Name: isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation
Uploaded: 2021-01-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av ett forskningsanslag från JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, National Natural Science Foundation of China (nr 81941001 och 81770457), JSPS-CAS under Japan-China Research Cooperative Program.

Alla procedurer för kaninstudier utfördes med godkännande av University of Yamanashi Institutional Animal Care and Use Committee (Godkänt nummer: A28-39).
1. Plasmaseparation från kaninblod
<ol><li>Förbered 1,5 ml mikrorör innehållande 15 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) för blodinsamling.</li>
	<li>Sätt en kanin i en fasthållningshållare och punktera en auricular mellanliggande artär med en 22 gauge nål och samla blod i ett rör. Blanda blodet försiktigt med EDTA och lägg dem på is....

<ol>
	<li>Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+as+a+protective+factor+against+coronary+heart+disease:+The+Framingham+study.">High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study.</a> The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).</li><li>Baigent, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+cholesterol-lowering+treatment:+prospective+meta-analysis+of+data+from+90,056+participants+in+14+randomised+trials+of+statins.">Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins.</a> Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).</li><li>Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Measurement+of+LDL-Cholesterol:+A+Critical+Assessment+of+Direct+Measurement+by+Homogeneous+Assays+versus+Calculation.">Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation.</a> Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).</li><li>Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Methods+for+Measurement+of+HDL-Cholesterol:+From+Ultracentrifugation+to+Homogeneous+Assays.">Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).</li><li>Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+chemical+composition+of+ultracentrifugally+separated+lipoproteins+in+human+serum.">The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).</li><li>Hatch, F. T., Lees, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Methods+for+Plasma+Lipoprotein+Analysis.">Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis.</a> Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).</li><li>Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+lipoprotein+measurements+in+a+normal+adult+American+population.">Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population.</a> Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatic+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+a+marked+reduction+of+plasma+high+density+lipoproteins+and+intermediate+density+lipoproteins.">Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Apolipoprotein+A-II+Protects+Against+Diet-Induced+Atherosclerosis+in+Transgenic+Rabbits.">Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).</li><li>Niimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+knockout+rabbits:+A+novel+model+for+the+study+of+human+hyperlipidemia.">ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia.</a> Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+Cholesteryl+Ester+Transfer+Protein+Protects+Against+Atherosclerosis+in+RabbitsHighlights.">Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Lipase+Exerts+its+Anti-Atherogenic+Effect+through+Increased+Catabolism+of+&#946;-VLDLs.">Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of &#946;-VLDLs.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Lipoprotein+Lipase+in+Transgenic+Rabbits+Inhibits+Diet-induced+Hypercholesterolemia+and+Atherosclerosis.">Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).</li><li>Koike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Human+ApoAII+in+Transgenic+Rabbits+Leads+to+Dyslipidemia:+A+New+Model+for+Combined+Hyperlipidemia.">Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).</li><li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+lipoprotein+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+increased+small+dense+LDL+in+plasma+and+promotes+atherosclerosis.">Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis.</a> Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).</li><li>von Zychlinski, A., Kleffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+proteome+of+lipoproteins:+New+biomarkers+for+cardiovascular+diseases.">Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases.</a> Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+CIII+Deficiency+Protects+Against+Atherosclerosis+in+Knockout+Rabbits.">Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).</li><li>Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+Lipase+Inhibitor,+Nordihydroguaiaretic+Acid,+Aggravates+Metabolic+Phenotypes+and+Alters+HDL+Particle+Size+in+the+Western+Diet-Fed+db/db+Mice.">Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).</li><li>De Silva, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+human+apolipoprotein+C-III+in+transgenic+mice+results+in+an+accumulation+of+apolipoprotein+B48+remnants+that+is+corrected+by+excess+apolipoprotein+E.">Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).</li><li>Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+on-line+dual+enzymatic+method+for+simultaneous+quantification+of+cholesterol+and+triglycerides+in+lipoproteins+by+HPLC.">A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC.</a> Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).</li></ol>

Hyperlipidemi är en av de viktigaste riskfaktorerna för åderförd sjukdom. Således är analys av plasma lipoproteiner inte bara avgörande för diagnos av dyslipidemi patienter men också viktigt för undersökning av molekylära mekanismer av lipoprotein metabolism och åderförkalkning. I denna studie beskrev vi protokollet om isolering och analys av plasma lipoproteiner som kan tillämpas i de laboratorier där ultracentrifugation är tillgänglig. Information som erhålls med denna metod är omfattande och enkel ...

