Name: isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation
Uploaded: 2021-01-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af et forskningstilskud fra JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, National Natural Science Foundation of China (nr. 81941001 og 81770457), JSPS-CAS under Japan-China Research Cooperative Program.

Alle procedurer for kaninundersøgelser blev udført med godkendelse fra University of Yamanashi Institutional Animal Care and Use Committee (Godkendt nummer: A28-39).
1. Plasmaadskillelse fra kaninblod
<ol><li>Der fremstilles 1,5 mL mikrorør indeholdende 15 μL på 0,5 M EDTA (pH 8.0) til blodopsamling.</li>
	<li>Sæt en kanin i en restrainer og punktere en auricular mellemliggende arterie ved hjælp af en 22 gauge nål og indsamle blod i et rør. Bland blodet med EDTA forsigtigt og læg d...

<ol>
	<li>Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+as+a+protective+factor+against+coronary+heart+disease:+The+Framingham+study.">High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study.</a> The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).</li><li>Baigent, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+cholesterol-lowering+treatment:+prospective+meta-analysis+of+data+from+90,056+participants+in+14+randomised+trials+of+statins.">Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins.</a> Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).</li><li>Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Measurement+of+LDL-Cholesterol:+A+Critical+Assessment+of+Direct+Measurement+by+Homogeneous+Assays+versus+Calculation.">Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation.</a> Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).</li><li>Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Methods+for+Measurement+of+HDL-Cholesterol:+From+Ultracentrifugation+to+Homogeneous+Assays.">Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).</li><li>Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+chemical+composition+of+ultracentrifugally+separated+lipoproteins+in+human+serum.">The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).</li><li>Hatch, F. T., Lees, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Methods+for+Plasma+Lipoprotein+Analysis.">Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis.</a> Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).</li><li>Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+lipoprotein+measurements+in+a+normal+adult+American+population.">Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population.</a> Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatic+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+a+marked+reduction+of+plasma+high+density+lipoproteins+and+intermediate+density+lipoproteins.">Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Apolipoprotein+A-II+Protects+Against+Diet-Induced+Atherosclerosis+in+Transgenic+Rabbits.">Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).</li><li>Niimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+knockout+rabbits:+A+novel+model+for+the+study+of+human+hyperlipidemia.">ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia.</a> Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+Cholesteryl+Ester+Transfer+Protein+Protects+Against+Atherosclerosis+in+RabbitsHighlights.">Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Lipase+Exerts+its+Anti-Atherogenic+Effect+through+Increased+Catabolism+of+&#946;-VLDLs.">Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of &#946;-VLDLs.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Lipoprotein+Lipase+in+Transgenic+Rabbits+Inhibits+Diet-induced+Hypercholesterolemia+and+Atherosclerosis.">Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).</li><li>Koike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Human+ApoAII+in+Transgenic+Rabbits+Leads+to+Dyslipidemia:+A+New+Model+for+Combined+Hyperlipidemia.">Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).</li><li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+lipoprotein+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+increased+small+dense+LDL+in+plasma+and+promotes+atherosclerosis.">Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis.</a> Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).</li><li>von Zychlinski, A., Kleffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+proteome+of+lipoproteins:+New+biomarkers+for+cardiovascular+diseases.">Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases.</a> Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+CIII+Deficiency+Protects+Against+Atherosclerosis+in+Knockout+Rabbits.">Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).</li><li>Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+Lipase+Inhibitor,+Nordihydroguaiaretic+Acid,+Aggravates+Metabolic+Phenotypes+and+Alters+HDL+Particle+Size+in+the+Western+Diet-Fed+db/db+Mice.">Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).</li><li>De Silva, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+human+apolipoprotein+C-III+in+transgenic+mice+results+in+an+accumulation+of+apolipoprotein+B48+remnants+that+is+corrected+by+excess+apolipoprotein+E.">Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).</li><li>Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+on-line+dual+enzymatic+method+for+simultaneous+quantification+of+cholesterol+and+triglycerides+in+lipoproteins+by+HPLC.">A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC.</a> Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).</li></ol>

