Name: isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation
Uploaded: 2021-01-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי מחקר מ JSPS KAKENHI גרנט מספר JP 20K08858, הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81941001 ו 81770457), JSPS-CAS תחת התוכנית השיתופית מחקר יפן-סין.

כל ההליכים ללימודי ארנבות בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמנשי (מספר מאושר: A28-39).
1. הפרדת פלזמה מדם ארנב
<ol><li>הכן 1.5 צינורות מ"ל המכילים 15 μL של 0.5 M EDTA (pH 8.0) לאיסוף דם.</li>
	<li>שים ארנב במרסן לנקב עורק ביניים auricular באמצעות מחט 22 מד ולאסוף דם לתוך צינור. מ...

<ol>
	<li>Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+as+a+protective+factor+against+coronary+heart+disease:+The+Framingham+study.">High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study.</a> The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).</li><li>Baigent, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+cholesterol-lowering+treatment:+prospective+meta-analysis+of+data+from+90,056+participants+in+14+randomised+trials+of+statins.">Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins.</a> Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).</li><li>Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Measurement+of+LDL-Cholesterol:+A+Critical+Assessment+of+Direct+Measurement+by+Homogeneous+Assays+versus+Calculation.">Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation.</a> Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).</li><li>Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Methods+for+Measurement+of+HDL-Cholesterol:+From+Ultracentrifugation+to+Homogeneous+Assays.">Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).</li><li>Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+chemical+composition+of+ultracentrifugally+separated+lipoproteins+in+human+serum.">The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).</li><li>Hatch, F. T., Lees, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Methods+for+Plasma+Lipoprotein+Analysis.">Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis.</a> Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).</li><li>Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+lipoprotein+measurements+in+a+normal+adult+American+population.">Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population.</a> Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatic+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+a+marked+reduction+of+plasma+high+density+lipoproteins+and+intermediate+density+lipoproteins.">Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Apolipoprotein+A-II+Protects+Against+Diet-Induced+Atherosclerosis+in+Transgenic+Rabbits.">Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).</li><li>Niimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+knockout+rabbits:+A+novel+model+for+the+study+of+human+hyperlipidemia.">ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia.</a> Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+Cholesteryl+Ester+Transfer+Protein+Protects+Against+Atherosclerosis+in+RabbitsHighlights.">Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Lipase+Exerts+its+Anti-Atherogenic+Effect+through+Increased+Catabolism+of+&#946;-VLDLs.">Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of &#946;-VLDLs.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Lipoprotein+Lipase+in+Transgenic+Rabbits+Inhibits+Diet-induced+Hypercholesterolemia+and+Atherosclerosis.">Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).</li><li>Koike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Human+ApoAII+in+Transgenic+Rabbits+Leads+to+Dyslipidemia:+A+New+Model+for+Combined+Hyperlipidemia.">Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).</li><li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+lipoprotein+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+increased+small+dense+LDL+in+plasma+and+promotes+atherosclerosis.">Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis.</a> Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).</li><li>von Zychlinski, A., Kleffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+proteome+of+lipoproteins:+New+biomarkers+for+cardiovascular+diseases.">Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases.</a> Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+CIII+Deficiency+Protects+Against+Atherosclerosis+in+Knockout+Rabbits.">Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).</li><li>Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+Lipase+Inhibitor,+Nordihydroguaiaretic+Acid,+Aggravates+Metabolic+Phenotypes+and+Alters+HDL+Particle+Size+in+the+Western+Diet-Fed+db/db+Mice.">Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).</li><li>De Silva, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+human+apolipoprotein+C-III+in+transgenic+mice+results+in+an+accumulation+of+apolipoprotein+B48+remnants+that+is+corrected+by+excess+apolipoprotein+E.">Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).</li><li>Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+on-line+dual+enzymatic+method+for+simultaneous+quantification+of+cholesterol+and+triglycerides+in+lipoproteins+by+HPLC.">A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC.</a> Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).</li></ol>

היפרליפידמיה היא אחד מגורמי הסיכון החשובים ביותר של מחלה טרשת עורקים. לכן, ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה הוא לא רק חיוני לאבחון של חולי דיסליפידמיה, אלא גם חשוב לחקירה של מנגנונים מולקולריים של חילוף החומרים ליפופרוטאין וטרשת עורקים. במחקר זה, תיארנו את הפרוטוקול של בידוד וניתוח של ליפופר?...

