Name: isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation
Uploaded: 2021-01-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

이 작품은 JSPS KAKENHI 그랜트 번호 JP 20K08858, 중국 국립 자연과학 재단 (81941001 및 81770457) 일본 - 중국 연구 협력 프로그램에 따라 JSPS-CAS의 연구 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.

토끼 연구를위한 모든 절차는 야마나시 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인으로 수행되었다 (승인 번호: A28-39).
1. 토끼 혈액에서 플라즈마 분리
<ol><li>혈액 수집을 위해 0.5 M EDTA (pH 8.0)의 15 μL을 포함하는 1.5 mL 마이크로튜브를 준비하십시오.</li>
	<li>토끼를 제지에 넣고 22 게이지 바늘을 사용하여 대동맥 중간 동맥에 구멍을 뚫고 튜브에 혈액을 수집합니다. EDTA와 혈액...

<ol>
	<li>Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+as+a+protective+factor+against+coronary+heart+disease:+The+Framingham+study.">High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study.</a> The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).</li><li>Baigent, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+cholesterol-lowering+treatment:+prospective+meta-analysis+of+data+from+90,056+participants+in+14+randomised+trials+of+statins.">Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins.</a> Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).</li><li>Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Measurement+of+LDL-Cholesterol:+A+Critical+Assessment+of+Direct+Measurement+by+Homogeneous+Assays+versus+Calculation.">Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation.</a> Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).</li><li>Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Methods+for+Measurement+of+HDL-Cholesterol:+From+Ultracentrifugation+to+Homogeneous+Assays.">Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).</li><li>Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+chemical+composition+of+ultracentrifugally+separated+lipoproteins+in+human+serum.">The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).</li><li>Hatch, F. T., Lees, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Methods+for+Plasma+Lipoprotein+Analysis.">Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis.</a> Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).</li><li>Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+lipoprotein+measurements+in+a+normal+adult+American+population.">Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population.</a> Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatic+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+a+marked+reduction+of+plasma+high+density+lipoproteins+and+intermediate+density+lipoproteins.">Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Apolipoprotein+A-II+Protects+Against+Diet-Induced+Atherosclerosis+in+Transgenic+Rabbits.">Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).</li><li>Niimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+knockout+rabbits:+A+novel+model+for+the+study+of+human+hyperlipidemia.">ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia.</a> Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+Cholesteryl+Ester+Transfer+Protein+Protects+Against+Atherosclerosis+in+RabbitsHighlights.">Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Lipase+Exerts+its+Anti-Atherogenic+Effect+through+Increased+Catabolism+of+&#946;-VLDLs.">Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of &#946;-VLDLs.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Lipoprotein+Lipase+in+Transgenic+Rabbits+Inhibits+Diet-induced+Hypercholesterolemia+and+Atherosclerosis.">Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).</li><li>Koike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Human+ApoAII+in+Transgenic+Rabbits+Leads+to+Dyslipidemia:+A+New+Model+for+Combined+Hyperlipidemia.">Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).</li><li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+lipoprotein+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+increased+small+dense+LDL+in+plasma+and+promotes+atherosclerosis.">Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis.</a> Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).</li><li>von Zychlinski, A., Kleffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+proteome+of+lipoproteins:+New+biomarkers+for+cardiovascular+diseases.">Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases.</a> Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+CIII+Deficiency+Protects+Against+Atherosclerosis+in+Knockout+Rabbits.">Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).</li><li>Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+Lipase+Inhibitor,+Nordihydroguaiaretic+Acid,+Aggravates+Metabolic+Phenotypes+and+Alters+HDL+Particle+Size+in+the+Western+Diet-Fed+db/db+Mice.">Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).</li><li>De Silva, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+human+apolipoprotein+C-III+in+transgenic+mice+results+in+an+accumulation+of+apolipoprotein+B48+remnants+that+is+corrected+by+excess+apolipoprotein+E.">Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).</li><li>Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+on-line+dual+enzymatic+method+for+simultaneous+quantification+of+cholesterol+and+triglycerides+in+lipoproteins+by+HPLC.">A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC.</a> Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).</li></ol>

