Name: high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines
Uploaded: 2020-11-09T15:15:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

K.M.R, S.D.M, M.U. и D.L.D являются сотрудниками корпорации Promega

Корпорация Promega является коммерческим владельцем по присвоению патентов на технологии и приложения HiBiT и NanoLuc.

Здесь мы представляем два метода скрининга активности соединения деградации либо в литическом формате конечной точки, либо в кинетическом режиме живых клеток. Эти подходы основаны на одних и тех же принципах люминесцентных измерений, но обеспечивают различные уровни детализации и понимания. Выбор любого из подходов, вероятно, будет зависеть от целей скрининга и размера составной библиотеки. Для больших составных экранирующих колод или первичных экранов для наблюдения за любой обнаруживаемой деградацией литический скрининг конечных точек обеспечивает чувствительную и эффективную высокопроизводительную совместимость, когда другие подходы к конечным точкам, такие как западное пятно или масс-спектрометрия, могут быть либо непрактичными, либо трудными для адаптации14. Отправная точка для этих экранов может быть выполнена с ограниченным количеством концентраций и временных точек. Рекомендуемые начальные концентрации для тестирования находятся в диапазоне 100 нМ-10 мкМ, чтобы учесть начальные деградаторы, имеющие низкую эффективность, плохую проницаемость или, в некоторых случаях с сильнодействующими соединениями, наличие эффекта крючка. Кроме того, рекомендуется испытать как минимум две различные временные точки для установления ранней деградации через 4-6 ч и латентной или устойчивой деградации через 18-24 ч. Соединения, которые демонстрируют высокую эффективность деградации и целевой механизм, легко наблюдаются в течение 4-6 часов, тогда как деградация или кажущаяся потеря белка, наблюдаемая только в более поздние моменты времени, может быть обусловлена различными механизмами. Настоятельно рекомендуется контролировать жизнеспособность клеток как в ранние, так и в поздние моменты времени, так что потеря белка может быть отделена от потери из-за гибели клеток. Подобно любому типу люминесцентного или флуоресцентного анализа, существует потенциал для соединений в библиотеках вмешиваться или ингибировать сигнал, поэтому ортогональные последующие эксперименты со свинцовыми соединениями с использованием несвязанных слияний или альтернативных подходов к мониторингу уровня белка будут важны для оценки того, что потеря RLU в этих анализах напрямую связана с деградацией целевого белка.
Возможность скрининга в кинетическом формате живых клеток в течение длительных периодов времени в значительной степени зависит от сигнала анализа на фон (S: B). Факторы, которые способствуют S: B, включают уровень экспрессии самого целевого белка, который может охватывать несколько порядков величины, эффективность экспрессии LgBiT в клеточной линии, выбранной для пептидной вставки, и наличие помеченной цели для дополнения в ее различных родных комплексах. Мы установили общее требование к отсечке, состоящее из S:B 15, для успешного измерения деградации в кинетическом режиме либо с эндуразином, либо с вивазином. S:B определяется путем измерения базового сигнала hiBiT-отредактированных клеток, совместно экспрессирующих LgBiT относительно неотредактированных родительских клеток, экспрессирующих lgBiT в присутствии субстратов живых клеток Endurazine или Vivazine. Вивазин будет производить более высокий люминесцентный сигнал, но будет распадаться быстрее, чем эндуразин, и может ограничить получение сигнала до 24 часов или менее. Кроме того, S:B также может сильно зависеть от того, используются ли пулы CRISPR или клоны. Для мишеней в клеточных линиях, которые более поддаются и имеют высокую эффективность для разработки CRISPR / Cas9, гетерогенная популяция пула CRISPR отредактированных клеток может иметь достаточный S:B для кинетического анализа. Для целей в более сложных клеточных линиях, где менее эффективная геномная интеграция через CRISPR приводит к пулам с низким S:B, выделение клонов CRISPR может потребоваться для обогащения отредактированных популяций и достижения достаточно высокого S:B для кинетического анализа. Для любого из этих сценариев, если S:B меньше 15 с субстратами Endurazine или Vivazine, рекомендуется скрининг конечных точек.
Для лучшего понимания и характеристики соединений, включая определение профиля деградации с количественными параметрами, кинетический анализ в реальном времени в живых клетках является рекомендуемым подходом скрининга14,18. Как и анализ конечных точек, рассмотренный выше, первоначальный кинетический скрининг может быть выполнен с ограниченным числом концентраций в диапазоне 100нМ-10 мкМ с высокой пропускной способностью. В формате 384 лунки более 100 соединений могут быть легко просеяны в трех экземплярах при одной концентрации на одной пластине. Полученные в результате профили деградации будут служить ориентиром не только в отношении степени наблюдаемой деградации, но и в отношении скорости деградации, продолжительности деградации и потенциального восстановления белка 14,18 (рисунок 2 и рисунок 3). Формы профиля деградации также дают ценную информацию. Специфические и мощные деградаторы часто показывают первоначальную быструю потерю целевого белка до плато в течениенескольких часов 18,53, тогда как другие механизмы, такие как транскрипционная обратная связь или токсичность соединения, обычно приводят к более линейной потере белка с течением времени. Эти детали и нюансы упускаются из виду при анализе конечных точек, а при анализе в реальном времени в течение 24-48 часов не нужно предсказывать время для захвата истинного Dmax в наборах новых или неизвестных соединений.
Кинетика в режиме реального времени также позволяет проводить эффективный скрининг дозовой реакции для лучшего понимания эффективности соединения, того, как концентрация соединения влияет на начальную скорость деградации, и предлагает возможности для ранжирования соединений на основе более чем одного параметра. Классические измерения потенции деградации включают расчеты DC50 в определенный момент времени на основе кажущихся максимумов деградации. Напротив, наш кинетический подход к оценке потенции включает в себя истинный максимум деградации при каждой концентрации независимо от того, когда это происходит во времени18. Мы называем это измерение потенции кинетической деградации Dmax5018. Анализ таким образом учитывает соединения, которые могут инициировать деградацию медленнее при более низких концентрациях и, следовательно, требуют больше времени после обработки, чтобы достичь своего Dmax. Особенно информативным может быть ранжирование соединений как по скорости деградации, так и по Dmax. Для наиболее мощных деградаторов это еще больше дифференцирует медленные, но мощные деградаторы от тех, которые являются быстрыми и мощными. Вместе как литический, так и живой клеточный кинетический скрининг с использованием клеточных линий HiBiT CRISPR являются мощными подходами, которые дают более полную картину целенаправленной деградации белка, функции соединения и позволяют проводить процесс скрининга от первоначальной оценки активности до последующей химической оптимизации за счет улучшения ключевых параметров деградации.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