Hyperlipidemi er en af de vigtigste risikofaktorer for aterosklerotisk sygdom. Således er analyse af plasma lipoproteiner ikke kun afgørende for diagnosticering af dyslipidemipatienter, men også vigtig for undersøgelse af molekylære mekanismer af lipoproteinmetabolisme og åreforkalkning. I denne undersøgelse beskrev vi protokollen for isolering og analyse af plasma lipoproteiner, som kan anvendes i de laboratorier, hvor ultracentrifugering er tilgængelig. Oplysninger indhentet ved denne metode er omfattende og li...

Dyslipidemi er den største risikofaktor for aterosklerotisk sygdom i verden. Høje niveauer af lipoproteiner med lav densitet (LDL'er) og lave niveauer af lipoproteiner med høj densitet (HDLs) er tæt forbundet med en høj risiko for koronar hjertesygdom (CHD)1,2. I den kliniske indstilling måles både LDL-kolesterol (LDL-C) og HDL-kolesterol (HDL-C) rutinemæssigt ved hjælp af en automatiseret analysator i et klinisk laboratorium3,4. På trods af dette er det vigtigt at analysere lipoproteinprofiler i detaljer til diagnosticering af dyslipidemi og studiet af lipidmetabolisme og åreforkalkning hos mennesker og forsøgsdyr. Flere metoder er blevet rapporteret til at analysere plasma lipoproteiner såsom ultracentrifugering, størrelse udelukkelse kromatografi [fast protein flydende kromatografi (FPLC) og højtydende flydende kromatografi (HPLC)], elektroforese af agarose og polyacrylamid geler, nukleare magnetiske resonans, og selektiv kemisk nedbør ved hjælp af polyanioner og divalent cations eller andre kemikalier. I 1950'erne foreslog Havels gruppe først begrebet lipoproteiner defineret ved tætheder ved hjælp af ultracentrifugering og klassificerede dem i chylomicrons (CM), lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med mellemdensitet (IDL), LDL og HDL5 og senere blev metoden yderligere ændret af andre grupper6,7. Indtil nu er ultracentrifugation den mest populære og pålidelige metode, mens den praktiske protokol stadig ikke er tilgængelig. I dette papir forsøgte vi at beskrive en brugervenlig protokol til isolering af en lille skala plasma ved hjælp af sekventiel tæthed flydende ultracentrifugering, der oprindeligt blev beskrevet tidligere8. Isolering af syv plasma lipoproteinfraktioner [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL'er (d=1,04 og 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1.10, og 1.21 g/mL)] gør det muligt for forskere at foretage en omfattende analyse af både lipoproteiner og deres kompositoriske apolipoproteiner9,10,11. Den intakte syv på hinanden følgende tæthed lipoproteiner kan bruges til at analysere lipoprotein funktioner og også tjener til celle-baserede in vitro strategier. Denne protokol bør være nyttig for både klinisk diagnose og grundforskning. Her brugte vi kaninplasma som et eksempel til at demonstrere denne teknik, mens plasma fra andre arter kan anvendes på samme måde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22-gauge needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2232S</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655101</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein A-I antibody</td>
			<td>LifeSpan BioSciences</td>
			<td>LS-C314186</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein B antibody</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-101-111</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein E antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB947</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>299-50101</td>
			<td>For apolipoprotein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>himac CF15RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closure</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132736</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>043-30921</td>
			<td>For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry heat block</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MD-01N</td>
			<td>For SDS-PAGE sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>590</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle ultracentrifuge rotor</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>357656</td>
			<td>TLA-120.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF menbrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumino image analyzer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For Western blotting, ImageQuant LAS 4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>SR-304</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader iMARK</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube</td>
			<td>INA-OPTIKA</td>
			<td>SC-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital agitator USBDbo</td>
			<td>Stovall Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti goat IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-035-003</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipids assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>433-36201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bromide</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>168-03475</td>
			<td>For density solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0377</td>
			<td>For SDS-PAGE and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit restrainer</td>
			<td>Natsume Seisakusho</td>
			<td>KN-318</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>T15A43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample buffer (2x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-20% gradient polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-12865</td>
			<td>For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>439-17501</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyicerides assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>432-40201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube slicer for thick-walled tube</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347960</td>
			<td>For lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>A95761</td>
			<td>Optima MAX-TL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blotting wet transfer system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation

Analyse af plasma lipoproteiner og apolipoproteiner er en væsentlig del for diagnosticering af dyslipidemi og undersøgelser af lipidmetabolisme og åreforkalkning. Selv om der er flere metoder til analyse af plasma lipoproteiner, ultracentrifugation er stadig en af de mest populære og pålidelige metoder. På grund af sin intakte separationsprocedure kan lipoproteinfraktionerne isoleret ved denne metode bruges til analyse af lipoproteiner, apolipoproteiner, proteomer og funktionel undersøgelse af lipoproteiner med dyrkede celler in vitro. Her leverer vi en detaljeret protokol til at isolere syv lipoproteinfraktioner, herunder VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 og 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10 og 1,21 g/mL) fra kaninplasma ved hjælp af sekventiel flydende ultracentrifugering. Derudover introducerer vi læserne, hvordan man analyserer apolipoproteiner som apoA-I, apoB og apoE af SDS-PAGE og Western blotting og viser repræsentative resultater af lipoprotein- og apolipoproteinprofiler ved hjælp af hyperlipidemiske kaninmodeller. Denne metode kan blive en standardprotokol for både klinikere og grundlæggende forskere til at analysere lipoproteinfunktioner.

Ved hjælp af denne protokol isolerede vi kanin lipoproteiner ved hjælp af 1 mL plasma og opnåede syv tæthedsfraktioner. Isolerede tæthedsfraktioner er nok til at måle lipider og apolipoproteiner som beskrevet ovenfor til de fleste forskningsformål. Den samme procedure kan også anvendes til isolering af plasma lipoproteiner fra mennesker og andre arter. For små dyr som mus kræves samlet plasma. Figur 3 viser lipoproteinprofiler af vildtypekaniner fodret med enten en normal standard ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Der er anvendt flere metoder til analyse af plasma lipoproteiner; Ultracentrifugation er dog stadig en af de mest populære og pålidelige metoder. Her beskriver vi en metode til at isolere lipoproteiner fra plasma ved hjælp af sekventiel tæthed ultracentrifugering og hvordan man analyserer apolipoproteinerne til både diagnostiske og forskningsmæssige formål.

