Name: identification of egfr and ras inhibitors using caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-10-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans at JoVE.com

אנו מודים לד"ר סוואטי ארור (MD אנדרסון מרכז הסרטן) על מתן let-60(n1046). אנו מודים גם לד"ר דיוויד ריינר (המכון למדעי הבריאות בטקסס A&M ביו-מדע וטכנולוגיה ביוסטון) על זן הלין-1. לבסוף, אנו מודים לד"ר דניאל גארסין ולמעבדה שלה (אוניברסיטת טקסס, בית הספר לרפואה מקגוורן) על שסיפקו חלק מהריגנטים. כמה זני תולעת סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). מחקר זה נתמך על ידי המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT) מענק RP200047 JF הנקוק.

1. הכנת צלחת בינונית לצמיחה נמטודה (NGM)
<ol><li>הוסף 2.5 גרם של פפטון ו 3 גרם של NaCl ל 970 מ"ל של מים deionized הכלולים בקבוק 2 L ארלנמייר. מערבבים את התכולה באמצעות מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן, להוסיף 20 גרם של אגר לבקבוקון. יש לקלף אוטומטית את תכולת הבקבוקון ב-121 °C (70 °F) ולחץ של 15ליברות/ב-2 למשך 30 דקות. לאחר...

<ol>
	<li>Marshall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+Ras+and+Raf:+key+regulatory+proteins+in+cellular+transformation.">Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).</li><li>Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+the+Ras-ERK/MAPK+signaling+pathway.">Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).</li><li>Grandis, J. R., Tweardy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+transforming+growth+factor+alpha+and+epidermal+growth+factor+receptor+messenger+RNA+are+early+markers+of+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).</li><li>Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+molecular+pathobiology+in+oral+cancer:+a+review.">Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review.</a> International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).</li><li>Stransky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutational+landscape+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).</li><li>Bos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ras+oncogenes+in+human+cancer:+a+review.">ras oncogenes in human cancer: a review.</a> Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).</li><li>Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RAS+signalling+pathways+in+cancer+therapy.">Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+survey+of+Ras+mutations+in+cancer.">A comprehensive survey of Ras mutations in cancer.</a> Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).</li><li>Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+proteins:+different+signals+from+different+locations.">Ras proteins: different signals from different locations.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).</li><li>Hancock, J. F., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+plasma+membrane+signalling+platforms.">Ras plasma membrane signalling platforms.</a> Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).</li><li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fendiline+inhibits+K-Ras+plasma+membrane+localization+and+blocks+K-Ras+signal+transmission.">Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).</li><li>Moghal, N., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+system+in+Caenorhabditis+elegans.">The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).</li><li>Sundaram, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTK/Ras/MAPK+signaling.">RTK/Ras/MAPK signaling.</a> WormBook. , 1-19 (2006).</li><li>Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+22+genes+that+affect+the+vulval+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).</li><li>Katz, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+in+the+extracellular+domain+activates+LET-23,+the+Caenorhabditis+elegans+epidermal+growth+factor+receptor+homolog.">A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).</li><li>Hara, M., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+farnesyltransferase+inhibitors+suppress+the+phenotype+resulting+from+an+activated+ras+mutation+in+Caenorhabditis+elegans.">Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).</li><li>Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Caenorhabditis+elegans+to+evaluate+inhibitors+of+Ras+function+in+vivo.">Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo.</a> Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).</li><li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelin+Metabolism+Is+a+Regulator+of+K-Ras+Function.">Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function.</a> Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).</li><li>Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+lin-1+encodes+an+ETS-domain+protein+and+defines+a+branch+of+the+vulval+induction+pathway.">The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway.</a> Genes &amp; Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+mitochondria+and+diet+mediates+pathogen+and+stress+resistance+in+Caenorhabditis+elegans.">Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).</li><li>Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+human+microbiome+drug+metabolism+by+gut+bacteria+and+their+genes.">Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes.</a> Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).</li><li>Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+EGF+receptor-mediated+vulva+development+by+the+heterotrimeric+G-protein+G-alpha+q+and+excitable+cells+in+C.+elegans.">Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans.</a> Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).</li></ol>

ההסתה שאנו מתארים באמצעות התולעת היא פשוטה וזולה לזיהוי מעכבים של פונקציית EGFR ו- RAS. C. elegans הוא מודל אטרקטיבי לגילוי סמים כי זה קל לגדול במעבדה בשל מחזור החיים הקצר (3 ימים ב 20 °C (20 °C) ואת היכולת לייצר מספר גדול של זחלים. חשוב מכך, מסלול EGFR-RAS-ERK MAPK נשמר מבחינה אבולוציונית ותפקודית עם יונקים...