Целевые соединения деградации белка, включая молекулярные клеи или протеолиз, нацеленные на химеры, являются захватывающим новым терапевтическим методом в открытии низкомолекулярных лекарств. Этот класс соединений индуцирует деградацию белка, приводя в близость целевой белок и белки механизма E3-лигазы, необходимые для убиквитации и в конечном итоге деградации целевого белка через убиквитин-протеасомальный путь (UPP). Однако профилирование деградации целевого белка с высокой пропускной способностью остается очень сложным, учитывая сложность клеточных путей, необходимых для достижения деградации. Здесь мы представляем протокол и стратегию скрининга, основанную на использовании эндогенной маркировки CRISPR/ Cas9 целевых белков с 11 аминокислотной меткой HiBiT, которая дополняет с высоким сродством к белку LgBiT для получения люминесцентного белка. Эти целевые клеточные линии CRISPR с эндогенными метками могут использоваться для измерения деградации, индуцированной соединениями, в режиме реального времени, кинетических живых клетках или конечных точках литических режимов путем мониторинга люминесцентного сигнала с использованием люминесцентного считывателя на основе пластин. Здесь мы излагаем рекомендуемые протоколы скрининга для различных форматов, а также описываем расчет ключевых параметров деградации скорости, Dmax, DC50, Dmax50, а также мультиплексирование с помощью анализов жизнеспособности клеток. Эти подходы позволяют быстро обнаруживать и сортировать соединения на ранней стадии, сохраняя при этом эндогенную экспрессию и регуляцию белков-мишеней в соответствующих клеточных фонах, что позволяет эффективно оптимизировать терапевтические соединения свинца.