Dyslipidemi är den största riskfaktorn för åderförd sjukdom i världen. Höga nivåer av lipoproteiner med låg densitet (LDLs) och låga nivåer av lipoproteiner med hög densitet (HDLs) är nära förknippade med en hög risk för kranskärlssjukdom (CHD)1,2. I den kliniska inställningen mäts både LDL-kolesterol (LDL-C) och HDL-kolesterol (HDL-C) rutinmässigt med hjälp av en automatiserad analysator i ett klinisktlaboratorium 3,4. Trots detta är det viktigt att analysera lipoproteinprofiler i detaljer för diagnos av dyslipidemi och studie av lipidmetabolism och åderförkalkning hos mänskliga och experimentella djur. Flera metoder har rapporterats för att analysera plasma lipoproteiner såsom ultracentrifugation, storlek uteslutning kromatografi [snabb protein flytande kromatografi (FPLC) och högpresterande flytande kromatografi (HPLC)], elektrofores av agarose och polyacrylamid geler, kärnmagnetisk resonans och selektiv kemisk nederbörd med hjälp av polyanioner och divalent cations eller andra kemikalier. På 1950-talet föreslog Havels grupp först begreppet lipoproteiner definierade av densiteter med ultracentrifugation och klassificerade dem i chylomicroner (CM), lipoproteiner med mycket låg densitet (VLDL), lipoproteiner med medelhög densitet (IDL), LDL och HDL5 och senare ändrades metoden ytterligare av andra grupper6,7. Hittills är ultracentrifugation den mest populära och pålitliga metoden medan det praktiska protokollet fortfarande inte är tillgängligt. I detta dokument försökte vi beskriva ett lättanmåt anförande protokoll för att isolera en liten skala av plasma med sekventiell densitet flytande ultracentrifugation ursprungligen beskrivs tidigare8. Isolering av sju plasmalipoproteinfraktioner [VLDL (d<1,006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 och 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1,10 och 1,21 g/ml)] gör det möjligt för forskare att göra en omfattande analys av både lipoproteiner och deras kompositionella apolipoproteiner9,10,11. De intakta sju på varandra följande densitet lipoproteiner kan användas för att analysera lipoprotein funktioner och även tjäna till cellbaserade in vitro strategier. Detta protokoll bör vara användbart för både klinisk diagnos och grundforskning. Här använde vi kaninplasma som exempel för att demonstrera denna teknik medan plasma från andra arter kan appliceras på samma sätt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22-gauge needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2232S</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655101</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein A-I antibody</td>
			<td>LifeSpan BioSciences</td>
			<td>LS-C314186</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein B antibody</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-101-111</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein E antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB947</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>299-50101</td>
			<td>For apolipoprotein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>himac CF15RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closure</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132736</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>043-30921</td>
			<td>For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry heat block</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MD-01N</td>
			<td>For SDS-PAGE sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>590</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle ultracentrifuge rotor</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>357656</td>
			<td>TLA-120.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF menbrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumino image analyzer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For Western blotting, ImageQuant LAS 4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>SR-304</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader iMARK</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube</td>
			<td>INA-OPTIKA</td>
			<td>SC-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital agitator USBDbo</td>
			<td>Stovall Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti goat IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-035-003</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipids assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>433-36201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bromide</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>168-03475</td>
			<td>For density solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0377</td>
			<td>For SDS-PAGE and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit restrainer</td>
			<td>Natsume Seisakusho</td>
			<td>KN-318</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>T15A43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample buffer (2x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-20% gradient polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-12865</td>
			<td>For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>439-17501</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyicerides assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>432-40201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube slicer for thick-walled tube</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347960</td>
			<td>For lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>A95761</td>
			<td>Optima MAX-TL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blotting wet transfer system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation

Analys av plasma lipoproteiner och apolipoproteiner är en viktig del för diagnos av dyslipidemi och studier av lipid metabolism och åderförkalkning. Även om det finns flera metoder för att analysera plasma lipoproteiner, är ultracentrifugation fortfarande en av de mest populära och tillförlitliga metoderna. På grund av dess intakta separation förfarande, lipoprotein fraktioner isolerade med denna metod kan användas för analys av lipoproteiner, apolipoproteiner, proteomer och funktionell studie av lipoproteiner med odlade celler in vitro. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att isolera sju lipoproteinfraktioner inklusive VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 och 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1,10 och 1,21 g/ml) från kaninplasma med sekventiell flytande ultracentrifugering. Dessutom introducerar vi läsarna hur man analyserar apolipoproteiner som apoA-I, apoB och apoE av SDS-PAGE och Western blotting och visar representativa resultat av lipoprotein- och apolipoproteinprofiler med hyperlipidemic kaninmodeller. Denna metod kan bli ett standardprotokoll för både kliniker och grundläggande forskare för att analysera lipoproteinfunktioner.

Med hjälp av detta protokoll isolerade vi kanin lipoproteiner med 1 ml plasma och erhöll sju densitet fraktioner. Isolerade densitetsfraktioner är tillräckliga för att mäta lipider och apolipoproteiner enligt beskrivningen ovan för de flesta forskningsändamål. Samma förfarande kan också användas för att isolera plasmalipoproteiner från människor och andra arter. För små djur som möss krävs poolad plasma. Figur 3 visar lipoproteinprofiler av vilda (WT) kaniner som matas ant...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Flera metoder har använts för att analysera plasma lipoproteiner; Ultracentrifugation är dock fortfarande en av de mest populära och pålitliga metoderna. Här beskriver vi en metod för hur man isolerar lipoproteiner från plasma med hjälp av sekventiell densitet ultracentrifugation och hur man analyserar apolipoproteinerna för både diagnostiska och forskningsändamål.

