Name: high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines
Uploaded: 2020-11-09T15:15:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

K.M.R, S.D.M, M.U. och D.L.D är alla anställda i Promega Corporation

1. Endpoint degradation studies med HiBiT CRISPR målproteiner i lytiskt format med valfri cellviabilitetsfluorescensanalys
<ol><li>Beredning och plätering av cellinje för däggdjur eller suspensionscell<ol><li>Justera celldensiteten till 2,22 x 105/ml genom utspädning i lämpliga cellmedier som används för passering och celltillväxt.</li>
		<li>Dispensera celler i plattor med minst 3 brunnar per experimentellt och kontrolltillstånd. Fördela 90 μL (20 000 celler) per brunn av cellsuspension i 96-brunns vita plattor. För 384-brunnsformat, dispensera 36 μL (8 000 celler) per brunn cellsuspension i 384-brunns vita plattor.</li>
	</ol></li>
	<li>Beredning och tillsats av föreningar<ol><li>Bered serieutspädda PROTAC- eller degraderingstestföreningsplattor vid 1 000 x slutlig koncentration i 100 % DMSO. Späd sedan den till 10x slutlig koncentration i cellodlingsmediet. Lägg till en lika stor volym DMSO till mediet, som ska användas som en DMSO-kontroll utan förening.</li>
		<li>För 96-brunnsformat tillsätt 10 μL 10x förening och kontrolllösningar till 90 μL celler. För 384-brunnsformat tillsätt 4 μL 10x förening och kontrolllösningar till 36 μL celler.</li>
		<li>Inkubera plattorna i en inkubator vid 37 °C och 5%CO2 under önskad tid eller under förhållanden som är optimala för deras tillväxt. OBS: Eftersom detta är en slutpunktsanalys kommer testning av flera tidpunkter att kräva beredning av separata nedbrytningsplattor för varje tidpunkt, enligt beskrivningen i steg 1.1.2 ovan. Inkubationstiderna för att detektera föreningsmedierad nedbrytning är mycket varierande och är sannolikt också beroende av föreningskoncentration. Föreslagna initiala tidpunkter skulle vara 6 h och 24 h.</li>
		<li>Om mätning av slutpunktens självlysande detektion utan den valfria cellviabilitetsmätningen, fortsätt direkt till steg 1.3 nedan. Om multiplexering utförs med cellviabilitetsmätning, fortsätt till nästa avsnitt 1.4 nedan.</li>
	</ol></li>
	<li>Lytisk mätning av celler<ol><li>Omedelbart före HiBiT-lytiska mätningar, förbered 2x lytiskt detektionsreagens genom att tillsätta 20 μL lytiskt substrat och 10 μL LgBiT-protein per 1 ml av den lytiska bufferten. Förbered tillräckligt med 2x detektionsreagens för antal brunnar som ska analyseras, inklusive extra volym för att ta hänsyn till pipettfel (dvs. antal brunnar + 10%).</li>
		<li>Lägg till förberett lytiskt detektionsreagens till celler. För 96-brunnsformat, tillsätt 100 μL 2x lytiskt detektionsreagens till varje brunn som innehåller 100 μL celler. För 384-brunnsformat, tillsätt 40 μL 2x lytiskt detektionsreagens till varje brunn som innehåller 40 μL celler. Blanda plattan på en mikroplattvirvelblandare i 10-20 min vid 350 rpm.</li>
		<li>Mät luminescens på en luminometer som kan läsa luminescens i en 96- eller 384-brunnsplatta.</li>
	</ol></li>
	<li>Valfri multiplexering av cellviabilitet OBS: Detta steg utförs med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt CellTiter-Fluor (CTF) kit (se Materialförteckning).<ol><li>30-40 min före önskad slutpunktsmätning, förbered en 6x cellviabilitetsdetektionsreagenslösning genom att tillsätta 10 μL av substratet till 2 ml av analysbufferten. Förbered tillräckligt med 6x reagens för varje brunn som ska analyseras, inklusive extra volym för pipetteringsfel (dvs. antal brunnar + 10%).</li>
		<li>Tillsätt det beredda reagenset till brunnar. För 96-brunnsformat tillsätt 20 μL 6x reagens till varje brunn som redan innehåller en volym på 100 μl. För 384-brunnsformat tillsätt 8 μL 6x reagens till varje brunn som innehåller 40 μL celler. Blanda kort på en virvelblandare med mikroplatta och inkubera sedan plattan i 30 minuter i en 37 °C inkubator.</li>
		<li>Vid önskat mätmått (dvs. 6 eller 24 timmar efter behandling, steg 1.2.3), mät fluorescensen på ett instrument som kan läsa fluorescens (380-400nmEx/505nmEm) i 96- eller 384- brunnsformat.</li>
		<li>Bered 2x lytiskt detektionsreagens genom att tillsätta 20 μL lytiskt substrat och 10 μL LgBiT-protein per 1 ml lytisk buffert. Förbered tillräckligt med 2x detektionsreagens för antal brunnar som ska analyseras, inklusive extra volym för att ta hänsyn till pipettfel (t.ex. antal brunnar + 10%).</li>
