Name: identification of egfr and ras inhibitors using caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-10-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi tackar Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) för att tillhandahålla let-60 (n1046). Vi tackar också Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology i Houston) för lin-1-stammen. Slutligen tackar vi Dr Danielle Garsin och hennes labb (University of Texas, McGovern Medical School) för att de tillhandahåller några av reagenserna. Vissa maskstammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Denna forskning stöddes av Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) anslag RP200047 till JF Hancock.

1. Nematod tillväxtmedel (NGM) platta förberedelse
<ol><li>Tillsätt 2,5 g pepton och 3 g NaCl till 970 ml avjoniserat vatten i en 2 L Erlenmeyerkolv. Rör om innehållet med hjälp av en magnetisk omrörningsstång. Tillsätt därefter 20 g agar till kolven. Autoklavera kolvens innehåll vid 121 °C och ett tryck på 15 lb/in2 i 30 min. Efter sterilisering, placera kolven på en omrörning och låt mediet svalna tills temperaturen når 50 °C.</li>
	<li>För att förbereda NGM-plattorna tillsätt följand...

<ol>
	<li>Marshall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+Ras+and+Raf:+key+regulatory+proteins+in+cellular+transformation.">Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).</li><li>Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+the+Ras-ERK/MAPK+signaling+pathway.">Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).</li><li>Grandis, J. R., Tweardy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+transforming+growth+factor+alpha+and+epidermal+growth+factor+receptor+messenger+RNA+are+early+markers+of+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).</li><li>Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+molecular+pathobiology+in+oral+cancer:+a+review.">Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review.</a> International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).</li><li>Stransky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutational+landscape+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).</li><li>Bos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ras+oncogenes+in+human+cancer:+a+review.">ras oncogenes in human cancer: a review.</a> Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).</li><li>Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RAS+signalling+pathways+in+cancer+therapy.">Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+survey+of+Ras+mutations+in+cancer.">A comprehensive survey of Ras mutations in cancer.</a> Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).</li><li>Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+proteins:+different+signals+from+different+locations.">Ras proteins: different signals from different locations.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).</li><li>Hancock, J. F., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+plasma+membrane+signalling+platforms.">Ras plasma membrane signalling platforms.</a> Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).</li><li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fendiline+inhibits+K-Ras+plasma+membrane+localization+and+blocks+K-Ras+signal+transmission.">Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).</li><li>Moghal, N., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+system+in+Caenorhabditis+elegans.">The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).</li><li>Sundaram, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTK/Ras/MAPK+signaling.">RTK/Ras/MAPK signaling.</a> WormBook. , 1-19 (2006).</li><li>Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+22+genes+that+affect+the+vulval+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).</li><li>Katz, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+in+the+extracellular+domain+activates+LET-23,+the+Caenorhabditis+elegans+epidermal+growth+factor+receptor+homolog.">A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).</li><li>Hara, M., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+farnesyltransferase+inhibitors+suppress+the+phenotype+resulting+from+an+activated+ras+mutation+in+Caenorhabditis+elegans.">Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).</li><li>Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Caenorhabditis+elegans+to+evaluate+inhibitors+of+Ras+function+in+vivo.">Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo.</a> Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).</li><li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelin+Metabolism+Is+a+Regulator+of+K-Ras+Function.">Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function.</a> Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).</li><li>Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+lin-1+encodes+an+ETS-domain+protein+and+defines+a+branch+of+the+vulval+induction+pathway.">The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway.</a> Genes &amp; Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+mitochondria+and+diet+mediates+pathogen+and+stress+resistance+in+Caenorhabditis+elegans.">Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).</li><li>Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+human+microbiome+drug+metabolism+by+gut+bacteria+and+their+genes.">Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes.</a> Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).</li><li>Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+EGF+receptor-mediated+vulva+development+by+the+heterotrimeric+G-protein+G-alpha+q+and+excitable+cells+in+C.+elegans.">Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans.</a> Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).</li></ol>

De analyser vi beskriver med masken är enkla och billiga för att identifiera hämmare av EGFR och RAS funktion. C. elegans är en attraktiv modell för läkemedelsupptäckt eftersom det är lätt att växa i labbet på grund av den korta livscykeln (3 dagar vid 20 °C) och förmågan att generera ett stort antal larver. Ännu viktigare är att EGFR-RAS-ERK MAPK-vägen är evolutionärt och funktionellt bevarad med däggdjur som tillhandahåller ett genetiskt tractable system för att analysera effekterna av EG...

