Name: isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation
Uploaded: 2021-01-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een onderzoeksbeurs van JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, de National Natural Science Foundation of China (Nr. 81941001 en 81770457), JSPS-CAS in het kader van het Japan-China Research Cooperative Program.

Alle procedures voor konijnenstudies werden uitgevoerd met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Yamanashi (goedgekeurd nummer: A28-39).
1. Plasmascheiding van konijnenbloed
<ol><li>Bereid 1,5 ml microbuisjes met 15 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) voor op bloedafname.</li>
	<li>Plaats een konijn in een restrainer en prik een auriculaire tussenslagader door met behulp van een 22 gauge naald en verzamel bloed in een buis. Meng het bloed voorzichtig met ...

<ol>
	<li>Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+as+a+protective+factor+against+coronary+heart+disease:+The+Framingham+study.">High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study.</a> The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).</li><li>Baigent, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+cholesterol-lowering+treatment:+prospective+meta-analysis+of+data+from+90,056+participants+in+14+randomised+trials+of+statins.">Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins.</a> Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).</li><li>Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Measurement+of+LDL-Cholesterol:+A+Critical+Assessment+of+Direct+Measurement+by+Homogeneous+Assays+versus+Calculation.">Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation.</a> Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).</li><li>Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Methods+for+Measurement+of+HDL-Cholesterol:+From+Ultracentrifugation+to+Homogeneous+Assays.">Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).</li><li>Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+chemical+composition+of+ultracentrifugally+separated+lipoproteins+in+human+serum.">The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).</li><li>Hatch, F. T., Lees, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Methods+for+Plasma+Lipoprotein+Analysis.">Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis.</a> Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).</li><li>Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+lipoprotein+measurements+in+a+normal+adult+American+population.">Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population.</a> Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatic+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+a+marked+reduction+of+plasma+high+density+lipoproteins+and+intermediate+density+lipoproteins.">Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Apolipoprotein+A-II+Protects+Against+Diet-Induced+Atherosclerosis+in+Transgenic+Rabbits.">Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).</li><li>Niimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+knockout+rabbits:+A+novel+model+for+the+study+of+human+hyperlipidemia.">ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia.</a> Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+Cholesteryl+Ester+Transfer+Protein+Protects+Against+Atherosclerosis+in+RabbitsHighlights.">Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Lipase+Exerts+its+Anti-Atherogenic+Effect+through+Increased+Catabolism+of+&#946;-VLDLs.">Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of &#946;-VLDLs.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Lipoprotein+Lipase+in+Transgenic+Rabbits+Inhibits+Diet-induced+Hypercholesterolemia+and+Atherosclerosis.">Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).</li><li>Koike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Human+ApoAII+in+Transgenic+Rabbits+Leads+to+Dyslipidemia:+A+New+Model+for+Combined+Hyperlipidemia.">Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).</li><li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+lipoprotein+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+increased+small+dense+LDL+in+plasma+and+promotes+atherosclerosis.">Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis.</a> Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).</li><li>von Zychlinski, A., Kleffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+proteome+of+lipoproteins:+New+biomarkers+for+cardiovascular+diseases.">Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases.</a> Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+CIII+Deficiency+Protects+Against+Atherosclerosis+in+Knockout+Rabbits.">Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).</li><li>Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+Lipase+Inhibitor,+Nordihydroguaiaretic+Acid,+Aggravates+Metabolic+Phenotypes+and+Alters+HDL+Particle+Size+in+the+Western+Diet-Fed+db/db+Mice.">Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).</li><li>De Silva, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+human+apolipoprotein+C-III+in+transgenic+mice+results+in+an+accumulation+of+apolipoprotein+B48+remnants+that+is+corrected+by+excess+apolipoprotein+E.">Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).</li><li>Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+on-line+dual+enzymatic+method+for+simultaneous+quantification+of+cholesterol+and+triglycerides+in+lipoproteins+by+HPLC.">A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC.</a> Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).</li></ol>

Hyperlipidemie is een van de belangrijkste risicofactoren van atherosclerotische ziekte. Zo is analyse van plasma-lipoproteïnen niet alleen essentieel voor de diagnose van dyslipidemiepatiënten, maar ook belangrijk voor onderzoek naar moleculaire mechanismen van lipoproteïnemetabolisme en atherosclerose. In deze studie beschreven we het protocol van isolatie en analyse van plasma lipoproteïnen dat kan worden toegepast in de laboratoria waar ultracentrifugatie beschikbaar is. Informatie verkregen met deze methode is u...