		<li>Tillsätt det beredda lytiska detektionsreagenset i brunnar. För 96-brunnsformat tillsätt 120 μL 2x lytiskt detektionsreagens till varje brunn som redan innehåller en volym på 120 μL. För 384-brunnsformat tillsätt 48 μL 2x lytiskt detektionsreagens till varje brunn som redan innehåller en volym på 48 μL. Blanda plattan på en mikroplattvirvelblandare i 10-20 min.</li>
		<li>Mät luminescens på en luminometer som kan läsa luminescens i 96- eller 384- brunnsplattor.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantifiering av nedbrytning och cellviabilitet<ol><li>Medelvärde för de relativa ljusenheterna (RLU) från DMSO-kontrollen vid den uppmätta tidpunkten. Använd detta värde som baslinjeproteinnivå för målet för att beräkna fraktionerad nedbrytning genom att normalisera alla andra behandlingar som testats samtidigt och peka på detta värde. Om till exempel den genomsnittliga RLU för DMSO-kontrollbrunnarna vid 6 timmar var 10 000 och RLU för en given föreningsbehandling vid 6 timmar var 5 000, skulle den fraktionerade nedbrytningen beräknas som 5 000 ÷ 10 000 = 0,5 (ekvation 1). Ekvation 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Bestäm den procentuella nedbrytningen från fraktionerad RLU: Ekvation 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>Plotta fraktionerad RLU- eller % nedbrytning vid specifika tidpunkter för att rangordna föreningarnas aktivitet.</li>
		<li>Du kan också analysera data från relativ fluoresecence unit (RFU) för mätningen av cellviabilitetsanalysen genom att jämföra värdena från alla behandlingar med DMSO-kontrollen. Om en signifikant minskning av RFU observeras för någon behandling i förhållande till DMSO-kontrollen, kan nedbrytningsdata dessutom normaliseras till cellviabilitetsanalysdata för att bestämma förändringar i proteinnivå i förhållande till förluster i cellviabilitet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kinetisk nedbrytning i realtid av HiBiT CRISPR-målproteiner och valfri cellviabilitetsluminescensanalys
OBS: Förmågan att utföra kinetisk screening och nedbrytning kräver LgBiT-protein-samuttryck i cellen, vilket har beskrivits tidigare18,19,63. Detta kan uppnås genom övergående transfektion av en LgBiT-vektor, användning av BacMam LgBiT eller genom att utföra HiBiT CRISPR-insättning i en LgBiT-stabil cellinje.
<ol><li>Plätering av vidhäftande cellinjer.<ol><li>Ta bort mediet från cellkolven genom aspiration, tvätta cellerna med DPBS, dissociera celler med 0,05% trypsin-EDTA och låt cellerna dissociera från kolvbotten. För suspensionscellinjer, fortsätt till avsnitt 2.2.</li>
		<li>Neutralisera trypsin med seruminnehållande cellodlingsmedium, blanda för att samla och återsuspendera celler och överföra cellsuspension till ett koniskt rör.</li>
		<li>Snurra ner celler vid 125 x g i 5 minuter. Kassera cellodlingsmediet och återsuspendera i en lika stor volym färskt cellodlingsmedium.</li>
		<li>Plåtceller i analysplattor med ett minimum av tredubbla brunnar per experimentellt och kontrolltillstånd. För 96-brunnsformat för att uppskatta celldensiteten, justera densiteten till 2 x 105 celler / ml i analysmedium och dispensera 100 μL (20 000 celler) per brunn i en 96-brunnsplatta. För 384-brunnsformat för att uppskatta celldensiteten, justera densiteten till 4,44 x 105 celler / ml i analysmediet och dispensera 18 μL (8 000 celler) per brunn.</li>
		<li>Inkubera plattor vid 37 °C, 5 %CO2 över natten eller under förhållanden som är optimala för deras tillväxt.</li>
	</ol></li>
	<li>Plätering av suspensionsceller<ol><li>Justera celltätheten till 2,22 x 105 celler/ml i CO2-oberoende medium kompletterat med 10 % FBS och 1x Endurazin (1:100 utspädning av stamreagensen).</li>
		<li>Plåtceller i analysplattor med minst 3 brunnar per experiment- och kontrolltillstånd. För 96-brunnsformat dispensera 90 μL (20 000 celler) per brunn. För 384-brunnsformat dispensera 36 μL (8 000 celler) per brunn. OBS: För suspensionscellinjer som har låg signal till bakgrund (S: B) luminescens, t.ex. när man arbetar med CRISPR-pooler snarare än kloner, är det möjligt att öka luminescensen genom att öka antalet celler pläterade, upp till 100 000 celler / brunn i 96-brunnsformat, eller 40 000 celler / brunn i 384-brunnsformat.</li>