דיסליפידמיה היא גורם הסיכון העיקרי של מחלה טרשת עורקים בעולם. רמות גבוהות של ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDLs) ורמות נמוכות של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDLs) קשורים קשר הדוק עם סיכון גבוה למחלות לב כלילית (CHD)1,2. בסביבה הקלינית, הן LDL-כולסטרול (LDL-C) והן HDL-כולסטרול (HDL-C) נמדדים באופן שגרתי באמצעות מנתח אוטומטי במעבדה קלינית3,4. למרות זאת, חיוני לנתח פרופילי ליפופרוטאין בפרטים לאבחון דיסליפידמיה וחקר חילוף החומרים של השומנים וטרשת עורקים בבעלי חיים אנושיים וניסיוניים. דווח על מספר שיטות לניתוח ליפופרוטאינים מפלזמה כגון אולטרה-צנטריפוגציה, כרומטוגרפיה של הדרת גודל [כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה (FPLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)], אלקטרופורזה על ידי ג'לים אגרוז ופוליאקרילמיד, תהודה מגנטית גרעינית ומשקעים כימיים סלקטיביים באמצעות פוליאניונים ואקציות דו-כיווניות או כימיקלים אחרים. בשנת 1950, הקבוצה של האוול הציעה לראשונה את המושג ליפופרוטאינים המוגדרים על ידי צפיפויות באמצעות ultracentrifugation וסיווגה אותם לצ'ילומיקרונים (CM), ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאינים בצפיפות בינונית (IDL), LDL ו- HDL5 ואילך, השיטה שונתה עוד יותר על ידי קבוצות אחרות6,7. עד כה, ultracentrifugation היא השיטה הפופולרית והאמינה ביותר בעוד הפרוטוקול המעשי עדיין אינו זמין. במאמר זה, ניסינו לתאר פרוטוקול קל לשימוש לבידוד קנה מידה קטן של פלזמה באמצעות ultracentrifugation צף צפיפות רציפה שתואר במקורבעבר 8. בידוד של שבעה שברי ליפופרוטאין פלזמה [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d = 1.02 g / mL), LDLs (d = 1.04 ו 1.06 g / mL), HDLs (d = 1.08, 1.10, ו 1.21 g/mL)] מאפשר לחוקרים לבצע ניתוח מקיף של ליפופרוטאינים והן של אפוליפופרוטאינים קומפוזיציוניים שלהם9,10,11. שלם שבעה ליפופרוטאינים בצפיפות רצופה ניתן להשתמש לניתוח פונקציות ליפופרוטאין וגם משרתים תא מבוסס במבחנה אסטרטגיות. פרוטוקול זה צריך להיות שימושי הן לאבחון קליני והן למחקר בסיסי. כאן השתמשנו פלזמה ארנב כדוגמה כדי להדגים טכניקה זו בעוד פלזמה ממינים אחרים ניתן ליישם באותו אופן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22-gauge needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2232S</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655101</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein A-I antibody</td>
			<td>LifeSpan BioSciences</td>
			<td>LS-C314186</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein B antibody</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-101-111</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein E antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB947</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>299-50101</td>
			<td>For apolipoprotein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>himac CF15RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closure</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132736</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>043-30921</td>
			<td>For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry heat block</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MD-01N</td>
			<td>For SDS-PAGE sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>590</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle ultracentrifuge rotor</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>357656</td>
			<td>TLA-120.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF menbrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumino image analyzer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For Western blotting, ImageQuant LAS 4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>SR-304</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader iMARK</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube</td>
			<td>INA-OPTIKA</td>
			<td>SC-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital agitator USBDbo</td>
			<td>Stovall Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti goat IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-035-003</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipids assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>433-36201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bromide</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>168-03475</td>
			<td>For density solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0377</td>
			<td>For SDS-PAGE and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit restrainer</td>
			<td>Natsume Seisakusho</td>
			<td>KN-318</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>T15A43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample buffer (2x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-20% gradient polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-12865</td>
			<td>For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>439-17501</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyicerides assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>432-40201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube slicer for thick-walled tube</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347960</td>
			<td>For lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>A95761</td>
			<td>Optima MAX-TL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blotting wet transfer system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation

ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה ו apolipoproteins הוא חלק חיוני לאבחון של דיסליפידמיה ומחקרים של חילוף החומרים של השומנים וטרשת עורקים. אמנם ישנן מספר שיטות לניתוח ליפופרוטאינים פלזמה, ultracentrifugation היא עדיין אחת השיטות הפופולריות והאמינות ביותר. בגלל הליך ההפרדה שלם שלה, שברי ליפופרוטאין מבודד בשיטה זו ניתן להשתמש לניתוח של ליפופרוטאינים, apolipoproteins, פרוטאומים, ומחקר פונקציונלי של ליפופרוטאינים עם תאים מתורבתים במבחנה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שבעה שברי ליפופרוטאין כולל VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d = 1.02 g / mL), LDLs (d = 1.04 ו 1.06 g / mL), HDLs (d = 1.08, 1.10, ו 1.21 g/mL) מפלזמת ארנב באמצעות ultracentrifugation צף רציף. בנוסף, אנו מציגים לקוראים כיצד לנתח אפוליפופרוטאינים כגון apoA-I, apoB, ו apoE על ידי SDS-PAGE ו blotting המערבי ולהראות תוצאות מייצגות של פרופילי ליפופרוטאין ו apolipoprotein באמצעות מודלים ארנב היפרליפידמי. שיטה זו יכולה להפוך לפרוטוקול סטנדרטי הן עבור רופאים והן עבור מדענים בסיסיים כדי לנתח פונקציות ליפופרוטאין.

באמצעות פרוטוקול זה, בודדנו ליפופרוטאינים ארנב באמצעות 1 מ"ל של פלזמה והשגנו שבעה שברי צפיפות. שברי צפיפות מבודדים מספיקים למדידת שומנים ואפוליפופרוטאינים כמתואר לעיל לרוב מטרות המחקר. אותו הליך יכול לשמש גם עבור בידוד ליפופרוטאינים פלזמה ממינים אנושיים ואחרים. עבור בעלי חיים קטנים כגון ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

מספר שיטות שימשו לניתוח ליפופרוטאינים פלזמה; עם זאת, ultracentrifugation היא עדיין אחת השיטות הפופולריות והאמינים ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לגבי איך לבודד ליפופרוטאינים מפלזמה באמצעות ultracentrifugation צפיפות רציפה וכיצד לנתח את apolipoproteins הן למטרות אבחון ומחקר.

