Name: isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation
Uploaded: 2021-01-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح بحثية من منحة JSPS KAKENHI رقم JP 20K08858، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81941001 و 81770457)، JSPS-CAS في إطار برنامج التعاونية البحثية اليابانية الصينية.

تم تنفيذ جميع الإجراءات لدراسات الأرانب بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ياماناشي (العدد المعتمد: A28-39).
1. فصل البلازما من دم الأرانب
<ol><li>قم بإعداد 1.5 مل ميكروتوب تحتوي على 15 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (pH 8.0) لجمع الدم.</li>
	<li>وضع أرنب في تقييد وثقب الشريان المتوسط ...

<ol>
	<li>Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+as+a+protective+factor+against+coronary+heart+disease:+The+Framingham+study.">High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study.</a> The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).</li><li>Baigent, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+cholesterol-lowering+treatment:+prospective+meta-analysis+of+data+from+90,056+participants+in+14+randomised+trials+of+statins.">Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins.</a> Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).</li><li>Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Measurement+of+LDL-Cholesterol:+A+Critical+Assessment+of+Direct+Measurement+by+Homogeneous+Assays+versus+Calculation.">Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation.</a> Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).</li><li>Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Methods+for+Measurement+of+HDL-Cholesterol:+From+Ultracentrifugation+to+Homogeneous+Assays.">Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).</li><li>Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+chemical+composition+of+ultracentrifugally+separated+lipoproteins+in+human+serum.">The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).</li><li>Hatch, F. T., Lees, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Methods+for+Plasma+Lipoprotein+Analysis.">Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis.</a> Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).</li><li>Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+lipoprotein+measurements+in+a+normal+adult+American+population.">Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population.</a> Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatic+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+a+marked+reduction+of+plasma+high+density+lipoproteins+and+intermediate+density+lipoproteins.">Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Apolipoprotein+A-II+Protects+Against+Diet-Induced+Atherosclerosis+in+Transgenic+Rabbits.">Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).</li><li>Niimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+knockout+rabbits:+A+novel+model+for+the+study+of+human+hyperlipidemia.">ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia.</a> Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+Cholesteryl+Ester+Transfer+Protein+Protects+Against+Atherosclerosis+in+RabbitsHighlights.">Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Lipase+Exerts+its+Anti-Atherogenic+Effect+through+Increased+Catabolism+of+&#946;-VLDLs.">Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of &#946;-VLDLs.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Lipoprotein+Lipase+in+Transgenic+Rabbits+Inhibits+Diet-induced+Hypercholesterolemia+and+Atherosclerosis.">Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).</li><li>Koike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Human+ApoAII+in+Transgenic+Rabbits+Leads+to+Dyslipidemia:+A+New+Model+for+Combined+Hyperlipidemia.">Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).</li><li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+lipoprotein+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+increased+small+dense+LDL+in+plasma+and+promotes+atherosclerosis.">Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis.</a> Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).</li><li>von Zychlinski, A., Kleffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+proteome+of+lipoproteins:+New+biomarkers+for+cardiovascular+diseases.">Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases.</a> Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+CIII+Deficiency+Protects+Against+Atherosclerosis+in+Knockout+Rabbits.">Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).</li><li>Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+Lipase+Inhibitor,+Nordihydroguaiaretic+Acid,+Aggravates+Metabolic+Phenotypes+and+Alters+HDL+Particle+Size+in+the+Western+Diet-Fed+db/db+Mice.">Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).</li><li>De Silva, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+human+apolipoprotein+C-III+in+transgenic+mice+results+in+an+accumulation+of+apolipoprotein+B48+remnants+that+is+corrected+by+excess+apolipoprotein+E.">Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).</li><li>Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+on-line+dual+enzymatic+method+for+simultaneous+quantification+of+cholesterol+and+triglycerides+in+lipoproteins+by+HPLC.">A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC.</a> Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).</li></ol>

تعد الدهون المفرطة من أهم عوامل الخطر لمرض تصلب الشرايين. وهكذا، تحليل البروتينات الدهنية البلازما ليس فقط ضروري لتشخيص مرضى dyslipidemia ولكن أيضا مهم للتحقيق في الآليات الجزيئية لعملية التمثيل الغذائي البروتين الدهني و تصلب الشرايين. في هذه الدراسة، وصفنا بروتوكول عزل وتحليل البروتينات الد...