Dyslipidemie is de belangrijkste risicofactor van atherosclerotische ziekte in de wereld. Hoge niveaus van lage dichtheid lipoproteïnen (MOL's) en lage niveaus van high-density lipoproteïnen (HDL 's) zijn nauw geassocieerd met een hoog risico op coronaire hartziekten (CHD)1,2. In de klinische setting worden zowel LDL-cholesterol (LDL-C) als HDL-cholesterol (HDL-C) routinematig gemeten met behulp van een geautomatiseerde analysator in een klinisch laboratorium3,4. Desondanks is het essentieel om lipoproteïneprofielen in detail te analyseren voor de diagnose van dyslipidemie en de studie van lipidemetabolisme en atherosclerose bij menselijke en experimentele dieren. Verschillende methoden zijn gemeld om plasma lipoproteïnen te analyseren, zoals ultracentrifugatie, grootte uitsluiting chromatografie [snelle eiwit vloeibare chromatografie (FPLC) en high performance vloeibare chromatografie (HPLC)], elektroforese door agarose en polyacrylamide gels, nucleaire magnetische resonantie, en selectieve chemische neerslag met behulp van polyanionen en divalente kationen of andere chemicaliën. In de jaren 1950 stelde havels groep voor het eerst het concept van lipoproteïnen voor dat werd gedefinieerd door dichtheden met behulp van ultracentrifugatie en classificeerde ze in chylomicronen (CM), lipoproteïnen met een zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïnen met gemiddelde dichtheid (IDL), LDL en HDL5 en later werd de methode verder gewijzigd door andere groepen6,7. Tot nu toe is ultracentrifugatie de meest populaire en betrouwbare methode, terwijl het praktische protocol nog steeds niet beschikbaar is. In dit artikel hebben we geprobeerd een gebruiksvriendelijk protocol te beschrijven voor het isoleren van een kleine schaal van plasma met behulp van sequentiële dichtheid zwevende ultracentrifugatie oorspronkelijk eerder beschreven8. Isolatie van zeven plasma lipoproteïnefracties [VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), MOL's (d=1,04 en 1,06 g/ml), HDL's (d=1,08, 1.10, en 1.21 g/ml)] stelt onderzoekers in staat om een uitgebreide analyse te maken van zowel lipoproteïnen als hun compositorische apolipoproteïnen9,10,11. De intacte zeven opeenvolgende dichtheid lipoproteïnen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van lipoproteïnefuncties en ook dienen voor celgebaseerde in vitro strategieën. Dit protocol moet nuttig zijn voor zowel klinische diagnose als fundamenteel onderzoek. Hier gebruikten we konijnenplasma als voorbeeld om deze techniek aan te tonen, terwijl plasma van andere soorten op dezelfde manier kan worden toegepast.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22-gauge needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2232S</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655101</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein A-I antibody</td>
			<td>LifeSpan BioSciences</td>
			<td>LS-C314186</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein B antibody</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-101-111</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein E antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB947</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>299-50101</td>
			<td>For apolipoprotein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>himac CF15RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closure</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132736</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>043-30921</td>
			<td>For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry heat block</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MD-01N</td>
			<td>For SDS-PAGE sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>590</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle ultracentrifuge rotor</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>357656</td>
			<td>TLA-120.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF menbrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumino image analyzer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For Western blotting, ImageQuant LAS 4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>SR-304</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader iMARK</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube</td>
			<td>INA-OPTIKA</td>
			<td>SC-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital agitator USBDbo</td>
			<td>Stovall Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti goat IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-035-003</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipids assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>433-36201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bromide</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>168-03475</td>
			<td>For density solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0377</td>
			<td>For SDS-PAGE and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit restrainer</td>
			<td>Natsume Seisakusho</td>
			<td>KN-318</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>T15A43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample buffer (2x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-20% gradient polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-12865</td>
			<td>For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>439-17501</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyicerides assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>432-40201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube slicer for thick-walled tube</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347960</td>
			<td>For lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>A95761</td>
			<td>Optima MAX-TL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blotting wet transfer system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation

Analyse van plasma lipoproteïnen en apolipoproteïnen is een essentieel onderdeel voor de diagnose van dyslipidemie en studies van lipidemetabolisme en atherosclerose. Hoewel er verschillende methoden zijn voor het analyseren van plasma lipoproteïnen, is ultracentrifugatie nog steeds een van de meest populaire en betrouwbare methoden. Vanwege de intacte scheidingsprocedure kunnen de lipoproteïnefracties die door deze methode worden geïsoleerd, worden gebruikt voor analyse van lipoproteïnen, apolipoproteïnen, proteomen en functionele studie van lipoproteïnen met gekweekte cellen in vitro. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om zeven lipoproteïnefracties te isoleren, waaronder VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), MOL's (d=1,04 en 1,06 g/ml), HDL's (d=1,08, 1,10 en 1,21 g/ml) uit konijnenplasma met behulp van sequentiële zwevende ultracentrifugatie. Daarnaast introduceren we de lezers hoe ze apolipoproteïnen zoals apoA-I, apoB en apoE kunnen analyseren door SDS-PAGE en Western blotting en tonen we representatieve resultaten van lipoproteïne- en apolipoproteïneprofielen met behulp van hyperlipidemische konijnenmodellen. Deze methode kan een standaardprotocol worden voor zowel clinici als basiswetenschappers om lipoproteïnefuncties te analyseren.

Met behulp van dit protocol hebben we konijnen lipoproteïnen geïsoleerd met behulp van 1 ml plasma en zeven dichtheidsfracties verkregen. Geïsoleerde dichtheidsfracties zijn voldoende voor het meten van lipiden en apolipoproteïnen zoals hierboven beschreven voor de meeste onderzoeksdoeleinden. Dezelfde procedure kan ook worden gebruikt voor het isoleren van plasma lipoproteïnen van menselijke en andere soorten. Voor kleine dieren zoals muizen is gepoold plasma vereist. Figuur 3 toont li...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Verschillende methoden zijn gebruikt voor het analyseren van plasma lipoproteïnen; ultracentrifugatie is echter nog steeds een van de meest populaire en betrouwbare methoden. Hier beschrijven we een methode met betrekking tot het isoleren van lipoproteïnen uit plasma met behulp van sequentiële dichtheid ultracentrifugatie en hoe de apolipoproteïnen te analyseren voor zowel diagnostische als onderzoeksdoeleinden.