בידוד וניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה על ידי Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה חשוב מאוד לאבחון של היפרליפידמיה וחקירת טרשת עורקים. בפרוטוקול זה, נציג את השיטה הבסיסית באמצעות ultracentrifugation לבודד ליפופרוטאינים פלזמה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להשתמש מיליליטר אחד של פלזמה כדי לבודד שבעה שברי ליפופרוטאין.שברים אלה יכולים לשמש עבור שומנים, apolipoproteins, כמו גם מחקרים פונקציונליים שיטה זו יכולה להיות מיושמת עבור דגימות אנושיות ובעלי חיים לאבחון של דיסליפידמיה והמחלה הקשורה. התחל על ידי העברת מיליליטר אחד של פלזמה לתוך כל צינור ultracentrifuge פוליקרבונט. ואז לטעון את הצינורות ברוטור זווית קבועה צנטריפוגה הפלזמה ב 356, 000 פעמים G במשך 2.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס.התאם את מיקום הלהב בכלי הפריסה של הצינור לרמה שבין השבר העליון לשבר התחתון. חותכים את הצינורות באמצעות כלי פריסה ולאסוף את החלק העליון, כ 200 microliters, לתוך צינור מיקרו חדש. לאסוף את החלק התחתון הנותר לתוך צינור אולטרה סנטריפוגה פוליקרבונט חדש עבור ההפרדה הבאה.כוונן את עוצמת הקול הכוללת ל- 800 מיקרוליטרים על-ידי הוספת אותו פתרון צפיפות. להתאים את החלק התחתון לצפיפות של 1.02 גרם למיליליטר על ידי הוספת 58.9 microliters של 1.21 גרם לכל פתרון מיליליטר, ו 141.1 microliters של 1.02 גרם לכל פתרון מיליליטר עבור נפח כולל של מיליליטר אחד. לטעון צינורות אלה רוטור זווית קבועה צנטריפוגה ב 356, 000 פעמים G במשך 2.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס.המשך לאסוף שברים עליונים, להתאים את הצפיפות של שברים תחתונים, וצנטריפוגות עבור צפיפות שברים של 1.02, 1.04, 1.06, 1.08, 1.1, ו 1.21 גרם למיליליטר. עבור ultracentrifugation הסופי, צנטריפוגה ב 513, 000 פעמים G במשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס. פרופילי ליפופרוטאין של ארנבים האכילו דיאטה סטנדרטית נורמלית או דיאטה כולסטרול גבוה מוצגים כאן.ארנבים הם אוכלי עשב, ולכן רמות הפלזמה TC, TG ו- PL שלהם נמוכות בדרך כלל מאלה של בני אדם ועכברים. בארנבים רגילים הניזונים מתזונה מתזונה, TC מופץ בעיקר ב- HDL3 וב- LDL. בארנבים מסוג פראי בתזומה סטנדרטית רגילה, 39% מהפלזמה TG מופצים ב- VLDLs, ואילו 57% מ- PL הפלזמה כלול ב- HDL3.כאשר ארנבים אותגרו עם דיאטה עתירת כולסטרול, הם פיתחו במהירות היפרכולסטרולמיה. פרופילי ליפופרוטאין שלהם התאפיינו על ידי הגבהה ניכרת של VLDLs. שבעה שברי ליפופרוטאין מארנבים מסוג בר האכילו או תקן רגיל או דיאטה עתירת כולסטרול נוהלו על ג'ל פוליאקרילאמיד SDS ו דמיינו עם כתמי CBB.בדיאטה עתירת כולסטרול, הן ApoB-100 והן תוכן ApoE ב- VLDLs, IDLs ו- LDLs היו גבוהים במידה ניכרת. סופג מערבי שימש להשוואת אפוליפופרוטאינים ופרופילי ליפופרוטאין של שלושה ארנבים היפרליפידמיים שונים: ארנבים מסוג בר שניזון מתזונת דיאטה עתירת כולסטרול, ארנבות נוקאאוט של ApoE וארנבות היפרליפידמיים וואטנבה הריטיבל עם מחסור בקולטן LDL. ה- ApoB המכיל חלקיקים של ארנבים מסוג בר הניזונים מתזונת דיאטה עתירת כולסטרול מאופיינים בתכולת ApoB-100 ו- ApoE מוגברת, ואילו ארנבי נוקאאוט של ApoE הראו עלייה של ApoB-48 יחד עם המראה של ApoA-1.ארנבים Hyperlipidemic וואטנבה Heritable הם לקוי גנטית בתפקודי קולטן LDL, כך עלייה ניכרת של ApoB-100 ב LDLs מלווה ApoA-1 מופחת ב HDLs נצפתה, בדומה לחולי היפרכולסטרולמיה משפחתית אנושית. שחזור לדוגמה הוא הקריטי ביותר בהליך זה. כדי למזער את אובדן המדגם, יש להיזהר לאסוף שבר ולהמיס לחלוטין משקעים צמיגים בחלק התחתון.לאחר איסוף של שבעה שברי ליפופרוטאין, דיאליזה נדרשת למיון. לאחר השלמת הדיאליזה, דגימות ליפופרוטאינים לניתוח באמצעות דף SDS, סופג מערבי, ומחקר מבוסס תאים. בסביבה הקלינית, ultracentrifugation בדרך כלל מפריד ליפופרוטאינים לארבעה שברים.השיטה הנוכחית יכולה לבודד שבעה שברי ליפופרוטאינים, אשר מספק פרטים נוספים של ליפופרוטאינים לחקירה של היפרליפידמיה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...