De cellulära vägar som reglerar utvecklingshändelser inom organismer är mycket bevarade bland alla metazoaner. En sådan väg är EGFR-RAS-ERK mitogenaktiverade proteinkinaser (MAPK) som signalerar kaskad som är en kritisk väg som styr cellproliferation, differentiering, migration och överlevnad1,2. Defekter i denna signalväg kan leda till patologiska eller sjukdomsstater som cancer. Epidermal tillväxtfaktorreceptorn (EGFR) har visat sig vara mycket uttryckt i mänskliga tumörer, inklusive 50% av oral skivepitelcancer, och bidrar till utvecklingen av maligna tumörer3,4,5. Mutationer i de tre RAS-isoformerna H-, K- och N-RAS är viktiga drivkrafter för malign omvandling i flera mänskliga cancerformer. Bland dessa tre RAS-isoformer är onkogena mutationer i K-RAS vanligast6,7,8. För att EGFR och RAS ska fungera måste de lokaliseras till plasmamembranet (PM). Att förhindra lokalisering av dessa molekyler till statsministern kan helt upphäva den biologiska aktiviteten hos denna signalväg9,10. Därför är hämningen av lokaliseringen av dessa proteiner till statsministern en terapeutisk strategi för att blockera nedströmssignalering och de resulterande negativa resultaten. Med hjälp av en screeninganalys med högt innehåll identifierades fendiline, en kalciumkanalblockerare av L-typ, som en hämmare av K-RAS-aktivitet11. Nanoklustering av K-RAS till den inre broschyren av PM reduceras avsevärt i närvaro av fendiline. Dessutom omfördelas K-RAS från plasmamembranet till det endoplasmatiska retikulumet (ER), Golgiapparaturen, endosomerna och cytosolen. Ännu viktigare är att spridningen av bukspottskörteln, tjocktarmen, lungan och endometriecancer cellinjer som uttrycker oncogenic mutant K-RAS blockeras av hämning av nedströms signalering av fendiline11. Dessa data tyder fendiline funktioner som en specifik K-RAS anticancer terapeutiska som orsakar fellokalisering av RAS proteinet till PM.
Nematoden Caenorhabditis elegans har studerats utförligt i samband med utvecklingen. Många av de signalvägar som styr utvecklingen i masken är evolutionära och funktionellt bevarade. Till exempel bevaras EGFR-medierad aktivering av RAS och efterföljande aktivering av ERK MAPK-signalkaskaden imasken 12. Kaskaden representeras av följande proteiner: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 är homologt till RAS, medan LET-23 är homologt för EGFR. I masken reglerar denna väg utvecklingen av vulva13. Vulva är en epitelapertur på maskens ventrala kroppsvägg som gör att befruktade ägg kan läggas. Bildandet av vulva i masken är beroende av exponeringen av vulval prekursorceller (VPC) till en övertoning av aktiveringen av EGFR-RAS-MAPK signal kaskad. Under den normala utvecklingen får de proximala VPN:erna starka signaler från gonadalankarcellerna för att differentiera sig till 1° och 2° cell öden som ger upphov till en funktionell vulva12. Medan distala VPN skiljer sig åt i 3 ° cell öden som smälter till hypodermal syncytium och inte bildar vulva på grund av utarmad signalering. I avsaknad av signalering skiljer sig alla VPN-tjänster till 3° cell öden vilket resulterar i bildandet av ingen vulva. Konstituerande signalering leder dock till bildandet en eller flera icke-funktionella vulva på grund av induktion av alla VPN att anta 1 ° och 2 ° cell öden.
Mutationer som orsakar defekt eller överdriven vulval induktion har identifierats för många av de gener som kodar för proteiner som representerar denna väg. Defekt vulval induktion resulterar i en vulvaless (Vul) fenotyp, medan överdriven vulval induktion resulterar i en multivulva (Muv) fenotyp som representeras av utvecklingen av många nonfunctional ectopic pseudovulvae i hela ventrala kroppsväggen. Muv fenotyp uttryckt av let-60 (n1046) stammen beror på en vinst av funktion mutation i RAS, medan i let-23 (sa62) stam det beror på en aktiverande mutation i EGFR14,15. Den starka Muv fenotyp i dessa mutanta stammar har visat sig vara störd av farmakologiska interventioner som framgår av behandling av let-60 (n1046) maskar med MEK-1-hämmaren U012616,17. Intressant nog har vi visat att R-fendilin och hämmare som påverkar sphingomyelin metabolism undertrycka Muv fenotyp imasken 18. För att demonstrera dessa hämmare blockera let-60 signalering på ras nivå, lin-1 null stam har använts17. Lin-1 är en Ets-liknande hämmande transkriptionsfaktor som fungerar som en förträngare i utvecklingen av vulva19. Stark återgång av Muv fenotyp i let-60 (n1046) maskar och ingen effekt på lin-1 null maskar tyder på att dessa hämningar uppstår på ras nivå.
I detta protokoll demonstrerar vi användningen av C. elegans som modell för att identifiera hämmare av RAS- och EGFR-proteiner. Med hjälp av en vätskebaserad analys visar vi de hämmande effekterna av R-fendilin genom att undertrycka Muv fenotyper i let-60 (n1046) och let-23 (sa62) mutanta stammar av C. elegans. Denna analys validerar användningen av C. elegans som ett verktyg i den inledande fasen av läkemedelsupptäckt för cancerterapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media and chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Agar&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium pPhosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Fendiline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.25% Sodium Hypochlorite&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UO126 (MEK inhibitor)</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>19-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12- Well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-197-4804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td>Genotype</td>
			<td>Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT2124 &#160;</td>
			<td>let-60(n1046) IV.</td>
			<td></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT7567</td>
			<td>lin-1(sy254) IV.</td>
			<td></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS1839</td>
			<td>let-23(sa62) II.</td>
			<td></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of egfr and ras inhibitors using caenorhabditis elegans

