Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af NIH 1R01HL140239-01 til AMC. Vi vil gerne takke Cell Imaging Center på Drexel University.

1. Bryst epitelcellevækst og assay medier
<ol><li>MCF10A bryst epitelceller BEMÆRK: Den ikke-tumorigen udødeliggjorte bryst epitelcellelinje er afledt af en patient med fibrocystisk sygdom43. Celler udtrykker ikke østrogenreceptor.<ol>
<li>For at forberede 20 μg/mL epidermal vækstfaktor (EGF) opløses 100 μg lyofiliseret EGF i 500 μL steril dH2O for at fremstille 200 μg/mL EGF. Der tilsættes 500 μL på 200 μg/mL EGF til 4,5 ml steril 0,1% BSA i dH2O for at fr...

Denne protokol er den første af sin art til bioprint spheroids i deres 3D-arkitektur til co-kultur med endotelceller også i deres 3D-arkitektur. Kritiske protokoltrin omfatter den første dannelse af brystepitele sfæroider og HUVEC-netværk. Der skal udvises stor forsigtighed ved fodring af brystepitelespæroider, da de let afbrydes fra matrixopløsningen. På samme måde skal brystepitelende sfæroider behandles med forsigtighed, når de pipetters af matrixopløsningen og blandes i netværkene. HUVEC-netværk bør ik...

3D in vitro vaskulære tumor modeller er væsentlige værktøjer til mekanistisk undersøgelse af kræft vækst og metastaser. Især for brystkræft organiserer brystepitele celler dyrket i Matrigel i polariserede sfæroider, der mere ligner in vivo mammary acinus arkitektur1,2,3 ,4,5,6,7,8. 3D bryst epitelcellekultur påvirker også cellefunktionen, idet 3D-kulturer viser forskelle i epidermal vækstfaktor (EGF) receptormodulation8,9; onkogenfunktion, herunder ErbB210; vækst og apoptose, der signalerer11,12; kemoterapiresistens13,14. Vaskulære endotelceller reagerer ligeledes forskelligt på miljømæssige stimuli i 3D vs. traditionel 2D-kultur15,16,17,18. Men meget af forståelsen af vaskulære endotel og bryst epitel interaktioner kommer fra 2D-kultur ved hjælp af konditioneret medium eller Transwell skær, eller 3D-modeller, hvor de to celletyper er fysisk adskilt19,20,21,22,23. Disse co-kultur modeller giver begrænset fysiologisk indsigt, da både 3D-kultur og celle-celle kontakt er afgørende for vaskulær endotel - bryst epitelcelle interaktioner24,25,26.
3D kræftmodeller er blevet fremstillet ved hjælp af en række forskellige teknikker, herunder hængende dråbe sfæroid dannelse, bioprint, magnetisk samling, og kultur i hydrogels eller på manipuleret stilladser5,27,28,29. For nylig blev 3D-tumormodeller oprettet med flere celletyper arrangeret i deres respektive 3D-strukturer. I et eksempel på en tumor-on-a-chip platform, kræft, endotel, og stromale celler blev blandet ind i en matrix og derefter injiceres i de tre centrale væv kamre i en polydimethylsiloxan (PDMS) enhed. Vævskamrene var omkranset af to ydre kanaler, der repræsenterede en arterie og venule. Efter 5-7 dages kultur dannede endotelceller et mikrovaskulært netværk, og kræftceller spredte sig til at danne små tumorer nær vaskulaturen. Denne platform blev derefter brugt til at screene stoffer og lægemiddelkombinationer30. Yderligere tumor-on-a-chip platforme er blevet oprettet for at studere metastaser og kræfttyper med specifikke mekaniske stimuli (f.eks mekanisk stamme i lungen)31,32. Men, disse platforme generelt ikke omfatter både vaskulatur og kræft i deres respektive 3D-strukturer.
Biofabrication viser store løfter i at fremme 3D in vitro vaskulære tumor modeller, da det giver stram rumlig kontrol over celle placering. På trods af væksten i bioprinting i løbet af det seneste årti, få undersøgelser fokuserer specifikt på tumorer33,34. I et eksempel blev 3D-print af HeLa-celler i en gelatine / alginat / fibrinogen hydrogel brugt til at skabe en in vitro livmoderhalskræft model. Tumorceller blev bioprintet som individuelle celler og fik derefter lov til at danne sfæroider, som viste en højere spredningshastighed, øget matrix metalloproteinaseudtryk og højere chemoresistance end celler i 2D-kultur35. I disse undersøgelser, som i mange andre36,37, blev dissocierede celleophæng bioprintet, og derefter blev cellekulturerne forsynet med de nødvendige mekaniske og biokemiske signaler for at gøre det muligt for cellerne at danne en 3D-struktur. Men cellulære selvmontering kan tage dage eller uger, kan kræve komplekse rumlige og tidsmæssige miljømæssige signaler, eller kan ikke forekomme, når to celletyper er co-kulturperler. For eksempel, bryst epitelceller induceret celledød i endotelceller i 2D co-kultur, og dissociated bryst epitelceller ikke danne 3D-sfæroider, når bioprintet i alginat / gelatine hydrogels38. Dissociated bryst epitel eller kræftceller dannet sfæroider i alginat baseret bioinks kun når fanget i cirkulære PDMS forme. I andre tilfælde blev sfæroider dannet ved hjælp af suspenderede dråber i ultra-lav vedhæftet fil cirkulære brøndplader og derefter blandet i alginatbaserede bioinks39,40.
Vi beskriver nu en alternativ 3D-vævsbiofabrikationsmetode i denne protokol. I stedet for frø dissociated celler og vente på disse celler til at danne 3D-strukturer, beskriver vi, hvordan man skaber og bioprint 3D tumor sfæroider på en vaskulær rør netværk til at skabe en tumor co-kultur model, der kan bruges næsten øjeblikkeligt. Tumor sfæroider kan dyrkes in vitro eller stammer fra humane væv (organoider). Tilsvarende kan vaskulære rør dyrkes eller kan udledes af fedtvæv mikrovaskulære fragmenter. Bioinks kan variere fra biologisk inaktiv alginat til den meget biologisk aktive Matrigel41. Da denne 3D tumor co-kultur model kan oprettes med en række cellestrukturer og bioinks, det kan indarbejde flere celletyper, ekstracellulære matricer, og kemokin gradienter15,42. Mens endotelnetværkene i sin nuværende formulering ikke kan perfunderes, kan fremtidige gentagelser integrere denne metode med mikrofluider eller -on-chip-systemer. Bioprinting af 3D-brystepiteler på endotelnetværk muliggør hurtig biofabrikation af humane brystmodeller til test af lægemidler og personlig præcisionsmedicin27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Bioprinting er ved at opstå som et lovende redskab til at fremstille 3D-menneskelige kræftmodeller, der bedre opsummerer kritiske kendetegn for in vivo vævsarkitektur. I den nuværende lag-for-lag ekstrudering bioprinting, er de enkelte celler ekstruderet i en bioink sammen med komplekse rumlige og tidsmæssige signaler til at fremme hierarkisk væv selvmontering. Denne biofabrikationsteknik er imidlertid afhængig af komplekse interaktioner mellem celler, bioinks og biokemiske og biofysiske signaler. Således kan selvmontering tage dage eller endda uger, kan kræve specifikke bioinks, og kan ikke altid forekomme, når der er mere end én celletype involveret. Vi har derfor udviklet en teknik til direkte bioprint forformede 3D bryst epitel sfæroider i en række bioinks. Bioprintede forformede 3D-brystepiteler opretholdt deres levedygtighed og polariserede arkitektur efter udskrivning. Vi har desuden trykt 3D-sfæroiderne på vaskulære endotelcellenetværk for at skabe en cokulturmodel. Således skaber den nye bioprintteknik hurtigt en mere fysiologisk relevant 3D-menneskelig brystmodel til lavere omkostninger og med højere fleksibilitet end traditionelle bioprintteknikker. Denne alsidige bioprint teknik kan ekstrapoleres til at skabe 3D-modeller af andre væv i yderligere bioinks.