המסלולים התאיים המסדירים אירועים התפתחותיים בתוך אורגניזמים נשמרים מאוד בקרב כל metazoans. מסלול אחד כזה הוא EGFR-RAS-ERK מיטוגן מופעל חלבון קינאז (MAPK) איתות מפל שהוא מסלול קריטי השולט התפשטות תאים, בידול, הגירה והישרדות1,2. פגמים במסלול איתות זה יכולים להוביל מצבים פתולוגיים או מחלות כגון סרטן. קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR) הראה שהוא בא לידי ביטוי רב בגידולים אנושיים, כולל 50% של קרצינומות תאיקשקשאוראליים, ותורם להתפתחות גידולים ממאירים 3,4,5. בעוד מוטציות בשלושת איזופורמים RAS H-, K- ו- N-RAS הם מניעים עיקריים לשינוי ממאיר בסרטן אנושי מרובה. בין אלה שלושה isoforms RAS, מוטציות oncogenic ב K-RAS הם הנפוצים ביותר6,7,8. כדי ש-EGFR ו-RAS יפעלו, הם חייבים להתאים את קרום הפלזמה (PM). מניעת לוקליזציה של מולקולות אלה לראש הממשלה יכולה לעצור לחלוטין את הפעילות הביולוגית של מסלול איתות זה9,10. מכאן עיכוב של לוקליזציה של חלבונים אלה לראש הממשלה היא אסטרטגיה טיפולית כדי לחסום את איתות במורד הזרם ואת התוצאות השליליות וכתוצאה מכך. באמצעות בדיקת סינון בעלת תוכן גבוה, פנדלין, חוסם תעלות סידן מסוג L, זוהה כמעכב של פעילות K-RAS11. ננו-הכללה של K-RAS לעלון הפנימי של ראש הממשלה מצטמצמת באופן משמעותי בנוכחות פנדילין. יתר על כן, K-RAS מופץ מחדש מקרום הפלזמה לרטיקולום אנדופלסמי (ER), מנגנון גולגי, אנדוזומים וציטוסול. חשוב מכך, התפשטות של קווי תאים סרטניים בלבלב, המעי הגס, הריאות וארירית הרחם המבטאות מוטציה אונקוגנית K-RAS נחסמת על ידי עיכוב של איתות במורד הזרם על ידי פנדלין11. נתונים אלה מציעים פנדלין פונקציות כמו טיפול נגד K-RAS ספציפי שגורם לוקליזציה שגויה של חלבון RAS לראש הממשלה.
אלגנס מנמודה Caenorhabditis נחקר בהרחבה בהקשר של התפתחות. רבים מנתולי האות השולטים בהתפתחות התולעת הם אבולוציוניים ושמורבים מבחינה תפקודית. לדוגמה, ההפעלה המתווכת של EGFR של RAS וההפעלה הבאה של מפל האות ERK MAPK נשמרים בתולעת12. המפל מיוצג על ידי החלבונים הבאים: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 הוא הומולוגי ל RAS, בעוד LET-23 הוא הומולוגי EGFR. בתולעת, מסלול זה מסדיר את התפתחות הפות13. הפות הוא צמצם אפיתל על דופן הגוף הגחון של התולעת המאפשרת להניח ביצים מופרות. היווצרות הפות בתולעת תלויה בחשיפה של תאי המבשר הפותיים (VPC) למעבר צבע של הפעלת מפל האות EGFR-RAS-MAPK. במהלך ההתפתחות הרגילה, VPCs הפרוקסימלי לקבל אותות חזקים מתאי עוגן gonadal להבדיל לתוך 1° ו 2° גורל תאים אשר מעוררים פותפונקציונלית 12. בעוד ש-VPCs דיסטליים מבדילים לגורלי תאים של 3° שמתמזגים לסנכרון ההיפודרמלי ואינם יוצרים פות עקב איתות מדולדל. בהיעדר איתות, כל ה-VPCs מבדילים לגורל תאים של 3° וכתוצאה מכך נוצרים פות. עם זאת, איתות מהווה גורם מוביל להיווצרות פות אחת או יותר שאינה פונקציונלית בשל האינדוקציה של כל ה-VPN להניח גורל תא של 1° ו-2°.
מוטציות הגורמות אינדוקציה פות פגומה או מוגזמת זוהו עבור רבים מהגנים המקודדים חלבונים המייצגים מסלול זה. אינדוקציה פות פגומה גורמת פנוטיפ vulvaless (Vul), בעוד אינדוקציה פות מוגזמת תוצאות פנוטיפ multivulva (Muv) המיוצג על ידי התפתחות של פסאודוטובה חוץ רחמית לא מתפקדת רבים לאורך דופן הגוף הגחון. ה פנוטיפ Muv לידי ביטוי על ידי זן let-60(n1046) נובע רווח של מוטציה פונקציה ב RAS, בעוד בזן let-23(sa62) זה נובע מוטציה מפעילה EGFR14,15. פנוטיפ Muv חזק בזנים מוטנטיים אלה הוכח להיות מוטרד על ידי התערבויות פרמקולוגיות כפי שהוכח על ידי הטיפול של let-60(n1046) תולעים עם מעכב MEK-1 U012616,17. מעניין, הראינו כי R-פנדלין ומעכבים המשפיעים על חילוף החומרים של sphingomyelin לדכא את פנוטיפ Muv בתולעת18. כדי להדגים מעכבים אלה לחסום let-60 איתות ברמה של RAS, זן האפס lin-1 כבר מנוצל17. Lin-1 הוא גורם שעתוק מעכב דמוי Ets המתפקד כמדכא בהתפתחות הפות19. חזרה חזקה של פנוטיפ Muv בתולעים let-60(n1046) ואין השפעה על תולעים ריקות lin-1 מציע כי עכבות אלה מתרחשים ברמה של RAS.
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש ב- C. elegans כמודל לזיהוי מעכבים של חלבוני RAS ו- EGFR. באמצעות מצודה מבוססת נוזלים, אנו מדגימים את ההשפעות המעכבות של R-fendiline על ידי דיכוי פנוטיפים Muv ב let-60(n1046) ו let-23(sa62) זנים מוטנטיים של C. elegans. הבדיקה הזו מאמתת את השימוש ב- C. elegans ככלי בשלב הראשוני של גילוי תרופות לטיפולים נגד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media and chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Agar&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium pPhosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Fendiline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.25% Sodium Hypochlorite&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UO126 (MEK inhibitor)</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>19-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12- Well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-197-4804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td>Genotype</td>
			<td>Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT2124 &#160;</td>
			<td>let-60(n1046) IV.</td>
			<td></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT7567</td>
			<td>lin-1(sy254) IV.</td>
			<td></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS1839</td>
			<td>let-23(sa62) II.</td>
			<td></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of egfr and ras inhibitors using caenorhabditis elegans