Для демонстрации анализа литической деградации конечной точки одной концентрации несколько CDK нацелены на белки; CDK2, CDK4, CDK7 и CDK10 эндогенно помечали HiBiT на их C-конце в клетках HEK293 и обрабатывали концентрацией 1 мкМ панкиназы PROTAC на основе цереблона, TL12-18654 (рисунок 1A). Уровень белка CDK измеряли в разные моменты времени и определяли дробный RLU относительно контроля DMSO (рисунок 1A). Каждый белок CDK показал различную степень деградации в ответ на обработку соединения и различные временные точки (рисунок 1A). Чтобы понять, как белки CDK сравниваются друг с другом непосредственно с точки зрения потери белка, дробные RLU на рисунке 1A были рассчитаны как общий % деградации и построены для каждой временной точки на рисунке 1B. Это показывает, что даже в ранние моменты времени, через 2 или 4 ч, некоторые члены семейства CDK демонстрируют высокие уровни деградации, которые продолжают иметь тенденцию к росту с течением времени (рисунок 1B).
Для демонстрации анализа кинетической деградации каждый из белков семейства BET; BRD2, BRD3 и BRD4 были эндогенно помечены HiBiT на их N-конце в клетках HEK293, стабильно экспрессирующих белок LgBiT18. Затем их обрабатывали тремя различными концентрациями пан-BET PROTACs; dBET650 на основе Cereblon (рисунок 2A) и ARV-77141 на основе VHL (рисунок 2B). Кинетические измерения были собраны в течение 24-часового периода, и из профилей при каждой концентрации различия в реакции членов семьи BET легко очевидны. Способность BRD2 инициировать более быструю реакцию восстановления после обработки соединений после деградации (рисунок 2A,B) ранее наблюдалась с другими пан-BET PROTAC и, вероятно, обусловлена транскрипционной реакцией обратной связи, конкурентоспособной по отношению к процессу деградации18.
Как конечный, так и кинетический анализ могут быть выполнены с полным комплексным дозовым ответом. На фиг.3 показаны кинетические профили деградации дозового ответа лечения клеток Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat, стабильно экспрессирующих белок LgBiT четырьмя различными молекулярными клеевыми соединениями 2,26,55,57; леналидомид (рисунок 3A), ибердомид (CC-220) (рисунок 3B), талидомид (рисунок 3C) и помалидомид (рисунок 3D). Эти деградаторы показывают значительные различия в реакции на деградацию среди соединений, а также в рядах концентраций (рисунок 3).
Для количественной оценки деградации и ранжирования соединений на фиг.3 использовались профили реакции дозы для расчета ключевых параметров деградации, включая скорость деградации (Рисунок 4A), Dmax (Рисунок 4B) и Dmax50 (Рисунок 4B). Эти анализы показывают, что ибердомид (CC-220) и помалидомид имеют очень похожие быстрые начальные скорости деградации (рисунок 4A), но ибердомид (CC-220) обладает самой высокой эффективностью, как это было ранее замечено в ортогональных исследованиях55,57 (рисунок 4B). Поскольку ибердомид обладает такой высокой эффективностью, а все протестированные концентрации показывают деградацию более чем на 50%, значение Dmax50, полученное для ибердомида, представляет собой оценку, основанную на ограничении в точной подгонке данных. Из графиков на рисунках 3C, D и 4B ни леналидомид, ни талидомид не ухудшают цель Ikaros/IKZF1 до завершения при самых высоких испытанных концентрациях. Из-за очень небольшой деградации, наблюдаемой с талидомидом, следы деградации не могли быть точно сопоставлены с экспоненциальной моделью распада, поэтому скорость деградации не была количественно определена для этой обработки. Для наиболее мощного деградатора - ибердомид (CC-220)55,57 (рисунок 4B). Мультиплексные анализы жизнеспособности клеток не показали потери жизнеспособности клеток для тестируемых концентраций (рисунок 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Рисунок 1: Деградация конечной точки CDK и токсичность с панкиназой PROTAC, TL12-18654. (A) Выбрать панель эндогенных белков-мишеней CDK, слитых с HiBiT на С-конце через CRISPR/Cas9 и оцененных на деградацию с помощью 1 мкМ TL12-186 PROTAC54 через 2 ч, 4 ч, 8 ч и 24 ч лечения. Значения представлены в виде дробного RLU относительно элемента управления DMSO, измеренного в каждой точке времени. Полосы ошибок представляют собой SD среднего значения 3 технических реплик. (B) Процент деградации панели белков-мишеней CDK, рассчитанный из (A), представляющий величину деградации каждого члена семьи, наблюдаемую в 2, 4, 8 и 24-часовых временных точках. Полосы ошибок представляют собой SD среднего значения 3 технических реплик. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Рисунок 2: Профилирование селективности кинетической деградации членов семейства BET с помощью деградаторов BET, dBET650 и ARV-77141. Профили кинетической деградации эндогенных членов семейства BET, BRD2, BRD3 и BRD4, помеченные HiBiT на N-конце через CRISPR/Cas9 с обработкой единичных концентраций 1 нМ (слева), 10 нМ (средняя) или 100 нМ (справа) dBET650 (A) или ARV-77141 (B) PROTACs. Значения представлены в виде дробного RLU, вычисляемого из элемента управления DMSO в каждой кинетической точке времени. Полосы ошибок представляют SD среднего значения 4 технических реплик. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Рисунок 3: Профили реакции дозы кинетической деградации живых клеток Ikaros/IKZF1-HiBiT с молекулярной клеевой панелью 2,26,55,57. Клетки Юрката, стабильно экспрессирующие белок LgBiT, были спроектированы с использованием CRISPR/Cas9 для маркировки С-конца Ikaros/IKZF1 пептидом HiBiT. Клетки обрабатывали 8-точечным диапазоном концентраций дозового ответа, включая ДМСО четырех различных соединений молекулярного клея 2,26,55,57: (А) леналидомид, (В) ибердомид (CC-220), (С) талидомид или (D) помалидомид. Люминесценцию измеряли каждые 5 мин в общей сложности 19,5 ч. Данные относительной световой единицы (RLU) из (A-D) преобразовывали в дробные RLU, как описано в Шаге 2.4.1, и отображали график как функцию времени. Полосы ошибок представляют собой SD из 3 технических реплик. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Рисунок 4: Расчет скорости деградации и Dmax50 для Ikaros/IKZF1-HiBiT, а также мультиплексирование анализов здоровья клеток. Для расчета количественных параметров деградации использовались данные о кинетической деградации, приведенные на рисунке 3. (A) Скорость деградации и (B) максимальные значения деградации (Dmax) приведены в графике при каждой концентрации лекарственного средства для указанных соединений молекулярного клея 2,26,55,57. (B) Значения Dmax50 для каждого соединения были рассчитаны с использованием модели "доза-реакция" с ограниченным наклоном Хилла 1, которая может быть использована для ранжирования соединений деградации порядка для мишени. (C) Анализы жизнеспособности клеток с помощью ибердомида (CC-220)55,57 реакции на дозу деградации с рисунка 3B проводили в качестве измерения конечной точки после завершения измерений кинетической деградации. Полосы ошибок представляют собой SD из 3 технических реплик. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Этот протокол описывает количественное люминесцентное обнаружение кинетики деградации белка в живых клетках, которые были разработаны с использованием CRISPR / Cas9 для экспрессии метки обнаружения эндогенного белка, свободного от антител, слитого с целевым белком. Включены подробные инструкции по расчету и получению количественных параметров деградации, скорости, Dmax, DC50 и Dmax50 .

Высокопроизводительное клеточное профилирование целевых соединений деградации белка с использованием клеточных линий HiBiT CRISPR

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Метод Targeted Выделение клеток с помощью стеклянной поверхности функционализации

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Использование Dot пробирного анализа миграции клеток листов

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Радиочувствительность стволовых клеток рака в линиях клеток рака легких

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Создание и характеристика малого кишечника нейроэндокринных опухолевых сфероидов

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Функциональная оценка вариантов BRCA1 с использованием базовых редакторов CRISPR-Mediated

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Профилирование чувствительности к таргетной терапии в органоидах EGFR-мутантного НМРЛ, полученных из пациента

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Изучение митохондриального энергетического метаболизма одиночных 3D-сфероидов микротизюса с использованием анализа внеклеточного потока

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Генерация трансмитохондриальных цибридов с использованием линий раковых клеток

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...