	</ol></li>
	<li>Kinetiska nedbrytningsanalyser med HiBiT CRISPR-celler som uttrycker LgBiT<ol><li>För suspensionsceller som redan innehåller Endurazin, vilket ingick i pläteringssteget i 2.2, fortsätt direkt till steg 2.3.3. För vidhäftande cellinjer bereda Nano-Glo Endurazine lösning. För 96-brunnsformat, förbered en 1x-lösning av Endurazin genom att späda ut stamreagens 1:100 i CO2-oberoende medium kompletterat med 10% FBS. För 384-brunnsformat, förbered en 2x lösning av Endurazin genom att späda stamreagens 1:50 till CO2-oberoende medium kompletterat med 10% FBS.</li>
		<li>Tillsätt endurazinlösning till varje brunn av vidhäftande celler. För 96-brunnsformat aspiratmedium och tillsätt 90 μl 1x Endurazinlösning. För 384-brunnsformat, tillsätt 18 μL 2x Endurazinlösning till 18 μL celler. Aspirera inte medium eftersom nedbrytningsanalysen utförs i en 50:50-blandning av odlingsmedium och CO2-oberoende medium i 384-brunnsformat.</li>
		<li>Inkubera suspension eller vidhäftande cellplattor innehållande Endurazin i 2,5 timmar i en inkubator vid 37 °C och 5 %CO2 för att möjliggöra jämvikt.</li>
		<li>Bered en 10x koncentration av test PROTAC-titrering i CO2-oberoende medium och tillsätt 10 μL till varje brunn med 96-brunnsplatta eller 4 μL för 384-brunnsplatta. För föreningar med okänd effekt rekommenderas en slutlig koncentration på 1-10 μM vid den högsta punkten som utgångspunkt.</li>
		<li>Samla kinetiska mätningar av luminiscens i luminometer förbalanserad till 37 °C under en period mellan 0 och 48 timmar. Tidsstegen för mätning kan anpassas för varje experiment, men ett rekommenderat initialt experiment skulle vara luminiscensmätningar var 5-15: e minut i 24 timmar eller önskad tid.</li>
	</ol></li>
	<li>Valfri cellviabilitet multiplexanalys med samma brunn efter slutlig kinetisk mätning OBS: Denna analys utförs med ett kommersiellt tillgängligt CellTiter-Glo (CTG) kit (se Materialförteckning).<ol><li>Balansera CTG-reagens till rumstemperatur.</li>
		<li>Efter nedbrytningsmätning vid den sista tidpunkten för den kinetiska analysen, tillsätt 100 μl (96-brunnsplatta) eller 40 μl (384-brunnsplatta) av reagenset per brunn på plattan och blanda på en plattskakare vid 500-700 rpm (96-brunnsplatta) eller en mikroplattvirvelblandare (384-brunnsplatta) i 5 minuter.</li>
		<li>Inkubera plattan vid rumstemperatur i 30 minuter för att möjliggöra celllys och släckning av HiBiT-signal.</li>
		<li>Mät total luminescens på en luminometer genom att följa tillverkarens rekommendation.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantifiering av kinetiska nedbrytningsprofiler<ol><li>Med hjälp av de insamlade kinetiska luminiscensmätningarna normaliserar du de råa RLU:erna för varje PROTAC-koncentration till det replikatgenomsnittliga DMSO-tillståndet vid varje tidpunkt för att ta hänsyn till förändringar i koncentrationen av fritt furimazin över tid. Beräkna fraktionerad RLU med ekvation 1. Ekvation 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Från nedbrytningskurvorna anpassar du en enkomponent exponentiell sönderfallsmodell med ekvation 2 till den ursprungliga nedbrytningsdelen av varje kurva till den punkt där data når en platå. OBS: Det kan vara bra att utesluta de första datapunkterna från passformen eftersom det kan finnas en kort fördröjning innan nedbrytning observeras. Ekvation 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>Från ekvation 2 bestämmer du parametern ƛ, som representerar nedbrytningshastighetskonstanten och platån, som representerar den lägsta mängden protein som återstår.</li>
		<li>Beräkna Dmax, vilket är den maximala fraktionerade mängden nedbrutet protein och beräknas som 1-platå.</li>
		<li>Plotta Dmax för varje koncentration av PROTAC för att bestämma en tidsoberoende nedbrytningsstyrkakurva.</li>
		<li>Bestäm Dmax50-värdet för diagrammet i 2.3.5 för att analysera effekten av föreningar. OBS: För att bestämma en DC50 vid en viss tidpunkt, plotta den beräknade procentuella nedbrytningen för varje koncentration vid den valda tiden. Detta kan specificeras som DC 50 t = 4 h ellerDC 50 t = 12 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

