Name: isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation
Uploaded: 2021-01-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI'nin JP 20K08858, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81941001 ve 81770457), Japonya-Çin Araştırma Kooperatifi Programı kapsamında JSPS-CAS'tan aldığı araştırma hibeleri ile desteklendi.

Tavşan çalışmaları için tüm prosedürler Yamanashi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi (Onaylı sayı: A28-39).
1. Tavşan kanından plazma ayrımı
<ol><li>Kan almak için 15 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) içeren 1,5 mL mikrotüpler hazırlayın.</li>
	<li>Bir tavşanı bir kısıtlayıcıya koyun ve 22 kalibrelik bir iğne kullanarak bir asuriküler ara arteri delin ve bir tüpe kan toplayın. Kanı EDTA ile hafifçe karıştırın ...

<ol>
	<li>Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+as+a+protective+factor+against+coronary+heart+disease:+The+Framingham+study.">High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study.</a> The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).</li><li>Baigent, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+cholesterol-lowering+treatment:+prospective+meta-analysis+of+data+from+90,056+participants+in+14+randomised+trials+of+statins.">Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins.</a> Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).</li><li>Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Measurement+of+LDL-Cholesterol:+A+Critical+Assessment+of+Direct+Measurement+by+Homogeneous+Assays+versus+Calculation.">Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation.</a> Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).</li><li>Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Methods+for+Measurement+of+HDL-Cholesterol:+From+Ultracentrifugation+to+Homogeneous+Assays.">Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).</li><li>Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+chemical+composition+of+ultracentrifugally+separated+lipoproteins+in+human+serum.">The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).</li><li>Hatch, F. T., Lees, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Methods+for+Plasma+Lipoprotein+Analysis.">Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis.</a> Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).</li><li>Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+lipoprotein+measurements+in+a+normal+adult+American+population.">Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population.</a> Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatic+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+a+marked+reduction+of+plasma+high+density+lipoproteins+and+intermediate+density+lipoproteins.">Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Apolipoprotein+A-II+Protects+Against+Diet-Induced+Atherosclerosis+in+Transgenic+Rabbits.">Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).</li><li>Niimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+knockout+rabbits:+A+novel+model+for+the+study+of+human+hyperlipidemia.">ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia.</a> Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+Cholesteryl+Ester+Transfer+Protein+Protects+Against+Atherosclerosis+in+RabbitsHighlights.">Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Lipase+Exerts+its+Anti-Atherogenic+Effect+through+Increased+Catabolism+of+&#946;-VLDLs.">Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of &#946;-VLDLs.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Lipoprotein+Lipase+in+Transgenic+Rabbits+Inhibits+Diet-induced+Hypercholesterolemia+and+Atherosclerosis.">Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).</li><li>Koike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Human+ApoAII+in+Transgenic+Rabbits+Leads+to+Dyslipidemia:+A+New+Model+for+Combined+Hyperlipidemia.">Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).</li><li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+lipoprotein+lipase+in+transgenic+rabbits+leads+to+increased+small+dense+LDL+in+plasma+and+promotes+atherosclerosis.">Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis.</a> Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).</li><li>von Zychlinski, A., Kleffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+proteome+of+lipoproteins:+New+biomarkers+for+cardiovascular+diseases.">Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases.</a> Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+CIII+Deficiency+Protects+Against+Atherosclerosis+in+Knockout+Rabbits.">Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).</li><li>Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+Lipase+Inhibitor,+Nordihydroguaiaretic+Acid,+Aggravates+Metabolic+Phenotypes+and+Alters+HDL+Particle+Size+in+the+Western+Diet-Fed+db/db+Mice.">Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).</li><li>De Silva, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+human+apolipoprotein+C-III+in+transgenic+mice+results+in+an+accumulation+of+apolipoprotein+B48+remnants+that+is+corrected+by+excess+apolipoprotein+E.">Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).</li><li>Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+on-line+dual+enzymatic+method+for+simultaneous+quantification+of+cholesterol+and+triglycerides+in+lipoproteins+by+HPLC.">A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC.</a> Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).</li></ol>

Hiperlipidemi aterosklerotik hastalığın en önemli risk faktörlerinden biridir. Bu nedenle, plazma lipoproteinlerinin analizi sadece dislipidemi hastalarının tanısı için değil, aynı zamanda lipoprotein metabolizması ve aterosklerozun moleküler mekanizmalarının araştırılması için de önemlidir. Bu çalışmada ultrasantrifüjasyonun mevcut olduğu laboratuvarlarda uygulanabilen plazma lipoproteinlerinin izolasyon ve analiz protokolünü anlattık. Bu yöntemle elde edilen bilgiler kapsamlı ve basittir...

