cas9 for innsetting av genomiske koder, spesielt i skalerbarhet 20 og med høy sensitivitet for deteksjon, i forskjellige formater, inkludert CRISPR-bassenger eller kloner med enten heterozygote eller homozygote alleliske innsettinger18,19,20. Bruk av eksogent uttrykk av HiBiT eller andre reporterfusjoner i celler i stedet for endogen merking er mulig, men betydelig forsiktighet bør utvises ved bruk av systemer med proteinoveruttrykk14,18. Disse kan føre til artefakter for å forstå ekte sammensatt styrke og proteinutvinningsdynamikk14,18, inkludert potensielle transkripsjonelle tilbakemeldingssløyfer aktivert etter målforringelse. I tillegg kan forbindelser med lav styrke i tidlig stadium bli savnet, og presentere seg som falske negativer i screening. Siden proteintap kan skyldes sammensatt indusert toksisitet og celledød, inneholder protokollene beskrevet her sterkt anbefalte, men valgfrie celle levedyktighet selvlysende eller fluorescerende analyser parret med nedbrytningsprotokollen. Det er to hoveddeler i protokollen, lytisk endepunkt og kinetisk screening av levende celler. I hver av disse seksjonene er alternativer inkludert for multiplekset celle levedyktighetsmålinger i endepunkt eller kinetisk format. Overvåking av endringene i det merkede endogene proteinet krever komplementering med LgBiT i celler. Derfor refererer den kinetiske screeningseksjonen til viktige protokoller for innføring av dette, som kan oppnås via forbigående eller stabilt uttrykk og er avgjørende for å utføre levende celle selvlysende målinger. Alle tilnærminger som presenteres her, tillater rask rangeringsrekkefølge og aktivitetsvurdering av forbindelser, noe som muliggjør tidlig stadium sammensatt screeningsarbeid og raskere identifisering av blydegradere.
Denne protokollen er designet for studier av nedbrytningsforbindelser i forbindelse med en HiBiT CRISPR-cellelinje. Protokoller for generering av HiBiT CRISPR-innsettinger for en rekke mål har blitt skissert i flere nyere publikasjoner18,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

Målrettede proteinnedbrytningsforbindelser, inkludert molekylære lim eller proteolyse rettet mot kimærer, er en spennende ny terapeutisk modalitet i oppdagelse av små molekyler. Denne klassen av forbindelser induserer proteinnedbrytning ved å bringe i nærheten av målproteinet og E3-ligasemaskinproteinene som kreves for å ubiquitinere og til slutt nedbryte målproteinet gjennom ubiquitin-proteasomal pathway (UPP). Profilering av målproteinnedbrytning på en høy gjennomstrømningsmåte er imidlertid fortsatt svært utfordrende gitt kompleksiteten av cellulære veier som kreves for å oppnå nedbrytning. Her presenterer vi en protokoll og screeningstrategi basert på bruk av CRISPR/Cas9 endogen merking av målproteiner med 11 aminosyren HiBiT-taggen som utfyller med høy affinitet til LgBiT-proteinet, for å produsere et selvlysende protein. Disse CRISPR-målrettede cellelinjene med endogene koder kan brukes til å måle sammensatt indusert nedbrytning i enten sanntids, kinetisk levende celle eller endepunktlytisk modus ved å overvåke luminescerende signal ved hjelp av en luminescerende platebasert leser. Her skisserer vi de anbefalte screeningprotokollene for de forskjellige formatene, og beskriver også beregningen av viktige nedbrytningsparametere for hastighet, Dmax, DC 50, Dmax50, samt multipleksing med celle levedyktighetsanalyser. Disse tilnærmingene muliggjør rask oppdagelse og triaging av forbindelser i tidlig stadium, samtidig som endogent uttrykk og regulering av målproteiner opprettholdes i relevante cellulære bakgrunner, noe som muliggjør effektiv optimalisering av blyterapeutiske forbindelser.