השינויים לוקליזציה קרום פלזמה של קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) ואת המחולל במורד הזרם שלה RAS היו מעורבים במספר מחלות כולל סרטן. הנמטודה C. elegans החיים החופשיים מחזיקה מפל אות EGFR-RAS-ERK MAP אבולוציוני ומשומר מבחינה תפקודית, שהוא מרכזי להתפתחות הפות. רווח של מוטציות פונקציה בהומולוגיה RAS LET-60 ו EGFR הומולוג LET-23 לגרום לדור של פסאודובולבה חוץ רחמית לא מתפקדת גלויה לאורך דופן הגוף הגחון של תולעים אלה. בעבר, פנוטיפ multivulval (Muv) בתולעים אלה הוכח להיות מעוכב על ידי מולקולות כימיות קטנות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בתולעת ב- assay מבוסס נוזל כדי לזהות מעכבים שמבטלים את הפעילות של חלבוני EGFR ו- RAS. באמצעות מטען זה, אנו מראים R-פנדלין, מעכב עקיף של K-RAS, מדכא את פנוטיפ Muv לידי ביטוי let-60(n1046) ו let-23(sa62) תולעים מוטנטיות. הבדיקה היא פשוטה, זולה, אינה גוזלת זמן להתקנה, וניתן להשתמש בה כפלטפורמה ראשונית לגילוי טיפולי נגד נגד.