ديسليبيديميا هو عامل الخطر الرئيسي لمرض تصلب الشرايين في العالم. ترتبط المستويات العالية من البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (LDLs) والمستويات المنخفضة من البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDLs) بشكل وثيق مع ارتفاع خطر الإصابة بأمراض القلب التاجية (CHD)1،2. في الإعداد السريري، يتم قياس كل من LDL-الكولسترول (LDL-C) والكوليسترول HDL-CHOLESTEROL (HDL-C) بشكل روتيني باستخدام محلل آلي في مختبر سريري3،4. على الرغم من هذا، فمن الضروري لتحليل ملامح البروتين الدهني في التفاصيل لتشخيص dyslipidemia ودراسة التمثيل الغذائي للدهون و تصلب الشرايين في الحيوانات البشرية والتجريبية. وقد تم الإبلاغ عن عدة طرق لتحليل البروتين الدهني البلازما مثل الطرد الفائق المركز، وحجم استبعاد الكروماتوغرافيا [الكروماتوغرافيا السائلة البروتينية السريعة (FPLC) والكرومات السائلة عالية الأداء (HPLC))، والكهربائية بواسطة agarose و Polyacrylamide الهلام الهلام، الرنين المغناطيسي النووي، وانتقائية الكيميائية باستخدام البوليانيونس والالات الأرافينت أو غيرها من المواد الكيميائية. في الخمسينات، اقترحت مجموعة هافل لأول مرة مفهوم البروتينات الدهنية المحددة بالكثافة باستخدام الطارد الشديد وصنفتها في الكريومكيرونات (CM)، وبروتينات lipoproteins ذات الكثافة المنخفضة جداً (VLDL)، وبروتينات البروتينات الدهنية المتوسطة الكثافة (IDL)، وLDL، وHLDL5 وفيما بعد، تم تعديل الطريقة بشكل أكبر من قبل مجموعات أخرى6،7. حتى الآن، الطرد المفرط هو الأسلوب الأكثر شعبية وموثوق بها في حين أن البروتوكول العملي لا يزال غير متوفر. في هذه الورقة، حاولنا وصف بروتوكول سهل الاستخدام لعزل نطاق صغير من البلازما باستخدام كثافة متتابعة عائمة الrifugugation وصفت أصلا8. عزل سبعة كسور البروتين الدهني البلازما [VLDL (d< 1.006 ز / مل), IDL (d= 1.02 غرام / مل), LDLs (d= 1.04 و 1.06 ز /مل), HDLs (d= 1.08, 1.10, و 1.21 ز /مل]] تمكن الباحثين من إجراء تحليل مستفيض لكل من البروتينات الدهنية وبروتيناتها التركيبية9,10,11. ويمكن استخدام سبعة البروتينات الدهنية الكثافة على التوالي سليمة لتحليل وظائف البروتين الدهني وتخدم أيضا إلى الخلايا القائمة على استراتيجيات في المختبر. وينبغي أن يكون هذا البروتوكول مفيدا لكل من التشخيص السريري والبحوث الأساسية. هنا استخدمنا البلازما الأرانب كمثال لإثبات هذه التقنية في حين يمكن تطبيق البلازما من الأنواع الأخرى بنفس الطريقة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22-gauge needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2232S</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655101</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein A-I antibody</td>
			<td>LifeSpan BioSciences</td>
			<td>LS-C314186</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein B antibody</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-101-111</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein E antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB947</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>299-50101</td>
			<td>For apolipoprotein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>himac CF15RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closure</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132736</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>043-30921</td>
			<td>For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry heat block</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MD-01N</td>
			<td>For SDS-PAGE sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>590</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle ultracentrifuge rotor</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>357656</td>
			<td>TLA-120.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF menbrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumino image analyzer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For Western blotting, ImageQuant LAS 4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>SR-304</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader iMARK</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube</td>
			<td>INA-OPTIKA</td>
			<td>SC-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital agitator USBDbo</td>
			<td>Stovall Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti goat IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-035-003</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipids assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>433-36201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bromide</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>168-03475</td>
			<td>For density solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0377</td>
			<td>For SDS-PAGE and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit restrainer</td>
			<td>Natsume Seisakusho</td>
			<td>KN-318</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>T15A43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample buffer (2x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-20% gradient polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-12865</td>
			<td>For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>439-17501</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyicerides assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>432-40201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube slicer for thick-walled tube</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347960</td>
			<td>For lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>A95761</td>
			<td>Optima MAX-TL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blotting wet transfer system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation

تحليل البروتينات الدهنية والبلازمية و apolipoproteins هو جزء أساسي لتشخيص dyslipidemia ودراسات التمثيل الغذائي للدهون و تصلب الشرايين. على الرغم من وجود عدة طرق لتحليل البروتينات الدهنية البلازما، لا يزال الطرد الفائق التركيز واحدة من الأساليب الأكثر شعبية وموثوق بها. بسبب إجراء فصل سليمة، يمكن استخدام كسور البروتين الدهني المعزولة بواسطة هذه الطريقة لتحليل البروتينات الدهنية، apolipoproteins، البروتيوم، والدراسة الوظيفية للبروتينات الدهنية مع الخلايا المستزرعة في المختبر. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل سبعة كسور البروتينات الدهنية بما في ذلك VLDL (d< 1.006 ز / مل)، IDL (d = 1.02 ز / مل)، LDLs (د = 1.04 و 1.06 ز / مل)، HDLs (d = 1.08، 1.10، و 1.21 ز/مل) من بلازما الأرانب باستخدام الطرد فوق التخوم العائمة المتتابعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم القراء كيفية تحليل apolipoproteins مثل apoA-I، apoB، وapoE من قبل SDS-PAGE وغربية النشاف وتظهر نتائج تمثيلية للروبوتات الدهنية وspopoprotein ملفات تعريف باستخدام نماذج الأرنب hyperlipidemic. يمكن أن تصبح هذه الطريقة بروتوكولًا قياسيًا لكل من الأطباء والعلماء الأساسيين لتحليل وظائف البروتين الدهني.

باستخدام هذا البروتوكول، عزلنا البروتين الدهني للأرانب باستخدام 1 مل من البلازما وحصلنا على 7 كسور كثافة. كسور الكثافة المعزولة كافية لقياس الدهون وروبروبروتينات apolipoproteins كما هو موضح أعلاه لمعظم أغراض البحث. ويمكن أيضا أن تستخدم نفس الإجراء لعزل البروتينات الدهنية البلازما من البشر والأ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

وقد استخدمت عدة طرق لتحليل البروتين الدهني البلازما; ومع ذلك ، لا يزال الطرد الفائق واحدًا من أكثر الطرق شعبية وموثوقية. هنا، نحن وصف طريقة بشأن كيفية عزل البروتينات الدهنية من البلازما باستخدام كثافة متتابعة فائقة الrifugation وكيفية تحليل apolipoproteins لكل من أغراض التشخيص والبحث.