For å demonstrere enkeltkonsentrasjons endepunkt lytisk nedbrytningsanalyse, flere CDK målproteiner; CDK2, CDK4, CDK7 og CDK10 ble endogent merket med HiBiT ved deres C-endestasjon i HEK293-celler og behandlet med en 1 μM konsentrasjon av pan-kinase Cereblon-basert PROTAC, TL12-18654 (figur 1A). Nivået av CDK-protein ble målt ved forskjellige tidspunkter, og fraksjonell RLU i forhold til DMSO-kontrollen ble bestemt (figur 1A). Hvert CDK-protein viste ulik grad av nedbrytning som respons på den sammensatte behandlingen og de ulike tidspunktene (figur 1A). For å forstå hvordan CDK-proteiner sammenlignet med hverandre direkte når det gjelder proteintap, ble fraksjonelle RLUer i figur 1A beregnet som total% nedbrytning og plottet for hvert tidspunkt i figur 1B. Dette viser at selv ved tidlige tidspunkter, 2 eller 4 timer, viser noen av CDK-familiemedlemmene høye nivåer av nedbrytning som fortsetter å trende oppover over tid (figur 1B).
For å demonstrere kinetisk nedbrytningsanalyse, hvert av BET-familiemedlemproteinene; BRD2, BRD3 og BRD4 ble endogent merket med HiBiT på deres N-endestasjon i HEK293-celler som stabilt uttrykker LgBiT-proteinet18. Disse ble deretter behandlet med tre forskjellige konsentrasjoner av pan-BET PROTACs; den Cereblon-baserte dBET650 (figur 2A) og den VHL-baserte ARV-77141 (figur 2B). Kinetiske målinger ble samlet inn over en 24-timers periode, og fra profilene ved hver konsentrasjon er forskjellene i BET-familiemedlemmers respons lett synlige. BRD2s evne til å initiere en raskere restitusjonsrespons etter nedbrytningsbehandling (figur 2A,B) er tidligere observert med andre pan-BET PROTACs og skyldes sannsynligvis en transkripsjonell tilbakemeldingsrespons som er konkurransedyktig til nedbrytningsprosessen18.
Både endepunkts- og kinetisk analyse kan gjøres med full sammensatt doseresponsbehandling. Vist i figur 3 er nedbrytningsprofiler for kinetisk doserespons ved behandling av Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat-celler som stabilt uttrykker LgBiT-protein med fire forskjellige molekylære limforbindelser 2,26,55,57; lenalidomid (figur 3A), iberdomid (CC-220) (figur 3B), thalidomid (figur 3C) og pomalidomid (figur 3D). Disse degraderingene viser signifikante forskjeller i nedbrytningsrespons mellom forbindelsene så vel som på tvers av konsentrasjonsseriene (figur 3).
For kvantitativ vurdering av nedbrytning og rangeringsrekkefølge ble forbindelsene i figur 3 brukt til å beregne viktige degraderingsparametere, inkludert degraderingshastighet (figur 4A), Dmax (figur 4B) og Dmax50-verdier (figur 4B). Disse analysene viser at iberdomid (CC-220) og pomalidomid har svært like raske initiale nedbrytningsrater (figur 4A), men iberdomid (CC-220) har høyest potens som tidligere er sett i ortogonale studier55,57 (figur 4B). Siden Iberdomid utviser så høy potens, og alle testede konsentrasjoner viser større enn 50 % nedbrytning, representerer Dmax50-verdien oppnådd for Iberdomid et estimat basert på begrensningen i nøyaktig tilpasning av dataene. Fra grafene i figur 3C, D og figur 4B degraderer verken lenalidomid eller thalidomid Ikaros/IKZF1-målet til fullføring ved de høyeste konsentrasjonene som er testet. På grunn av svært liten nedbrytning observert med thalidomid, kunne nedbrytningssporene ikke tilpasses nøyaktig til en eksponentiell nedbrytningsmodell, derfor ble nedbrytningshastigheten ikke kvantifisert for denne behandlingen. For den mest potente degraderen, iberdomid (CC-220)55,57 (figur 4B). Cellens levedyktighetsmultipleksanalyser viste ingen tap i celle levedyktighet for de testede konsentrasjonene (figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Figur 1: Nedbrytning og toksisitet av CDK-endepunkt med pan-kinase PROTAC, TL12-18654. (A) Velg panel av endogene CDK-målproteiner smeltet sammen med HiBiT på C-terminalen via CRISPR/Cas9 og vurdert for nedbrytning med 1 μM TL12-186 PROTAC 54 ved 2 timer, 4 timer, 8 timer og24 timer i behandling. Verdier representeres som Fractional RLU i forhold til en DMSO-kontroll målt ved hvert tidspunkt. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet av 3 tekniske repliker. (B) Prosentvis nedbrytning av panel av CDK-målproteiner beregnet ut fra (A) som representerer mengden nedbrytning av hvert familiemedlem observert ved 2, 4, 8 og 24 timers tidspunkter. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet av 3 tekniske repliker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Figur 2: Profilering av kinetisk degraderingsselektivitet for BET-familiemedlemmer med BET-degradere, dBET650 og ARV-77141. Kinetiske nedbrytningsprofiler for endogene BET-familiemedlemmer, BRD2, BRD3 og BRD4, merket med HiBiT på N-terminalen via CRISPR/Cas9 med behandling av enkeltkonsentrasjoner på 1 nM (venstre), 10 nM (midten) eller 100 nM (høyre) dBET650 (A) eller ARV-77141 (B) PROTACs. Verdier representeres som Fractional RLU beregnet fra en DMSO-kontroll ved hvert kinetiske tidspunkt. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet av 4 tekniske repliker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Figur 3: Live cell kinetisk nedbrytning doseresponsprofiler av Ikaros/IKZF1-HiBiT med molekylært limpanel 2,26,55,57. Jurkat-celler som stabilt uttrykker LgBiT-proteinet ble konstruert ved hjelp av CRISPR / Cas9 for å merke C-terminalen til Ikaros / IKZF1 med HiBiT-peptidet. Cellene ble behandlet med en 8-punkts doseresponskonsentrasjonsserie inkludert DMSO av fire forskjellige molekylære limforbindelser 2,26,55,57: (A) lenalidomid, (B) iberdomid (CC-220), (C) thalidomid eller (D) pomalidomid. Luminescens ble målt hvert 5. minutt i totalt 19,5 timer. Relative light unit (RLU) data fra (A-D) ble konvertert til brøk RLU som beskrevet i trinn 2.4.1 og grafert som en funksjon av tid. Feilfelt representerer SD på 3 tekniske repliker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Figur 4: Beregning av degraderingshastighet og Dmax50 for Ikaros/IKZF1-HiBiT, og multiplekseringscellehelseanalyser. Kinetisk nedbrytningsdata fra figur 3 ble brukt til å beregne kvantitative degraderingsparametere. (A) Nedbrytningshastigheter og (B) nedbrytningsmaksimumsverdier (Dmax) er grafert ved hver legemiddelkonsentrasjon for de angitte molekylære limforbindelsene 2,26,55,57. (B) Dmax50-verdier for hver forbindelse ble beregnet ved hjelp av en dose-respons-modell med begrenset Hill-helning på 1, som kan brukes til å rangere ordens nedbrytningsforbindelser for et mål. (C) Celle levedyktighetsanalyser med iberdomid (CC-220)55,57 degraderingsdoserespons fra figur 3B ble utført som endepunktmåling ved fullføring av de kinetiske nedbrytningsmålingene. Feilfelt representerer SD på 3 tekniske repliker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Denne protokollen beskriver den kvantitative luminescerende deteksjonen av proteinnedbrytningskinetikk i levende celler som er konstruert ved hjelp av CRISPR / Cas9 for å uttrykke antistofffri endogen proteindeteksjonskode smeltet sammen med et målprotein. Detaljerte instruksjoner for beregning og innhenting av kvantitative degraderingsparametere, hastighet, Dmax, DC 50 og Dmax50 er inkludert.

Cellulær profilering med høy gjennomstrømning av målrettede proteinnedbrytningsforbindelser ved bruk av HiBiT CRISPR-cellelinjer

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

En metode for målrettet Cell Isolation via Glass Surface funksjon

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Bruke Dot analysen å analysere migrering av cellen ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensitivity av kreft stamceller i lungekreft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering av små tarm Nevroendokrine tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse av sidepopulasjon i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Funksjonell vurdering av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-Medierte baseredigerere

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay ved bruk av pasientavledede tumororganoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profilering av følsomhet for målrettede terapier i EGFR-mutant NSCLC pasientavledede organoider

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Utforske mitokondriell energimetabolisme av enkelt 3D microtissue sfæroider ved hjelp av ekstracellulær fluksanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondrial cybrid generasjon ved hjelp av kreftcellelinjer

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...