אנו מדגימים תחילה כי R-פנדלין מסוגל לדכא את פנוטיפ Muv בזן המוטנטי let-60(n1046) בהשוואה לתולעים שטופלו ב- DMSO. הנתונים שלנו מראים כי R-fendiline הוא מסוגל לחסום את פנוטיפ Muv ב let-60(n1046) באופן תלוי מינון(איור 2A,B). עם זאת, אי היפוך של פנוטיפ Muv נצפתה בזן מוטציה null lin-1 בתגו...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

אלגנס נמטודה מתיחה גנטית Caenorhabditis יכול לשמש מודל פשוט וזול לגילוי תרופות. מתואר כאן פרוטוקול לזיהוי טיפולי נגדים המעכבים את האיתות במורד הזרם של חלבוני RAS ו- EGFR.

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

This protocol can be used in the initial phase of drug discovery to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. The main advantage of this assay is that inhibitory effects of anti-EGFR and anti-RAS therapeutics can be easily visualized in C.egelans. Begin by spotting 100 microliters of overnight grown E.coli OP50 onto the center of each NGM plate.Allow the plates to dry for 24 hours in a laminar hood, then store them in a polystyrene container. Using a sterile worm pick, gather 10 to 12 gravid adult worms from a previously grown plate and transfer them to a fresh NGM plate seeded with E.coli OP50. Incubate the plate for 24 hours at 20 degrees Celsius.After 24 hours, use a sterile worm pick to remove adult worms from the plates. Incubate the plates at 20 degrees Celsius for approximately three days to allow the embryos to develop into gravid adult worms. Collect gravid adult worms into a 15 milliliter conical tube by washing two to four plates with M9W.Pellet the worms by centrifuging the tube at 450 times G for one minute, then decant the supernatant without disturbing the worm pellet. Prepare worm lysis solution by combining 400 microliters of 8.25%sodium hypochlorite and 100 microliters of five normal sodium hydroxide. Add this solution to the worm pellet and flick the tube to mix.Observe the lysis of the worms under a dissecting microscope to prevent overbleaching of the embryos. When 70%of the adult worms have lysed, add 10 milliliters of M9W to the conical tube to dilute the lysis mix. Centrifuge the tube at 450 times G for one minute, then replace the supernatant with 10 milliliters of M9W.After completing the washing steps, add three to five milliliters of M9W to resuspend the egg pellet. Rotate the tube overnight at a speed of 18 RPM on a tube rotator at room temperature. After overnight incubation, remove the tube from the rotator and pellet the L1 larvae by centrifuging the tube at 450 times G for one minute.Aspirate the M9W until 250 microliters is left in the tube. Begin by spotting 100 microliters of overnight grown E.coli OP50 onto the center of each NGM plate. Allow the plates to dry for 24 hours in the laminar hood, then store them in a polystyrene container.Grow 30 milliliters of E.coli OP50 in a 50 milliliter conical tube at 37 degrees Celsius overnight in an orbital shaker at 150 RPM. On the next day, spin the E.coli OP50 culture at 4, 000 times G for 10 minutes to pellet the cells, then remove the supernatant and resuspend the pellet in three milliliters of M9W to concentrate the culture. Prior to preparing the working solutions for the drug assay, add 0.1 milliliter of cholesterol into 100 milliliters of M9W.Prepare working solutions of each experimental drug by diluting the drug and vehicle in 4.8 milliliters of M9W supplemented with cholesterol. Dissolve DMSO in 4.8 milliliters of M9W supplemented with cholesterol to prepare the vehicle control. Add 200 microliters of concentrated E.coli OP50 culture to each tube containing the vehicle control or drugs and vortex the tubes to mix.Add two milliliters of each working drug solution or vehicle control to each well in a 12 well tissue culture plate. Test each drug concentration and vehicle control in duplicate. Add approximately 100 L1 