Dislipidemi dünyada aterosklerotik hastalığın başlıca risk faktörüdür. Yüksek düzeyde düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL'ler) ve düşük yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL' ler) yüksek koroner kalp hastalığı riski (CHD)1,2ile yakından ilişkilidir. Klinik ortamda, hem LDL-kolesterol (LDL-C) hem de HDL-kolesterol (HDL-C) rutin olarak bir klinik laboratuvarda otomatik bir analizör kullanılarak ölçülür3,4. Buna rağmen, dislipidemi tanısı ve insan ve deney hayvanlarında lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışması için lipoprotein profillerini ayrıntılı olarak analiz etmek önemlidir. Ultrasantrifüjasyon, boyut dışlama kromatografisi [hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)], agarose ve poliakrilamid jeller tarafından elektroforez, nükleer manyetik rezonans ve seçici kimyasal çökeltme gibi plazma lipoproteinlerini polianyonlar ve divalent katyonlar veya diğer kimyasallar kullanılarak analiz etmek için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. 1950'lerde Havel'in grubu ilk olarak ultrasantrifüjleme kullanan yoğunluklar tarafından tanımlanan lipoprotein kavramını önerdi ve bunları chylomicrons (CM), çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL), orta yoğunluklu lipoproteinler (IDL), LDL ve HDL5 ve daha sonra diğer gruplar tarafından daha da değiştirildi6,7. Şimdiye kadar, ultrasantrifüjleme en popüler ve güvenilir yöntemdir, ancak pratik protokol hala mevcut değildir. Bu yazıda, başlangıçta daha önce açıklanan sıralı yoğunluklu yüzer ultrasantrifüjasyon kullanarak küçük bir plazma ölçeğini izole etmek için kullanımı kolay bir protokol tanımlamaya çalıştık8. Yedi plazma lipoprotein fraksiyonunun izolasyonu [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL)] araştırmacıların hem lipoproteinlerin hem debunlarınbileşimsel apolipoproteinleri 9 , 10,11'inkapsamlı bir analizini yapmasını sağlar. Sağlam yedi ardışık yoğunluklu lipoprotein, lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek ve ayrıca hücre bazlı in vitro stratejilere hizmet etmek için kullanılabilir. Bu protokol hem klinik tanı hem de temel araştırmalar için yararlı olmalıdır. Burada tavşan plazmasını örnek olarak diğer türlerden alınan plazma aynı şekilde uygulanabilirken bu tekniği göstermek için kullandık.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22-gauge needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2232S</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655101</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein A-I antibody</td>
			<td>LifeSpan BioSciences</td>
			<td>LS-C314186</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein B antibody</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-101-111</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-apolipoprotein E antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB947</td>
			<td>For Western blottng, use 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>299-50101</td>
			<td>For apolipoprotein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>himac CF15RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closure</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132736</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>043-30921</td>
			<td>For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry heat block</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MD-01N</td>
			<td>For SDS-PAGE sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>590</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle ultracentrifuge rotor</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>357656</td>
			<td>TLA-120.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF menbrane</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumino image analyzer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For Western blotting, ImageQuant LAS 4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>SR-304</td>
			<td>For lipoprotein dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader iMARK</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube</td>
			<td>INA-OPTIKA</td>
			<td>SC-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital agitator USBDbo</td>
			<td>Stovall Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti goat IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-035-003</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>For Western blotting, use 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipids assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>433-36201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bromide</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>168-03475</td>
			<td>For density solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0377</td>
			<td>For SDS-PAGE and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit restrainer</td>
			<td>Natsume Seisakusho</td>
			<td>KN-318</td>
			<td>For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td></td>
			<td>T15A43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample buffer (2x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-20% gradient polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>190-12865</td>
			<td>For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>439-17501</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyicerides assay kit</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>432-40201</td>
			<td>For lipids measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube slicer for thick-walled tube</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347960</td>
			<td>For lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>A95761</td>
			<td>Optima MAX-TL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blotting wet transfer system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of plasma lipoproteins by ultracentrifugation