고지혈증은 동맥 경화성 질환의 가장 중요한 위험 요소 중 하나입니다. 따라서, 플라즈마 지단백질의 분석은 이상지질혈증 환자의 진단에 필수적일 뿐만 아니라 지단백질 대사와 죽상 동맥 경화증의 분자 기계장치의 조사에또한 중요합니다. 이 연구에서는 극심분리가 가능한 실험실에서 적용될 수 있는 혈장 지단백질의 격리 및 분석 프로토콜을 설명했습니다. 이 방법에 의해 얻은 정보는 포괄?...

이상지질혈증은 세계에서 죽상 경화성 질환의 주요 위험 요소입니다. 저밀도 지단백(LdL) 및 저농도 고밀도 지단백(HDL)의 높은 수준은 관상 동맥 심장질환(CHD)1,2의고위험과 밀접한 관련이 있다. 임상 환경에서, LDL 콜레스테롤(LDL-C)과 HDL-콜레스테롤(HDL-C)은 임상 실험실3,4에서자동화된 분석기를 사용하여 일상적으로 측정된다. 그럼에도 불구 하 고, 이상 지질 혈 증의 진단 및 인간 및 실험 동물에 지질 대사와 동맥 경화증의 연구에 대 한 세부 사항에 지 단 단 프로파일을 분석 하는 것이 필수적이다. 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피[빠른 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)], 아가로즈 및 다극성 겔, 핵자기 공명, 선택적 화학적 흡기 등의 플라즈마 지단백질을 분석하는 몇 가지 방법이 보고되었다. 1950년대에 하벨 그룹은 먼저 초원심분리를 사용하여 밀도에 의해 정의된 지단백질개념을 제안하고 chylomicrons(CM), 매우 저밀도 지단백(VLDL), 중밀도 지단백질(IDL), LDL 및 HDL5로 분류하여 다른그룹,6개군에 의해 더 수정되었다. 지금까지, 초원심 분리는 실용적인 프로토콜을 아직 사용할 수없는 동안 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 논문에서는 이전에 설명한 순차 밀도 부동 초원심분리기를 사용하여 소량의 플라즈마를 격리하기 위한 사용하기 쉬운 프로토콜을 설명하려고시도하였다. 7개의 플라즈마 지단백질 분획 [VLDL(d&1.006 g/mL), IDL(d=1.02 g/mL), LDL(d=1.04 및 1.06 g/mL), HDL(d=1.08), HDL(d=1.08) 1.10, 및 1.21 g/mL)]을 통해 연구자들은 지단백질과 그들의 조성성 아폴리포단백질9,10,11모두에대한 광범위한 분석을 할 수 있다. 그대로 7개의 연속밀도 지단백은 지단백질 기능을 분석하고 세포 기반 체외 전략에도 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 임상 진단과 기본 연구 모두에 유용해야합니다. 여기서 우리는 토끼 플라즈마를 다른 종의 플라즈마가 동일한 방식으로 적용 할 수있는 동안이 기술을 입증하는 예로 사용했습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22-gauge needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2232S</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655101</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein A-I antibody</td>
			<td>LifeSpan BioSciences</td>
			<td>LS-C314186</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein B antibody</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-101-111</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein E antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB947</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>299-50101</td>
			<td>For apolipoprotein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>himac CF15RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closure</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132736</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>043-30921</td>
			<td>For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry heat block</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MD-01N</td>
			<td>For SDS-PAGE sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>590</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle ultracentrifuge rotor</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>357656</td>
			<td>TLA-120.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF menbrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumino image analyzer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For Western blotting, ImageQuant LAS 4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>SR-304</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader iMARK</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube</td>
			<td>INA-OPTIKA</td>
			<td>SC-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital agitator USBDbo</td>
			<td>Stovall Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti goat IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-035-003</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipids assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>433-36201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bromide</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>168-03475</td>
			<td>For density solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0377</td>
			<td>For SDS-PAGE and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit restrainer</td>
			<td>Natsume Seisakusho</td>
			<td>KN-318</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>T15A43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample buffer (2x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-20% gradient polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-12865</td>
			<td>For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>439-17501</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyicerides assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>432-40201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube slicer for thick-walled tube</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347960</td>
			<td>For lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>A95761</td>
			<td>Optima MAX-TL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blotting wet transfer system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation

플라즈마 지단백질과 아폴리포단백질의 분석은 지질 대사와 죽상 동맥 경화증의 이상지질혈증 진단 및 연구 결과를 위한 필수적인 부분입니다. 플라즈마 지단백질을 분석하기 위한 몇 가지 방법이 있지만, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수 있는 방법 중 하나입니다. 그것의 그대로 분리 절차 때문에, 이 방법에 의해 고립된 지단백질 분획은 지단백질, apolipoproteins, proteomes 및 시험관내 배양된 세포를 가진 지단백질의 기능적인 연구 결과에 이용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 VLDL (d&1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL (d=1.04 및 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, 및 1.21 g/mL)를 포함하는 7개의 지단백질 분획을 격리하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한, SDS-PAGE 및 서양 블로팅에 의해 아포아-I, apoB 및 apoE와 같은 아포포단백질을 분석하고 고지립 토끼 모델을 사용하여 지단백질 및 아폴리포단백질 프로파일의 대표적인 결과를 보여주는 방법을 독자에게 소개합니다. 이 방법은 임상의와 기초 과학자 모두에게 지단백질 기능을 분석하는 표준 프로토콜이 될 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 플라즈마의 1 mL를 사용하여 토끼 지단백질을 격리하고 일곱 밀도 분획을 얻었다. 고립 된 밀도 분획은 대부분의 연구 목적을 위해 위에서 설명한 것과 같이 지질과 아폴리포단백질을 측정하기에 충분합니다. 동일한 절차는 또한 인간과 그밖 종에서 플라즈마 지단백질을 격리하기 위해 이용될 수 있습니다. 마우스와 같은 작은 크기의 동물의 경우 풀링 된 플라즈?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

혈장 지단백질을 분석하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었습니다. 그러나, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법 중 하나입니다. 여기서는 순차밀도 극심분리를 이용하여 플라즈마로부터 지단백질을 분리하는 방법과 진단 및 연구 목적으로 아폴리포단백질을 분석하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