Förändringarna i plasmamembranlokaliseringen av epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) och dess nedströms effektor RAS har varit inblandade i flera sjukdomar inklusive cancer. Den frilivade nematoden C. elegans har en evolutionär och funktionellt bevarad EGFR-RAS-ERK MAP-signalkaskad som är central för utvecklingen av vulva. Vinst av funktion mutationer i RAS homolog LET-60 och EGFR homolog LET-23 inducera generering av synliga nonfunctional ectopic pseudovulva längs ventrala kroppsväggen av dessa maskar. Tidigare har multivulval (Muv) fenotyp i dessa maskar visat sig hämmas av små kemiska molekyler. Här beskriver vi ett protokoll för att använda masken i en vätskebaserad analys för att identifiera hämmare som avskaffar verksamheten hos EGFR- och RAS-proteiner. Med hjälp av denna analys visar vi R-fendiline, en indirekt hämmare av K-RAS, undertrycker Muv fenotyp uttryckt i let-60 (n1046) och let-23 (sa62) mutantmaskar. Analysen är enkel, billig, är inte tidskrävande att ställa in, och kan användas som en första plattform för upptäckt av cancerterapier.

Vi visar först att R-fendiline kan undertrycka Muv fenotyp i let-60 (n1046) mutant stam jämfört med DMSO behandlade maskar. Våra data visar att R-fendilin kan blockera Muv fenotyp i let-60(n1046) på ett dosberoende sätt (Figur 2A, B). Icke-återföring av fenotypen Muv observerades dock i lin-1 null mutant stam som svar på ökande koncentrationer av R-fendiline (Figur 2B). Uppgifterna tyder på att R-fendiline b...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Den genetiskt kanterbara nematoden Caenorhabditis elegans kan användas som en enkel och billig modell för läkemedelsupptäckt. Beskrivs här är ett protokoll för att identifiera cancer therapeutics som hämmar nedströms signalering av RAS och EGFR proteiner.

Identifiering av EGFR- och RAS-hämmare med Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Sektion Mammary Gland Whole Mounts för Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identifiering och karakterisering av metastaserande faktorer av genöverföring i romanen RIP-taggen; RIP-tva murina modell

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Om dubbla motstånd mot EGFR-TKI och träffade-TKI i lunga adenokarcinom celler In Vitro med en 2-stegs-dosupptrappning procedur

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Identification of OTX1 and OTX2 As Two Possible Molecular Markers for Sinonasal Carcinomas and Olfactory Neuroblastomas

Identifiering av OTX1 och OTX2 som två möjliga molekylära markörer för Sinonasal carcinom och lukt Neuroblastomas

OTX homeobox (HB) genes are expressed during embryonic morphogenesis and during the development of olfactory epithelium in adult organisms. Mutations ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Bedömning av resistens mot tyrosinkinashämmare av ett förhör av cellsmedierade reaktioner av antikropp matriser

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifiering, histologiska karakteriseringen och dissektion av mus prostata lober för i Vitro 3D sfäroid kultur modeller

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekterna av Migrastatiska hämmare på 3D-tumör spheroid invasion av högupplöst Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identifiering av transkriptionsfaktor regulatorer med hjälp av Medium-Genomströmning Screening av arrayed bibliotek och en Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Analyser för validering av Histone Acetyltransferas hämmare

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Bedöma cellulära Target Engagement av SHP2 (PTPN11) Fosfatashämmare

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...