Promega Corporation är den kommersiella ägaren genom tilldelning av patent på HiBiT- och NanoLuc-teknologier och applikationer.

Vi presenterar här två metoder för screening av nedbrytningsföreningsaktivitet i antingen slutpunktslytiskt format eller levande cellkinetiskt läge. Dessa tillvägagångssätt bygger på samma självlysande mätprinciper men ger ändå olika nivåer av detaljer och förståelse. Valet av endera metoden kommer sannolikt att bero på screeningmål och storleken på det sammansatta biblioteket. För stora sammansatta screeningdäck eller primära skärmar för att observera någon detekterbar nedbrytning, erbjuder slutpunktslytisk screening känslig och effektiv kompatibilitet med hög genomströmning där andra slutpunktsmetoder, såsom western blot eller masspektrometri, kan vara antingen opraktiska eller svåra att anpassa14. En utgångspunkt för dessa skärmar kan utföras med ett begränsat antal koncentrationer och tidpunkter. Rekommenderade initiala koncentrationer att testa ligger i intervallet 100 nM-10 μM, för att ta hänsyn till initiala nedbrytare med låg styrka, dålig permeabilitet eller i vissa fall med mycket potenta föreningar, närvaron av en krokeffekt. Det rekommenderas vidare att minst två olika tidpunkter testas för att fastställa tidig nedbrytning vid 4-6 timmar och latent eller ihållande nedbrytning vid 18-24 timmar. Föreningar som uppvisar hög nedbrytningsstyrka och on-target-mekanism observeras lätt inom en tidsram på 4-6 timmar, medan nedbrytning eller uppenbar proteinförlust som observeras endast vid senare tidpunkter kan bero på en mängd olika mekanismer. Det rekommenderas starkt att övervaka cellviabiliteten vid både tidiga och sena tidpunkter, så att proteinförlust kan frikopplas från förlust på grund av celldöd. I likhet med alla typer av självlysande eller fluorescerande analyser finns det en potential för föreningar i bibliotek att störa eller hämma signal, därför kommer ortogonala uppföljningsexperiment med blyföreningar med hjälp av orelaterade fusioner eller alternativa metoder för att övervaka proteinnivån att vara viktiga för att bedöma att förlust av RLU i dessa analyser är direkt associerad med målproteinnedbrytning.
Möjligheten att screena i levande cellkinetiskt format under längre tidsperioder är starkt beroende av analyssignalen till bakgrunden (S: B). Faktorer som bidrar till S: B inkluderar uttrycksnivån för själva målproteinet, som kan sträcka sig över flera storleksordningar, effektiviteten av LgBiT-uttrycket i cellinjen som valts för peptidinsättning, och tillgängligheten av det taggade målet för komplettering i dess olika inbyggda komplex. Vi har fastställt ett allmänt cutoff-krav bestående av en S:B på 15 för att framgångsrikt mäta nedbrytning i kinetiskt läge med antingen Endurazin eller Vivazine. S:B bestäms genom att mäta baslinjesignalen för de HiBiT-redigerade cellerna som samuttrycker LgBiT i förhållande till oredigerade föräldraceller som uttrycker LgBiT ensamt i närvaro av antingen Endurazin eller Vivazine levande cellsubstrat. Vivazin kommer att producera en högre självlysande signal men kommer att förfalla snabbare än Endurazine och kan begränsa signalinhämtningen till 24 timmar eller mindre. Dessutom kan S:B också vara mycket beroende av om CRISPR-pooler eller kloner används. För mål i cellinjer som är mer mottagliga och har hög effektivitet för CRISPR/Cas9-teknik kan en heterogen CRISPR-poolpopulation av redigerade celler ha tillräckligt med S:B för kinetisk analys. För mål i svårare cellinjer där mindre effektiv genomisk integration via CRISPR resulterar i pooler med lågt S:B kan det vara nödvändigt att isolera CRISPR-kloner för att berika redigerade populationer och uppnå ett tillräckligt högt S:B för kinetisk analys. För något av dessa scenarier, om S:B är mindre än 15 med antingen Endurazin- eller Vivazine-substrat, rekommenderas slutpunktslytisk screening.
För bättre förståelse och karakterisering av föreningar, inklusive bestämning av en nedbrytningsprofil med kvantitativa parametrar, är kinetisk analys i realtid i levande celler den rekommenderade screeningmetoden14,18. Liksom slutpunktsanalys som diskuterats ovan kan initial kinetisk screening göras med ett begränsat antal koncentrationer i intervallet 100nM-10μM på sätt med hög genomströmning. I 384-brunnsformat kan över 100 föreningar lätt screenas i tre exemplar i en koncentration på en enda platta. De resulterande nedbrytningsprofilerna kommer att ge vägledning inte bara om omfattningen av den nedbrytning som observerats, utan också nedbrytningshastigheten, nedbrytningens varaktighet och potentiell återvinning av proteinet14,18 (figur 2 och figur 3). Nedbrytningsprofilens former ger också värdefull information. Specifika och potenta nedbrytare visar ofta en initial snabb förlust av målproteinet till en platå på några timmar18,53, medan andra mekanismer såsom transkriptionell återkoppling eller sammansatt toxicitet vanligtvis resulterar i mer linjär förlust av proteinet över tid. Dessa detaljer och nyanser missas med slutpunktslytisk analys, och med realtidsanalys under 24-48 timmar behöver man inte förutsäga tiden för att fånga den sanna Dmax inom uppsättningar av nya eller okända föreningar.
Kinetik i realtid möjliggör också effektiv dosresponsscreening för att bättre förstå föreningseffektivitet, hur föreningskoncentrationen påverkar initial nedbrytningshastighet och erbjuder möjligheter att rangordna föreningar baserat på mer än en parameter. Klassiska mätningar av nedbrytningsstyrka involverar DC50-beräkningar vid en specifik tidpunkt baserat på skenbar nedbrytningsmaxima. Däremot innehåller vårt kinetiska tillvägagångssätt för att utvärdera styrkan det sanna nedbrytningsmaximumet vid varje koncentration oavsett när det inträffar i tid18. Vi kallar denna mätning av kinetisk nedbrytningsstyrka, Dmax5018. Analys på detta sätt står för föreningar som kan initiera nedbrytning långsammare vid lägre koncentrationer och därför ta längre tid efter behandlingen för att nå deras Dmax. Det kan vara särskilt informativt att rangordna föreningar på både nedbrytningshastighet och Dmax. För de mest potenta nedbrytarna kommer detta att ytterligare skilja långsamma, men potenta nedbrytare från de som är både snabba och potenta. Tillsammans är både lytisk och levande cellkinetisk screening med HiBiT CRISPR-cellinjer kraftfulla tillvägagångssätt som ger en mer omfattande bild av riktad proteinnedbrytning, föreningsfunktion och möjliggör screeningprocessen från initial aktivitetsbedömning till nedströms kemisk optimering genom förbättring av viktiga nedbrytningsparametrar.