Bryst epitelceller bør selvorganisere i 3D-sfæroider efter 5-8 dages kultur på matrixopløsning og i kulturmedium med 2% matrixopløsning. Ikke-tumorigenic MCF10A bryst epitel sfæroider skal vises runde og har en hul center, med integrin α6 polariseret til yderkanten af kugleformet(Figur 1, indsat viser hule centre). Meget invasive MDA-MB-231 brystkræft epitelceller danner uregelmæssige sfæroider. Der bør anvendes spheroider, når de er omkring 100 – 300 μm i diameter. Når sfær...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Målet med denne protokol er direkte bioprint bryst epitelceller som multicellulære sfæroider på præ-dannede endotel netværk til hurtigt at skabe 3D bryst-endotel co-kultur modeller, som kan bruges til narkotika screening undersøgelser.

Direkte bioprinting af 3D-multicellulære brystspærrider på endotelnetværk

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Opførelse af en multicellulært 3D Stillads for levering af Layered celleark

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modeling Kræft i æggestokkene flercellede Sfæroide Behavior i en dynamisk 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Oprettelse af hjertevæv, der udviser mekanisk integration af sfæroider ved hjælp af 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting af brusk og huden væv analoger udnytter en roman passiv blanding enhed teknik for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-on-a-CD-platform til generering af flercellede tredimensionelle Sfæroider

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller af 3D Bioprinting af gelatine Methacryloyl hydrogel baserede Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting af Murine Kortikale Astrocytter til Engineering Neural-lignende Væv

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Overkommelig iltmikroskopiassisteret biofabrikation af multicellulære sfæroider

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...