Isolering och analys av plasma lipoproteiner genom ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Analys av plasma lipoproteiner är mycket viktigt för diagnos av hyperlipidemi och undersökning av åderförkalkning. I är detta protokoll, vi kommer att införa den grundläggande metoden med ultracentrifugation för att isolera plasma lipoproteiner. Denna metod gör det möjligt för forskarna att använda en milliliter plasma för att isolera sju lipoproteinfraktioner.Dessa fraktioner kan användas för lipider, apolipoproteiner samt välfunktionella studier Denna metod kan tillämpas för både mänskliga och animaliska prover för diagnos av dyslipidemi och relaterad sjukdom. Börja med att överföra en milliliter plasma till varje polykarbonat ultracentrifugerör. Ladda sedan rören i en fast vinkelrotor och centrifugera plasman vid 356 000 gånger G i 2,5 timmar vid fyra grader Celsius.Justera bladets position i rörhyveln till en nivå mellan den övre fraktionen och den nedre fraktionen. Skär rören med en skärare och samla den övre fraktionen, cirka 200 mikroliter, i ett nytt mikrorör. Samla den återstående bottenfraktionen i ett nytt polykarbonat ultracentrifugerör för nästa separation.Justera den totala volymen till 800 mikroliter genom att tillsätta samma densitetslösning. Justera den nedre fraktionen till en densitet på 1,02 gram per milliliter genom att tillsätta 58,9 mikroliter på 1,21 gram per milliliterlösning och 141,1 mikroliter på 1,02 gram per milliliterlösning för en total volym på en milliliter. Ladda dessa rör i den fasta vinkelrotorn och centrifugera vid 356 000 gånger G i 2,5 timmar vid fyra grader Celsius.Fortsätt att samla toppfraktioner, justera densiteten för bottenfraktioner och centrifugera för fraktionstätheter på 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 och 1,21 gram per milliliter. För den slutliga ultracentrifuugationen, centrifugera vid 513, 000 gånger G i fyra timmar vid fyra grader Celsius. Lipoproteinprofiler av kaniner som matas antingen en normal standarddiet eller en hög kolesteroldiet visas här.Kaniner är växtätare, så deras plasma TC- och TG- och PL-nivåer är i allmänhet lägre än hos människor och möss. I normala standarddietmatade kaniner distribueras TC huvudsakligen i HDL3 och LDL. Hos vilda kaniner på en normal standarddiet distribueras 39% av plasma TG i VLDLs, medan 57% av plasma PL ingår i HDL3.När kaniner utmanades med en högkolesteroldiet utvecklade de snabbt hyperkolesterolemi. Deras lipoprotein profiler kännetecknades av markant höjning av VLDLs. Sju lipoprotein fraktioner från vilda typ kaniner matas antingen en normal standard eller en högkolesterol diet köras på en SDS polyakrylamid gel och visualiseras med CBB färgning.På en högkolesterol diet, både ApoB-100 och ApoE innehåll i VLDLs, IDLs och LDLs var markant förhöjda. Western blotting användes för att jämföra apolipoproteiner och lipoproteinprofiler av tre olika hyperlipidemic kaniner: högkolesterol dietmatade vilda typ kaniner, ApoE knockout kaniner och Watanabe Ärftliga hyperlipidemic kaniner med LDL receptor brist. ApoB som innehåller partiklar av högkolesterol dietmatade vilda kaniner kännetecknas av ökad ApoB-100 och ApoE innehåll, medan ApoE knockout kaniner visade en ökning av ApoB-48 tillsammans med utseendet på ApoA-1.Watanabe Heritable Hyperlipidemic kaniner är genetiskt bristfälliga i LDL receptor funktioner, så en markant ökning av ApoB-100 i LDLs åtföljs av minskad ApoA-1 i HDLs observerades, liknar mänskliga familjär hyperkolesterolemi patienter. Provåterställning är den mest kritiska i den här proceduren. För att minimera provförlusten bör man vara noga med att samla in fraktion och helt lösa upp trögflytande nederbörd i den nedre fraktionen.Efter insamlingen av sju lipoproteinfraktioner krävs dialys för sortering. När dialysen är klar tar lipoproteinproverna prover för analys med hjälp av SDS-sida, western blotting och cellbaserad studie. I den kliniska inställningen separerar ultracentrifugation vanligtvis lipoproteiner i fyra fraktioner.Den nuvarande metoden kan isolera sju lipoproteiner fraktioner, vilket ger mer detaljer om lipoproteiner för undersökning av hyperlipidemi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolering av hög-density lipoprotein för icke-kodande Small RNA Kvantifiering

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein matsmältningen, ultrafiltrering och storlek utslagning kromatografi att optimera isolering av Exosomes från mänsklig blodplasma och Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Mäta Trans-Plasma membran elektrontransport av C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Högupplöst Complexome-profilering genom att Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin kedjeanalys genom parallell reaktionsövervakning

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analys av peptidoglykan genom vätskekromatografi, masspektrometri och bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariation Fluorescenskorrelationsspektroskopi för analys av molekylär diffusion vid plasmamembranet i levande celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Densitet gradient ultracentrifugation för att undersöka endocytisk återvinning i däggdjursceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...