Riktad proteinnedbrytning har framstått som ett av de snabbast växande områdena inom upptäckt av småmolekylära läkemedel, vilket förstärks kraftigt av den terapeutiska framgången för immunmodulerande molekylära limföreningar (t.ex. IMiD) för cancerbehandling och lovande tidiga kliniska prövningsdata för proteolys riktad mot chimärföreningar 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Riktade proteinnedbrytningsföreningar fungerar genom att föra ett målprotein i närheten med E3-ligasmaskinproteiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Denna föreningsinducerade rekrytering av målproteinet till E3-ligasen leder till målproteinets ubiquitination och nedbrytning via ubiquitinproteasomal väg (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historiskt sett har screeningprogram för småmolekylära läkemedelsupptäckter förlitat sig på initiala biokemiska analyser för att bedöma aktivitet och rangordna orderföreningar. Detta har dock inneburit en betydande utmaning för riktade proteinnedbrytare vars slutliga aktivitet, nedbrytning via proteasomen, är beroende av en kaskad av cellulära händelser 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. De många vägarna och komplexiteten hos proteinkomplex som krävs för den framgångsrika målnedbrytningen kräver cellulära analysmetoder för tidig screening och triaging av initiala föreningar. För närvarande saknas det allvarligt tillgång till teknik för att övervaka målproteinnedbrytning på ett sätt med hög genomströmning i samband med den celluläramiljön14. Här kommer vi att presentera protokoll för bedömning av kinetisk levande cell eller slutpunktslytisk nedbrytningsaktivitet i realtid med hjälp av CRISPR / Cas9 endogent taggade HiBiT-målcellinjer 18,19,20 för att övervaka förlusten av målproteinet via självlysande mätning efter behandling med nedbrytarföreningar10,11,18,19.
För att uppnå framgångsrik nedbrytning av terapeutiska mål och för att expandera det läkemedelsbara proteomet har många tillvägagångssätt och typer av nedbrytare uppstått som kan rikta in sig på ett brett spektrum av proteiner för destruktion, inklusive de som är lokaliserade vid eller i plasmamembranet, lysosomer, mitokondriella membran, cytoplasma och kärnan21–57. De två primära klasserna av föreningar som studeras mest är molekylära lim och proteininriktade cimeras 2,4,5,6,7,12,26. Molekylära lim är monovalenta, alltså vanligtvis mindre i storlek, och underlättar ett nytt protein:proteininteraktionsgränssnitt med ett målprotein vid bindning till en E3-ligaskomponent 2,12,26. De är oftast nedbrytare som binder till Cereblon (CRBN) E3-ligaskomponenten 2,12,26,55,56,57. Nyligen har dock spännande nya exempel som använder andra E3-ligasmaskiner som DCAF1558,59,60 och CDK / Cyclin-rekrytering till DDB145 visar potentialen för expansion av denna klass av föreningar. Däremot är PROTACs större, bivalenta molekyler, bestående av en målbindande ligand, oftast en hämmare, bryggad via en kemisk länkare till ett E3-ligashandtag 1,3,4,5,7,13. Som sådan kan dessa föreningar direkt binda till både E3-ligasen och målproteinet 1,3,4,5,7,13. Många proteiner har visat sig brytas ned via dessa bivalenta molekyler, och de mest använda E3-ligashandtagen rekryterar antingen CRBN eller Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Antalet tillgängliga handtag för E3-ligasrekrytering i chimärer riktade mot proteolysdesign växer dock snabbt och utökar kapaciteten hos denna klass av föreningar med potential att bryta ner olika målklasser samt förbättra cell- eller vävnadstypspecificitet 24,48,61,62 . I kombination med det minimala kravet att engagera ett målprotein, även med marginell affinitet, håller nedbrytningsföreningar löfte om att expandera det läkemedelsbara proteomet.
Att karakterisera den cellulära dynamiken i proteinförlust, såväl som potentiell proteinåtervinning efter behandling, är avgörande för att förstå nedbrytningsföreningens funktion och effekt. Även om det är möjligt att studera endogena proteinnivåförändringar i relevanta cellulära system med western blot-antikroppsanalyser eller masspektrometri, är dessa metoder svåra att anpassa till screeningformat med hög genomströmning, har begränsad kvantifieringsförmåga eller förmåga att mäta kinetiska förändringar vid många tidpunkter14. För att ta itu med dessa utmaningar har vi utvecklat ett plattbaserat cellulärt självlysande system för övervakning av förändringar i endogena proteinnivåer, som använder genomisk insättning via CRISPR / Cas9 av 11-aminosyrataggen, HiBiT, till loci för alla viktiga nedbrytningsmål18,19,20. Denna peptid kompletterar med hög affinitet till sin bindande partner, LgBiT, för att producera ljus luminescens i närvaro av dess substrat 18,19,20,63, vilket gör dessa märkta endogena proteiner självlysande i celler eller lysater 18,19,20,63 . De relativa ljusenheterna (RLU) som mäts med ett luminometerinstrument är direkt proportionella mot de märkta målproteinnivåerna 18,19,20,63. Med utvecklingen av stabiliserade luciferassubstrat är kinetiska proteinnivåmätningar i realtid över 24-48 timmars tidsramar möjliga 18,53,64. Detta gör det möjligt att bestämma en fullständig nedbrytningsprofil för ett givet mål vid en given koncentration av föreningar, inklusive kvantitativ analys av initial nedbrytningshastighet, maximal nedbrytning (Dmax) och återvinning efter sammansatt behandling18,53. Vid screening av stora bibliotek av nedbrytningsföreningar kan slutpunktsanalys emellertid också lätt utföras i 384-brunnsformat vid olika läkemedelskoncentrationer och bestämda tidpunkter.
Protokollen som presenteras i detta manuskript representerar cellulära screeningstrategier för riktade proteinnedbrytningsföreningar, tillämpliga för alla typer av nedbrytare. Användningen av HiBiT CRISPR-cellinjer tillsammans med dessa protokoll är dock inte begränsade till proteinnedbrytning, snarare är de allmänna verktyg för att övervaka alla endogena målproteinnivåer som kan moduleras efter behandling för att studera effekterna av föreningar eller till och med resistensmekanismer 20,65,66. En förutsättning för dessa självlysande baserade detektionsmetoder är en CRISPR-endogent taggad HiBiT-målcellinje, vilket är kritiskt eftersom det möjliggör känslig självlysande detektion, samtidigt som det bibehåller endogent måluttryck och inbyggd promotorreglering18,19,20. Betydande framsteg har gjorts när det gäller att använda CRISRP/Cas9 för införande av genomiska taggar, särskilt i skalbarhet 20 och med den höga känsligheten för detektion, i olika format inklusive CRISPR-pooler eller kloner med antingen heterozygota eller homozygota alleliska infogningar18,19,20. Användning av exogent uttryck av HiBiT eller andra reporterfusioner i celler i stället för endogen märkning är möjlig, men betydande försiktighet bör iakttas med system med proteinöveruttryck14,18. Dessa kan leda till artefakter för att förstå sann sammansatt styrka och proteinåtervinningsdynamik14,18, inklusive potentiella transkriptionella återkopplingsslingor aktiverade efter målnedbrytning. Dessutom kan föreningar i tidigt skede med låg styrka missas och presentera sig som falska negativa vid screening. Eftersom proteinförlust kan bero på föreningsinducerad toxicitet och celldöd, innehåller protokollen som beskrivs här starkt rekommenderade, men valfria cellviabilitet självlysande eller fluorescerande analyser i kombination med nedbrytningsprotokollet. Det finns två huvudavsnitt i protokollet, lytisk slutpunkt och levande cellkinetisk screening. Inom vart och ett av dessa avsnitt ingår alternativ för multiplexerade cellviabilitetsmätningar i slutpunkts- eller kinetiska format. Övervakning av förändringarna av det taggade endogena proteinet kräver komplementering med LgBiT i celler. Därför hänvisar avsnittet om kinetisk screening till viktiga protokoll för införandet av detta, vilket kan uppnås via övergående eller stabilt uttryck och är viktigt för att utföra de levande cellens självlysande mätningar. Alla tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör snabb rangordning och aktivitetsbedömning av föreningar, vilket möjliggör tidiga screeninginsatser för föreningar och snabbare identifiering av blynedbrytare.
Detta protokoll är utformat för studier av nedbrytningsföreningar i samband med en HiBiT CRISPR-cellinje. Protokoll för generering av HiBiT CRISPR-infogningar för många mål har beskrivits i flera nyligen publiceradepublikationer 18,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