العزل والتحليل من البروتينات الدهنية البلازما من قبل الطاردة الفائقة

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

تحليل البروتينات الدهنية البلازما مهم جدا لتشخيص فرط االليب الدم والتحقيق في تصلب الشرايين. في هذا البروتوكول، ونحن سوف أعرض الطريقة الأساسية باستخدام الطارد الفائق لعزل البروتينات الدهنية البلازما. هذه الطريقة تسمح للباحثين باستخدام ملليلتر واحد من البلازما لعزل سبعة كسور البروتين الدهني.ويمكن استخدام هذه الكسور للدهون، apolipoproteins، فضلا عن دراسات وظيفية جيدة يمكن تطبيق هذه الطريقة لكل من عينات الإنسان والحيوان لتشخيص ديسليبيديما والأمراض ذات الصلة. تبدأ عن طريق نقل ملليلتر واحد من البلازما في كل أنبوب الطرد الفائقة البولي. ثم تحميل الأنابيب في الدوار زاوية ثابتة والطرد المركزي البلازما في 356، 000 مرات G لمدة 2.5 ساعة في أربع درجات مئوية.ضبط موقف شفرة في مقسم أنبوب إلى مستوى بين الجزء العلوي والكسر السفلي. قطع الأنابيب باستخدام تقطيع اللحم وجمع الجزء العلوي، ما يقرب من 200 ميكرولترس، في أنبوب صغير جديد. جمع الجزء السفلي المتبقية في أنبوب جديد polycarbonate ultracentrifuge للفصل المقبل.ضبط حجم الحجم الإجمالي إلى 800 ميكرولترات بإضافة نفس حل الكثافة. ضبط الكسر السفلي إلى كثافة 1.02 غرام لكل ملليلتر عن طريق إضافة 58.9 ميكرولترات من 1.21 غرام لكل ميلليلتر، و 141.1 ميكرولترات من 1.02 غرام لكل ملليلتر حل لمجمل حجم واحد ملليلتر. تحميل هذه الأنابيب في الدوار زاوية ثابتة والطرد المركزي في 356، 000 مرات G لمدة 2.5 ساعة في أربع درجات مئوية.استمر في جمع الكسور العليا، وضبط كثافة الكسور السفلية، والطرد المركزي لكثافات الكسور التي تبلغ 1.02 و1.04 و1.06 و1.08 و1.1 و1.21 غرام لكل ملليلتر. للطرد النهائي فائق التركيز، الطرد المركزي في 513، 000 مرة G لمدة أربع ساعات في أربع درجات مئوية. تظهر هنا ملامح البروتين الدهني للأرانب التي تتغذى إما على نظام غذائي عادي أو نظام غذائي عالي الكوليسترول.الأرانب هي الأعشاب، وبالتالي فإن البلازما TC، TG، ومستويات PL عموما أقل من تلك التي من البشر والفئران. في الأرانب العادية العادية التي تغذيها الحمية الغذائية، يتم توزيع TC بشكل رئيسي في HDL3 و LDL. في أنواع الأرانب البرية على نظام غذائي عادي القياسية, يتم توزيع 39٪ من البلازما TG في VLDLs, في حين أن 57٪ من PL البلازما الواردة في HDL3.عندما تم تحدي الأرانب مع اتباع نظام غذائي عالي الكوليسترول ، فإنها سرعان ما وضعت فرط الكوليسترول. وقد تميزت ملامح البروتين الدهني بهم من قبل ارتفاع ملحوظ من VLDLs. سبعة كسور البروتين الدهني من الأرانب من النوع البري تغذية إما معيار عادي أو نظام غذائي عالي الكوليسترول تم تشغيلها على هلام بولياكريلاميد SDS وتصور مع تلطيخ مصرف البحرين المركزي.على نظام غذائي عالي الكوليسترول، كانت محتويات ApoB-100 و ApoE في VLDLs وIDLs وLDLs مرتفعة بشكل ملحوظ. تم استخدام النشاف الغربي لمقارنة apolipoproteins وملامح lipoprotein من ثلاثة الأرانب hyperlipidemic مختلفة: ارتفاع الكوليسترول في النظام الغذائي تغذية الأرانب من نوع البرية، ApoE الأرانب بالضربة القاضية، وواتانابي هيريتوبل الأرانب Hyperlipidemic مع نقص مستقبلات LDL. يتميز ApoB التي تحتوي على جزيئات من الأرانب ذات النوع البري عالية الكوليسترول التي تغذيها بالنظام الغذائي بزيادة محتويات ApoB-100 و ApoE ، في حين أظهرت الأرانب خروج المغلوب ApoE زيادة ApoB-48 جنبا إلى جنب مع ظهور ApoA-1.الأرانب Hyperlipidemic اتانابي هينيبلي هي نقص وراثيا في وظائف مستقبلات LDL، لذلك لوحظ زيادة ملحوظة من ApoB-100 في LDLs يرافقه انخفاض ApoA-1 في HDLs، على غرار المرضى فرط الكوليسترول في الدم الأسرة البشرية. استرداد العينة هو الأكثر أهمية في هذا الإجراء. لتقليل فقدان العينة، يجب على المرء أن يكون حريصا على جمع الكسر وحل تماما هطول اللزوج في الجزء السفلي.بعد جمع سبعة كسور البروتين الدهني، يتطلب غسيل الكلى للفرز. وبمجرد اكتمال غسيل الكلى، عينات البروتينات الدهنية للتحليل باستخدام صفحة SDS، النشاف الغربي، ودراسة الخلايا. في الإعداد السريري، يفصل الطرد الفائق التركيز عادة البروتينات الدهنية إلى أربعة كسور.يمكن أن يعزل الأسلوب الحالي سبعة كسور البروتينات الدهنية، والذي يوفر المزيد من التفاصيل من البروتينات الدهنية للتحقيق في فرط سليبيب الدم.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة لغير الترميز الصغيرة RNA الكمي

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

التنميط العالي الاستبانة بواسطة Cryoslicing BN-MS التحليل

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

التحليل الطيفي للارتباط الفلوري للتباين الموضعي لتحليل الانتشار الجزيئي في الغشاء البلازمي للخلايا الحية

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...