larvae per well using a sterile micropipette, limiting the volume to 10 microliters.Incubate the plates at 20 degrees Celsius. Supplement wells with 50 microliters of 10X concentrated E.coli OP50 on day three of the assay if needed. Prepare a 2%weight to volume solution of agarose by adding 0.1 gram of agarose to five milliliters of deionized water.Heat the agarose in a microwave to dissolve it. Place strips of lab tape along two glass slides, which will act as spacers limiting the thickness of the agarose pads. Then place a third clean glass slide between the taped slides.To make an agarose pad, spot 100 microliters of molten agarose onto the center of the clean slide. Place another clean glass slide across the top of the agarose and gently press down to form a pad. Remove the top slide when the pad has solidified.When the appropriate stage of the lifecycle is reached, remove the plates from the incubator and collect the worms in 15 milliliter conical tubes. Centrifuge the tubes at 450 times G for one minute, then remove the M9W without disturbing the worm pellet. Wash the worms twice with five milliliters of fresh M9W.After removing all remaining M9W, add 500 microliters of two millimolar sodium azide or two millimolar tetramisole hydrochloride to anesthetize the worms. Allow tubes to incubate at room temperature for 15 minutes. Add 10 microliters of the anesthetized worm suspension onto the center of an agarose pad and place a number 1.5 cover slip gently over the suspension.If needed, fix the cover slip with nail polish to prevent drying. Use a DIC microscope at 10 and 20 times magnifications to observe the let-60(n1046)let-23(sa62)and lin-1(sy254)strains. For let-60(n1046)and let-23(sa62)score the adult worms based on the presence or absence of the Muv phenotype.For the lin-1 strain, count the number of VPCs that adopted one or two degrees cell fades on the ventral side of the L4 larvae. This protocol was used to demonstrate that R-fendiline is able to suppress the Muv phenotype in let-60(n1046)mutant strain in a dose dependent manner. Non-reversal of the Muv phenotype was observed in the lin-1 no mutant strain in response to increasing concentrations of R-fendiline, suggesting that R-fendiline blocks activated let-60 signaling at the level of RAS and C.elegans.Similarly, the Muv phenotype was significantly reduced in the let-23(sa62)strain in response to three, 10, and 30 micromolar R-fendiline treatments in comparison to the DMSO treated worms. During the bleach treatment, it is important to observe the lysis of the worms. The long incubation in the bleach mix will lead to death of the embryos, resulting in lower yields of L1 larvae.The localization of let-23 can be determined in the presence of anti-EGFR inhibitors using transgenic worms expressing GFP fused to let-23. This allows an investigator to determine if the anti-EGFR inhibitors cause the mislocalization of let-23 to the plasma membrane.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

חתך בלוטות החלב שלמות מלא עבור זיהוי הנגע

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

יצירת עמידות כפול EGFR-TKI ו- TKI פגש ריאות אדנוקרצינומה תאי במבחנה עם הליך דו-שלבי המינון

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Identification of OTX1 and OTX2 As Two Possible Molecular Markers for Sinonasal Carcinomas and Olfactory Neuroblastomas

זיהוי של OTX1 ו- OTX2 כמו שני סמנים מולקולריים אפשריים עבור קרצינומה Sinonasal ואת חוש הריח נוירובלסטומה

OTX homeobox (HB) genes are expressed during embryonic morphogenesis and during the development of olfactory epithelium in adult organisms. Mutations ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

הערכה של התנגדות מעכבי טירוזין קינאז על ידי חקירה של האות התמרה חושית מסלולים על-ידי מערכים נוגדן

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...