Riktade proteinnedbrytningsföreningar, inklusive molekylära lim eller proteolys riktade mot chimärer, är en spännande ny terapeutisk modalitet vid upptäckt av småmolekylära läkemedel. Denna klass av föreningar inducerar proteinnedbrytning genom att föra i närheten av målproteinet och E3-ligasmaskinproteinerna som krävs för att ubiquitinera och slutligen bryta ner målproteinet genom den ubiquitin-proteasomala vägen (UPP). Profilering av målproteinnedbrytning på ett sätt med hög genomströmning är dock fortfarande mycket utmanande med tanke på komplexiteten i cellulära vägar som krävs för att uppnå nedbrytning. Här presenterar vi ett protokoll och en screeningstrategi baserad på användningen av CRISPR/Cas9 endogen märkning av målproteiner med 11 aminosyran HiBiT-taggen som kompletterar med hög affinitet till LgBiT-proteinet, för att producera ett självlysande protein. Dessa CRISPR-riktade cellinjer med endogena taggar kan användas för att mäta sammansatt inducerad nedbrytning i antingen realtid, kinetisk levande cell eller slutpunktslytiska lägen genom att övervaka självlysande signal med hjälp av en självlysande plattbaserad läsare. Här beskriver vi de rekommenderade screeningprotokollen för de olika formaten och beskriver också beräkningen av viktiga nedbrytningsparametrar för hastighet, Dmax, DC 50, Dmax50, samt multiplexering med cellviabilitetsanalyser. Dessa tillvägagångssätt möjliggör snabb upptäckt och triagering av föreningar i tidigt stadium samtidigt som endogent uttryck och reglering av målproteiner i relevanta cellulära bakgrunder bibehålls, vilket möjliggör effektiv optimering av blyterapeutiska föreningar.