Plazma lipoproteinlerinin ve apolipoproteinlerin analizi dislipidemi tanısı ve lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışmaları için önemli bir parçadır. Plazma lipoproteinlerini analiz etmek için çeşitli yöntemler olmasına rağmen, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Bozulmamış ayırma prosedürü nedeniyle, bu yöntemle izole edilen lipoprotein fraksiyonları, lipoproteinlerin, apolipoproteinlerin, proteomların analizi ve kültürlü hücreler in vitro ile lipoproteinlerin fonksiyonel çalışması için kullanılabilir. Burada, VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL) sıralı yüzer ultrasantrifüj kullanarak tavşan plazmasından. Buna ek olarak, okuyuculara SDS-PAGE ve Western blotting tarafından apoA-I, apoB ve apoE gibi apolipoproteinlerin nasıl analiz edeceğimizi tanıtıyoruz ve hiperlipidemik tavşan modellerini kullanarak lipoprotein ve apolipoprotein profillerinin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Bu yöntem hem klinisyenler hem de temel bilim adamları için lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek için standart bir protokol haline gelebilir.

Bu protokolü kullanarak, 1 mL plazma kullanarak tavşan lipoproteinlerini izole ettik ve yedi yoğunluk fraksiyonu elde ettik. İzole yoğunluk fraksiyonları, çoğu araştırma amacıyla yukarıda açıklandığı gibi lipitleri ve apolipoproteinleri ölçmek için yeterlidir. Aynı prosedür, plazma lipoproteinlerini insan ve diğer türlerden izole etmek için de kullanılabilir. Fareler gibi küçük boyutlu hayvanlar için havuzlanmış plazma gereklidir. Şekil 3, normal standart (NS...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation at JoVE.com

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Plazma lipoproteinlerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılmıştır; ancak, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Burada, sıralı yoğunluklu ultrasantrifüjasyon kullanarak lipoproteinlerin plazmadan nasıl izole edilmesi ve apolipoproteinlerin hem tanı hem de araştırma amacıyla nasıl analiz edilmesi ile ilgili bir yöntem açıklıyoruz.