극심분리에 의한 혈장 지단백질의 격리 및 분석

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

혈장 지단백질의 분석은 고지혈증의 진단 및 동맥 경화증의 조사를 위해 아주 중요합니다. 이 프로토콜은 극성 심분리를 사용하여 플라즈마 지단백질을 분리하는 기본 방법을 소개합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 플라즈마 1밀리리터를 사용하여 7개의 지단백질 분획을 분리할 수 있습니다.이러한 분획은 지질, 아폴리포단백질뿐만 아니라 기능성 연구에 사용될 수 있으며, 이 방법은 이지질혈증 및 관련 질환의 진단을 위해 인간 및 동물 샘플 모두에 적용될 수 있다. 각 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브에 플라즈마 1밀리리터를 전송하여 시작합니다. 그런 다음 튜브를 고정 각도 로터에 넣고 플라즈마를 섭씨 356, 000배 G에서 섭씨 4도에서 2.5시간 동안 로드합니다.튜브 슬라이서의 블레이드 위치를 상단 분획과 아래쪽 분수 사이의 수준으로 조정합니다. 슬라이서를 사용하여 튜브를 자르고 상위 분획인 약 200 마이크로리터를 새로운 마이크로 튜브로 수집합니다. 다음 분리를 위해 나머지 바닥 분획을 새로운 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브로 수집합니다.동일한 밀도 솔루션을 추가하여 총 볼륨을 800 마이크로리터로 조정합니다. 밀리리터 용액당 58.9 마이크로리터 1.21그램, 밀리리터 용액 당 1.02그램의 141.1 마이크로리터를 1밀리리터의 총 부피에 1.02그램의 마이크로리터를 추가하여 밀리리터당 1.02그램의 밀도로 바닥 분수를 조정합니다. 고정 각도 로터와 원심분리기에서 이 튜브를 섭씨 4도에서 2.5시간 동안 000배 G로 로드합니다.밀리리터당 1.02, 1.04, 1.06, 1.08, 1.1 및 1.21그램의 분수 밀도에 대해 상단 분획을 계속 수집하고, 바닥 분수의 밀도를 조정하고, 원심분리를 합니다. 최종 초원심분리기의 경우, 원심분리기는 섭씨 4도에서 4시간 동안 513회, 000배 G입니다. 일반적인 표준 규정식 또는 높은 콜레스테롤 규정식을 공급하는 토끼의 지단백질 단면도는 여기에서 표시됩니다.토끼는 초식 동물, 그래서 그들의 혈장 TC, TG, 그리고 PL 수준은 일반적으로 인간과 마우스의 그 보다는 더 낮습니다. 정상적인 표준 다이어트 먹이 토끼에서, TC는 주로 HDL3 및 LDL에 분포. 일반적인 표준 식단에 야생 형 토끼에서, 플라즈마 TG의 39 %는 VLDLs에 분포, 플라즈마 PL의 57 %는 HDL3에 포함되어 있습니다.토끼는 높은 콜레스테롤 다이어트와 도전 했을 때, 그들은 신속 하 게 콜레스테롤 혈 증을 개발. 그들의 지단백질 단면도는 VLDLs의 표시된 고도에 의해 특징지어졌습니다. 야생 형 토끼에서 7 개의 지단백질 분획은 일반적인 표준 또는 고콜레스테롤 규정식을 공급하는 SDS polyacrylamide 젤에 실행되고 CBB 염색으로 시각화되었습니다.고콜레스테롤 식단에서, VLDL, IdL 및 LdL에 있는 ApoB-100 및 ApoE 내용 둘 다 현저하게 상승했습니다. 서양 블로팅은 세 가지 다른 고지질 토끼의 아포포단백질과 지단백질 프로파일을 비교하는 데 사용되었다: 높은 콜레스테롤 다이어트 먹이 야생 형 토끼, ApoE 녹아웃 토끼, LDL 수용체 결핍과 와타나베 헤립성 고지질 토끼. 고콜레스테롤 식이요법 야생형 토끼의 입자를 함유한 ApoB는 ApoB-100 및 ApoE 함량증가를 특징으로 하는 반면, 아포에 녹아웃 토끼는 ApoA-1의 출현과 함께 ApoB-48의 증가를 보였다.와타나베 유전성 고지립성 토끼는 LDL 수용체 기능에서 유전적으로 결핍되어, 그래서 LDL에서 감소된 ApoA-1을 동반하여 LdL에서 ApoB-100의 현저한 증가를 관찰하였음, 인간 가족 성 고콜레스테롤혈증 환자와 유사하게 관찰되었다. 샘플 복구는 이 절차에서 가장 중요합니다. 시료 손실을 최소화하기 위해 분획을 수집하고 점성 강수량을 바닥 분획에서 완전히 용해하도록 주의해야 합니다.7개의 지단백질 분획의 집합 후에, 투석은 분류를 위해 요구됩니다. 투석이 완료되면, 지단백질은 SDS 페이지, 서부 블로팅 및 세포 기반 연구를 사용하여 분석을 위해 샘플을 채취한다. 임상 환경에서, 초원심분리는 일반적으로 지단백질을 4개의 분수로 분리합니다.현재 방법은 고지혈증의 조사를 위한 지단백질의 더 많은 세부사항을 제공하는 7개의 지단백질 분수를 격리할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

연구

생화학

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

살아있는 세포의 원형질막에서의 분자 확산 분석을위한 스팟 변이 형광 상관 분광법

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...