För att demonstrera en enda koncentrations slutpunkt lytisk nedbrytningsanalys, flera CDK målproteiner; CDK2, CDK4, CDK7 och CDK10 märktes endogent med HiBiT vid deras C-ändpunkt i HEK293-celler och behandlades med en 1 μM-koncentration av pankinaset Cereblon-baserade PROTAC, TL12-18654 (Figur 1A). Nivån av CDK-protein mättes vid olika tidpunkter och den fraktionerade RLU i förhållande till DMSO-kontrollen bestämdes (figur 1A). Varje CDK-protein visade olika grader av nedbrytning som svar på den sammansatta behandlingen och de olika tidpunkterna (figur 1A). För att förstå hur CDK-proteiner jämförde sig med varandra direkt i termer av proteinförlust beräknades de fraktionerade RLU: erna i figur 1A som total % nedbrytning och plottades för varje tidpunkt i figur 1B. Detta visar att även vid tidiga tidpunkter, 2 eller 4 timmar, visar några av CDK-familjemedlemmarna höga nedbrytningsnivåer som fortsätter att trenda uppåt över tiden (figur 1B).
För att demonstrera kinetisk nedbrytningsanalys, var och en av BET-familjemedlemsproteinerna; BRD2, BRD3 och BRD4 märktes endogent med HiBiT vid deras N-ändstation i HEK293-celler som stabilt uttrycker LgBiT-proteinet18. Dessa behandlades sedan med tre olika koncentrationer av pan-BET PROTACs; den Cereblonbaserade dBET650 (figur 2A) och den VHL-baserade ARV-77141 (figur 2B). Kinetiska mätningar samlades in under en 24-timmarsperiod, och från profilerna vid varje koncentration är skillnaderna i BET-familjemedlemmens svar lätt uppenbara. Förmågan hos BRD2 att initiera ett snabbare återhämtningssvar efter nedbrytningsföreningsbehandling (figur 2A,B) har tidigare observerats med andra pan-BET PROTACs och beror sannolikt på ett transkriptionellt återkopplingssvar som är konkurrenskraftigt för nedbrytningsprocessen18.
Både slutpunkts- och kinetisk analys kan göras med behandlingar med fullständig sammansatt dosrespons. I figur 3 visas nedbrytningsprofiler för kinetisk dosrespons för behandling av Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat-celler som stabilt uttrycker LgBiT-protein med fyra olika molekylära limföreningar 2,26,55,57; lenalidomid (figur 3A), iberdomid (CC-220) (figur 3B), talidomid (figur 3C) och pomalidomid (figur 3D). Dessa nedbrytare uppvisar signifikanta skillnader i nedbrytningsrespons mellan föreningarna och mellan koncentrationsserierna (figur 3).
För att kvantitativt bedöma nedbrytningen och rangordna föreningarna i figur 3 användes dosresponsprofilerna för att beräkna viktiga nedbrytningsparametrar inklusive nedbrytningshastigheten (figur 4A), Dmax (figur 4B) och Dmax50-värden (figur 4B). Dessa analyser visar att iberdomid (CC-220) och pomalidomid har mycket liknande snabba initiala nedbrytningshastigheter (figur 4A), men iberdomid (CC-220) har den högsta styrkan som tidigare har setts i ortogonala studier55,57 (figur 4B). Eftersom Iberdomid uppvisar så hög styrka, och alla testade koncentrationer visar större än 50% nedbrytning, representerar Dmax50-värdet som erhållits för Iberdomid en uppskattning baserad på begränsningen i exakt anpassning av data. Från diagrammen i figur 3C,D och figur 4B bryter varken lenalidomid eller talidomid ned Ikaros/IKZF1-målet till slutförande vid de högsta testade koncentrationerna. På grund av mycket liten nedbrytning observerad med talidomid kunde nedbrytningsspåren inte exakt anpassas till en exponentiell sönderfallsmodell, därför kvantifierades inte nedbrytningshastigheten för denna behandling. För den mest potenta nedbrytaren, iberdomid (CC-220)55,57 (figur 4B). Multiplexanalyser av cellviabilitet visade ingen förlust av cellviabilitet för de testade koncentrationerna (figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Figur 1: nedbrytning av CDK-endpoint och toxicitet med pankinas PROTAC, TL12-18654. (A) Välj panel av endogena CDK-målproteiner som smälts samman med HiBiT på C-terminalen via CRISPR/Cas9 och bedöms för nedbrytning med 1 μM TL12-186 PROTAC 54 vid 2 timmar, 4 timmar, 8 timmar och24 timmars behandling. Värden representeras som fraktionerad RLU i förhållande till en DMSO-kontroll som mäts vid varje tidpunkt. Felstaplar representerar SD för medelvärdet av 3 tekniska replikat. (B) Procentuell nedbrytning av panelen av CDK-målproteiner beräknad utifrån (A) som representerar