Isolation og analyse af Plasma Lipoproteiner ved Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Analyse af plasma lipoproteiner er meget vigtig for diagnosticering af hyperlipidemi og undersøgelse af åreforkalkning. I er denne protokol, vil vi indføre den grundlæggende metode ved hjælp af ultracentrifugation at isolere plasma lipoproteiner. Denne metode gør det muligt for forskerne at bruge en milliliter plasma til at isolere syv lipoprotein fraktioner.Disse fraktioner kan bruges til lipider, apolipoproteiner samt velfunktionelle undersøgelser Denne metode kan anvendes til både menneske- og dyreprøver til diagnosticering af dyslipidemi og den relaterede sygdom. Begynd med at overføre en milliliter plasma til hvert polycarbonat ultracentrifugerør. Derefter indlæses rørene i en fast vinkel rotor og centrifuge plasmaet ved 356.000 gange G i 2,5 timer ved fire grader Celsius.Juster bladets position i rørskæreren til et niveau mellem den øverste og den nederste fraktion. Skær rørene ved hjælp af en slicer og indsamle den øverste fraktion, ca 200 mikroliter, i et nyt mikrorør. Saml den resterende bundfraktion i et nyt polycarbonat ultracentrifugerør til næste adskillelse.Juster det samlede volumen til 800 mikroliter ved at tilføje den samme tæthedsopløsning. Den nederste fraktion justeres til en massefylde på 1,02 gram pr. milliliter ved at tilsætte 58,9 mikroliter på 1,21 gram pr. milliliter opløsning og 141,1 mikroliter på 1,02 gram pr. milliliteropløsning for et samlet volumen på en milliliter. Lad disse rør i den faste vinkel rotor og centrifuge ved 356.000 gange G i 2,5 timer ved fire grader Celsius.Fortsæt med at indsamle topfraktioner, justere tætheden af bundfraktioner og centrifugere for fraktionstætheder på 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 og 1,21 gram pr. Milliliter. For den endelige ultracentrifugering, centrifuge ved 513, 000 gange G i fire timer ved fire grader Celsius. Lipoprotein profiler af kaniner fodret enten en normal standard kost eller et højt kolesteroltal kost er vist her.Kaniner er planteædere, så deres plasma TC, TG, og PL niveauer er generelt lavere end for mennesker og mus. I normale standard kostfodrede kaniner distribueres TC hovedsageligt i HDL3 og LDL. Hos kaniner af vild type på normal standardkost distribueres 39% af plasma-TG i VLDLs, mens 57% af plasma-PL er indeholdt i HDL3.Når kaniner blev udfordret med en højt kolesteroltal kost, udviklede de hurtigt hypercholesterolmia. Deres lipoproteinprofiler var kendetegnet ved en markant højde af VLDLs. Syv lipoproteinfraktioner fra vilde type kaniner fodret med enten en normal standard eller en højt kolesteroltal diæt blev kørt på en SDS polyacrylamidgel og visualiseret med CBB farvning.På en højt kolesteroltal kost, både ApoB-100 og ApoE indhold i VLDLs, IDLs, og LDLs var markant forhøjet. Vestlige blotting blev brugt til at sammenligne apolipoproteiner og lipoproteinprofiler af tre forskellige hyperlipidemiske kaniner: højt kolesteroltal kostfodrede vilde type kaniner, ApoE knockout kaniner og Watanabe Arvelige Hyperlipidemic kaniner med LDL receptormangel. Den ApoB indeholder partikler af højt kolesteroltal kost-fodret vilde type kaniner er kendetegnet ved øget ApoB-100 og ApoE indhold, mens ApoE knockout kaniner viste en stigning i ApoB-48 sammen med fremkomsten af ApoA-1.Watanabe Arvelige Hyperlipidemic kaniner er genetisk mangelfuld i LDL receptor funktioner, så en markant stigning på ApoB-100 i LDLs ledsaget af reduceret ApoA-1 i HDLs blev observeret, svarende til humane familiære hypercholesterolemi patienter. Prøvegendannelse er den mest kritiske i denne procedure. For at minimere prøvetab, bør man være omhyggelig med at indsamle fraktion og helt opløse tyktflydende nedbør i den nederste fraktion.Efter indsamlingen af syv lipoproteinfraktioner er dialyse nødvendigt til sortering. Når dialyse er færdig, lipoproteiner prøver til analyse ved hjælp af SDS side, vestlige blotting, og celle-baseret undersøgelse. I den kliniske indstilling, normalt ultracentrifugation adskiller lipoproteiner i fire fraktioner.Den nuværende metode kan isolere syv lipoproteiner fraktioner, som giver flere detaljer af lipoproteiner til undersøgelse af hyperlipidemi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolering af High-density lipoprotein for ikke-kodning Lille RNA Kvantificering

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation for Kvantitativ massespektrometri Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Måling af Trans-Plasma membran elektron Transport af C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Complexome-profilering med høj opløsning ved Cryoslicing BN-MS-analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin kædeanalyse ved parallel reaktionsovervågning

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spot variation fluorescens korrelationsspektroskopi til analyse af molekylær diffusion ved plasmamembranen af levende celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Tæthedsgradient ultracentrifugering til undersøgelse af endoytisk genanvendelse i pattedyrceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...