Isolatie en analyse van plasma lipoproteïnen door ultracentrifugatie

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Analyse van plasma lipoproteïnen is zeer belangrijk voor de diagnose van hyperlipidemie en het onderzoek van atherosclerose. In dit protocol introduceren we de basismethode met behulp van ultracentrifugatie om plasma lipoproteïnen te isoleren. Met deze methode kunnen de onderzoekers één milliliter plasma gebruiken om zeven lipoproteïnefracties te isoleren.Deze fracties kunnen worden gebruikt voor lipiden, apolipoproteïnen en goed functionele studies Deze methode kan worden toegepast voor zowel menselijke als dierlijke monsters voor de diagnose van dyslipidemie en de gerelateerde ziekte. Begin met het overbrengen van één milliliter plasma in elke polycarbonaat ultracentrifugebuis. Laad vervolgens de buizen in een vaste hoekrotor en centrifugeer het plasma op 356, 000 keer G gedurende 2,5 uur bij vier graden Celsius.Stel de positie van het mes in de buissnijder in op een niveau tussen de bovenste fractie en de onderste fractie. Snijd de buizen met een snijmachine en verzamel de bovenste fractie, ongeveer 200 microliters, in een nieuwe microbuis. Verzamel de resterende bodemfractie in een nieuwe polycarbonaat ultracentrifugebuis voor de volgende scheiding.Pas het totale volume aan op 800 microliter door dezelfde dichtheidsoplossing toe te voegen. Pas de onderste fractie aan op een dichtheid van 1,02 gram per milliliter door 58,9 microliter van 1,21 gram per milliliteroplossing toe te voegen en 141,1 microliter van 1,02 gram per milliliteroplossing voor een totaal volume van één milliliter. Laad deze buizen in de vaste hoekrotor en centrifugeer gedurende 2,5 uur bij vier graden Celsius op 356,000 keer G.Blijf bovenste breuken verzamelen, de dichtheid van onderste breuken aanpassen en centrifugeren voor breukdichtheden van 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 en 1,21 gram per milliliter. Voor de laatste ultracentrifugatie, centrifugeren op 513, 000 keer G gedurende vier uur bij vier graden Celsius. Lipoproteïneprofielen van konijnen die een normaal standaarddieet of een cholesterolrijk dieet krijgen, worden hier weergegeven.Konijnen zijn herbivoren, dus hun plasma TC-, TG- en PL-niveaus zijn over het algemeen lager dan die van mensen en muizen. Bij normale standaard dieetgevoede konijnen wordt TC voornamelijk gedistribueerd in HDL3 en LDL. Bij wilde konijnen met een normaal standaarddieet wordt 39% van de plasma-TG verdeeld in VLDLs, terwijl 57% van plasma PL in HDL3 zit.Toen konijnen werden uitgedaagd met een cholesterolrijk dieet, ontwikkelden ze snel hypercholesterolemie. Hun lipoproteïneprofielen werden gekenmerkt door een duidelijke verhoging van VLDI's. Zeven lipoproteïnefracties van wilde konijnen die een normale standaard of een cholesterolrijk dieet kregen, werden uitgevoerd op een SDS-polyacrylamidegel en gevisualiseerd met CBB-vlekken.Op een cholesterolrijk dieet werden zowel het ApoB-100- als het ApoE-gehalte in VLDLs, IDLs en MOL's duidelijk verhoogd. Westerse vlekken werden gebruikt om apolipoproteïnen en lipoproteïneprofielen van drie verschillende hyperlipidemische konijnen te vergelijken: cholesterolrijke dieetgevoede wilde konijnen, ApoE-knock-outkonijnen en Watanabe Heritable Hyperlipidemic-konijnen met LDL-receptordeficiëntie. De ApoB bevattende deeltjes van hoog-cholesterol dieet-gevoede wilde type konijnen worden gekenmerkt door verhoogde ApoB-100 en ApoE inhoud, terwijl ApoE knock-out konijnen toonden een toename van ApoB-48 samen met het uiterlijk van ApoA-1.Watanabe Erfelijke Hyperlipidemische konijnen hebben een genetisch tekort aan LDL-receptorfuncties, dus een duidelijke toename van ApoB-100 in MOL's vergezeld van verminderde ApoA-1 in HDL's werd waargenomen, vergelijkbaar met humane familiaire hypercholesterolemiepatiënten. Monsterherstel is het meest cruciaal in deze procedure. Om monsterverlies te minimaliseren, moet men voorzichtig zijn om breuk te verzamelen en viskeuze neerslag in de onderste fractie volledig op te lossen.Na de verzameling van zeven lipoproteïnefracties is dialyse nodig voor het sorteren. Zodra dialyse is voltooid, de lipoproteïnen monsters voor analyse met behulp van SDS pagina, westerse vlekken, en cel-gebaseerde studie. In de klinische setting scheidt ultracentrifugatie lipoproteïnen meestal in vier fracties.De huidige methode kan zeven lipoproteïnefracties isoleren, wat meer details van lipoproteïnen biedt voor onderzoek naar hyperlipidemie.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...