mängden nedbrytning av varje familjemedlem som observerats vid 2, 4, 8 och 24 timmars tidpunkter. Felstaplar representerar SD för medelvärdet av 3 tekniska replikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Figur 2: Profilering av kinetisk nedbrytningsselektivitet hos BET-familjemedlemmar med BET-nedbrytare, dBET650 och ARV-77141. Kinetiska nedbrytningsprofiler av endogena BET-familjemedlemmar, BRD2, BRD3 och BRD4, märkta med HiBiT på N-terminalen via CRISPR/Cas9 med behandling av enstaka koncentrationer av 1 nM (vänster), 10 nM (mitten) eller 100 nM (höger) dBET650 (A) eller ARV-77141 (B) PROTAC. Värdena representeras som fraktionerad RLU beräknad från en DMSO-kontroll vid varje kinetisk tidpunkt. Felstaplar representerar SD för medelvärdet av 4 tekniska replikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Figur 3: Reaktionsprofiler för aktiv cellkinetisk nedbrytningsdos för Ikaros/IKZF1-HiBiT med en molekylär limpanel 2,26,55,57. Jurkat-celler som stabilt uttrycker LgBiT-proteinet konstruerades med CRISPR / Cas9 för att märka C-änden av Ikaros / IKZF1 med HiBiT-peptiden. Cellerna behandlades med en 8-punkts dosresponskoncentrationsserie inklusive DMSO för fyra olika molekylära limföreningar 2,26,55,57: (A) lenalidomid, (B) iberdomid (CC-220), (C) talidomid eller (D) pomalidomid. Luminiscens mättes var 5:e minut i totalt 19,5 timmar. Data från relativ ljusenhet (RLU) från (A-D) konverterades till fraktionerad RLU enligt beskrivningen i steg 2.4.1 och graferades som en funktion av tiden. Felstaplar representerar SD för 3 tekniska repliker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Figur 4: Beräkning av nedbrytningshastighet och Dmax50 för Ikaros/IKZF1-HiBit och multiplexering av cellhälsoanalyser. Kinetiska nedbrytningsdata från figur 3 användes för att beräkna kvantitativa nedbrytningsparametrar. (A) Nedbrytningshastigheter och (B) maximala värden för nedbrytning (Dmax) registreras vid varje läkemedelskoncentration för de angivna molekylära limföreningarna 2,26,55,57. (B) Dmax50-värden för varje förening beräknades med hjälp av en dos-responsmodell med begränsad Hill-lutning på 1, som kan användas för att rangordna nedbrytningsföreningar för ett mål. (C) Cellviabilitetsanalyser med iberdomid (CC-220)55,57 nedbrytningsdosrespons från figur 3B utfördes som en slutpunktsmätning efter slutförandet av mätningarna av kinetisk nedbrytning. Felstaplar representerar SD för 3 tekniska repliker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Detta protokoll beskriver den kvantitativa självlysande detektionen av proteinnedbrytningskinetik i levande celler som har konstruerats med CRISPR / Cas9 för att uttrycka antikroppsfri endogen proteindetekteringstagg smält till ett målprotein. Detaljerade instruktioner för beräkning och erhållande av kvantitativa nedbrytningsparametrar, hastighet, Dmax, DC 50 och Dmax50 ingår.

Cellulär profilering med hög genomströmning av riktade proteinnedbrytningsföreningar med HiBiT CRISPR-cellinjer

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

En metod av riktad cellisolering via Glas ytfunktionalisering

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Med Dot-analys att analysera Migration av Cell ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radio känslighet av cancer stamceller i Lung cancer cellinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering och karakterisering av små tarm neuroendokrina tumör spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analys av sidopopulation i solida tumör cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Funktionell bedömning av BRCA1-varianter med CRISPR-medierade basredigerare

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

In vitro-analys med hög genomströmning med patient-härledda tumörorganoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profileringskänslighet mot riktade terapier i EGFR-mutanta NSCLC patientbaserade organoider

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Utforska mitokondriell energimetabolism av enstaka 3D-mikrotissue-sfäroider med hjälp av extracellulär flödesanalys

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitokondriell cybridgenerering med hjälp av cancercellinjer

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...