Plazma Lipoproteinlerinin Ultracentrifugation ile İzolasyonu ve Analizi

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Plazma lipoproteinlerinin analizi hiperlipidemi tanısı ve aterosklerozun araştırılması için çok önemlidir. Bu protokolde, plazma lipoproteinlerini izole etmek için ultrasantrifüjasyon kullanarak temel yöntemi tanıtacağız. Bu yöntem, araştırmacıların yedi lipoprotein fraksiyonunu izole etmek için bir mililitre plazma kullanmalarını sağlar.Bu fraksiyonlar lipitler, apolipoproteinler ve iyi fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir Bu yöntem dislipidemi ve ilgili hastalığın tanısı için hem insan hem de hayvan örnekleri için uygulanabilir. Her polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne bir mililitre plazma aktararak başlayın. Daha sonra tüpleri sabit açılı bir rotora yükleyin ve plazmayı dört santigrat derecede 2,5 saat boyunca 356.000 kez G'de santrifüj edin.Bıçağın tüp dilimleyicideki konumunu üst fraksiyon ile alt fraksiyon arasındaki bir seviyeye ayarlayın. Tüpleri bir dilimleyici kullanarak kesin ve üst fraksiyonu, yaklaşık 200 mikrolitreyi yeni bir mikro tüpe toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın.Aynı yoğunluk çözümünü ekleyerek toplam hacmi 800 mikrolitreye ayarlayın. Mililitre çözelti başına 1,21 gramlık 58,9 mikrolitre ve toplam bir mililitre hacim için mililitre çözeltisi başına 1,02 gramlık 141,1 mikrolitre ekleyerek alt fraksiyonu mililitre başına 1,02 gram yoğunluğa ayarlayın. Bu tüpleri sabit açılı rotora ve santrifüje 356, 000 kez G'de dört santigrat derecede 2,5 saat boyunca yükleyin.Mililitre başına 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 ve 1,21 gram kesir yoğunlukları için üst kesirleri toplamaya, alt kesirlerin yoğunluğunu ayarlamaya ve santrifüjlemeye devam edin. Son ultrasantrifüj için, 513,000 kez G'de santrifüj dört santigrat derecede dört saat boyunca. Normal standart bir diyet veya yüksek kolesterol diyeti ile beslenen tavşanların lipoprotein profilleri burada gösterilmiştir.Tavşanlar otçuldur, bu nedenle plazma TC, TG ve PL seviyeleri genellikle insanların ve farelerinkinden daha düşüktür. Normal standart diyetle beslenen tavşanlarda, TC esas olarak HDL3 ve LDL olarak dağıtılır. Normal standart diyette vahşi tip tavşanlarda plazma TG'nin %39'u VLDL'lerde dağıtılırken, plazma PL'nin %57'si HDL3'te bulunur.Tavşanlara yüksek kolesterol diyeti ile meydan okunduğunda, hızla hiperkolesterolemi geliştiler. Lipoprotein profilleri VLDL'lerin belirgin yüksekliği ile karakterize edildi. Normal bir standart veya yüksek kolesterol diyeti ile beslenen vahşi tip tavşanlardan yedi lipoprotein fraksiyonu bir SDS poliakrilamid jel üzerinde çalıştırıldı ve CBB boyama ile görselleştirildi.Yüksek kolesterol diyetinde, VLDL'lerdeki, IDL'lerdeki ve LDL'lerdeki ApoB-100 ve ApoE içerikleri belirgin şekilde yükseldi. Batı şişkinliği, üç farklı hiperlipidemik tavşanın apolipoproteinlerini ve lipoprotein profillerini karşılaştırmak için kullanıldı: yüksek kolesterol diyeti ile beslenen yabani tip tavşanlar, ApoE nakavt tavşanları ve LDL reseptör eksikliği olan Watanabe Kalıtsal Hiperlipidemik tavşanlar. Yüksek kolesterol diyeti ile beslenen yabani tip tavşan parçacıkları içeren ApoB, artan ApoB-100 ve ApoE içeriği ile karakterize edilirken, ApoE nakavt tavşanları ApoA-1 görünümü ile birlikte ApoB-48'in bir artışını göstermiştir.Watanabe Heritable Hiperlipidemik tavşanlar LDL reseptör fonksiyonlarında genetik olarak eksiktir, bu nedenle insan ailesel hiperkolesterolemi hastalarına benzer şekilde, HDL'lerde ApoA-1'in azalması eşliğinde LDL'lerde belirgin bir ApoB-100 artışı gözlenmiştir. Örnek kurtarma bu yordamda en kritik olanıdır. Numune kaybını en aza indirmek için, fraksiyonu toplamaya ve alt fraksiyondaki viskoz yağışı tamamen çözmeye dikkat edilmelidir.Yedi lipoprotein fraksiyonunun toplanmasından sonra, sıralama için diyaliz gerekir. Diyaliz tamamlandıktan sonra, lipoproteinler SDS sayfası, batı şişkinliği ve hücre bazlı çalışma kullanılarak analiz için örnekler. Klinik ortamda, ultrasantrifüjasyon genellikle lipoproteinleri dört fraksiyona ayırır.Mevcut yöntem, hiperlipidemi araştırması için lipoproteinlerin daha fazla ayrıntısını sağlayan yedi lipoprotein fraksiyonunu izole edebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...