Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door NIH 1R01HL140239-01 aan AMC. We willen het Cell Imaging Center van de Drexel University bedanken.

1. Borst epitheelcelgroei en testmedia
<ol><li>MCF10A borst epitheelcellen OPMERKING: De niet-tumorigeen vereeuwigde borstep epitheelcellijn is afgeleid van een patiënt met fibrocystische ziekte43. Cellen drukken geen oestrogeenreceptor uit.<ol>
<li>Om 20 μg/ml epidermale groeifactor (EGF) voor te bereiden, lost u 100 μg gelyophiliseerde EFG op in 500 μL steriele dH2O om 200 μg/ml EFG te maken. Voeg 500 μL van 200 μg/ml EFG toe aan 4,5 ml steriele 0,1% BSA in dH2O...

Dit protocol is het eerste in zijn soort dat sferoïden bioprint in hun 3D-architectuur voor co-cultuur met endotheelcellen ook in hun 3D-architectuur. Kritieke protocolstappen omvatten de eerste vorming van borsteperiële sferoïden en HUVEC-netwerken. Extreme voorzichtigheid moet worden betracht bij het voeden van epitheelsferoïden, omdat ze gemakkelijk worden verstoord door de matrixoplossing. Evenzo moeten borsteperiële sferoïden met zorg worden behandeld wanneer ze van de matrixoplossing worden gepijpt en in de n...

3D in vitro vasculaire tumormodellen zijn essentiële hulpmiddelen voor mechanistische studie van kankergroei en uitzaaiingen. Met name voor borstkanker organiseren borsteptheelcellen die in Matrigel worden gekweekt zich in gepolariseerde sferoïden die meer lijken op de in vivo mammary acinus-architectuur1,2,3,4,5,6,7,8. 3D borst epitheelcelcultuur beïnvloedt ook celfunctie, met 3D culturen die verschillen in epidermale groeifactor (EGF) receptormodulatietonen 8,9; oncogene functie, met inbegrip van ErbB210; groei en apoptose die11,12signaleren ; en chemotherapieresistentie13,14. Vasculaire endotheelcellen reageren op dezelfde manier anders op omgevingsprikkels in 3D versus traditionele 2D-cultuur15,16,17,18. Veel van het begrip van vasculaire endotheel- en borsteperiële interacties komt echter voort uit de 2D-cultuur met behulp van geconditioneerde medium- of Transwell-inserts, of 3D-modellen waarin de twee celtypen fysiek gescheiden zijn19,20,21,22,23. Deze co-cultuurmodellen bieden beperkt fysiologisch inzicht, omdat zowel 3D-cultuur als celcelcontact van cruciaal belang zijn voor vasculaire endotheel - borsteperiële celinteracties24,25,26.
3D kankermodellen zijn vervaardigd met behulp van een verscheidenheid aan technieken, waaronder hangende druppel sferoïde vorming, bioprinting, magnetische assemblage en cultuur binnen hydrogels of op ontworpen steigers5,27,28,29. Meer recent werden 3D-tumormodellen gemaakt met meerdere celtypen gerangschikt in hun respectieve 3D-structuren. In een voorbeeld van een tumor-op-een-chip platform, kanker, endotheel, entromale cellen werden gemengd in een matrix en vervolgens geïnjecteerd in de drie centrale weefselkamers in een polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat. De weefselkamers werden begrensd door twee buitenste kanalen die een slagader en venule vertegenwoordigden. Na 5-7 dagen cultuur vormden endotheelcellen een microvasculaire netwerk en verspreidden kankercellen zich om kleine tumoren in de buurt van de vasculatuur te vormen. Dit platform werd vervolgens gebruikt om drugs en drugscombinaties te screenen30. Er zijn extra tumor-op-een-chipplatforms gecreëerd om uitzaaiingen en kankertypen te bestuderen met specifieke mechanische stimuli (bijv. mechanische belasting in de longen)31,32. Deze platforms omvatten echter over het algemeen niet zowel vasculatuur als kanker in hun respectieve 3D-structuren.
Biofabrication toont grote belofte in het bevorderen van 3D in vitro vascularized tumormodellen, aangezien het strakke ruimtelijke controle over cellocatie mogelijk maakt. Ondanks de groei van bioprinting in het afgelopen decennium, richten weinig studies zich specifiek optumoren 33,34. In een voorbeeld werd 3D-printen van HeLa-cellen in een gelatine/alginaat/fibrinogeenhydrogel gebruikt om een in vitro baarmoederhalskankermodel te maken. Tumorcellen werden bioprinted als individuele cellen en vervolgens toegestaan om sferoïden te vormen, die een hogere proliferatiesnelheid, verhoogde matrix metalloproteinase expressie en een hogere chemoresistance vertoonden dan cellen in 2D-cultuur35. In deze studies werden, net als in vele andere36,37, gescheiden celsuspensies bioprinted, en vervolgens werden de celculturen voorzien van de vereiste mechanische en biochemische signalen om de cellen in staat te stellen een 3D-structuur te vormen. Cellulaire zelfassemblage kan echter dagen of weken duren, kan complexe ruimtelijke en temporele omgevingssignalen vereisen of kan niet optreden wanneer twee celtypen naast elkaar worden gekweekt. Bijvoorbeeld, borst epitheelcellen geïnduceerde celdood in endotheelcellen in 2D co-cultuur, en dissociated borst epitheelcellen vormden geen 3D sferoïden toen bioprinted in alginaat/gelatine hydrogels38. Dissociated borst epitheel of kankercellen vormden sferoïden in bioinks op basis van alginaat alleen wanneer ze in cirkelvormige PDMS-mallen waren ingesloten. In andere gevallen werden sferoïden gevormd met behulp van hangende druppels in cirkelvormige putplaten met ultralage bevestiging en vervolgens gemengd in bioinks op basis van alginaat39,40.
We beschrijven nu een alternatieve 3D weefsel biomanufacturing methode in dit protocol. In plaats van gedissocieerde cellen te zaaien en te wachten tot deze cellen de 3D-structuren vormen, beschrijven we hoe we 3D-tumorsferoïden op een vasculair buisnetwerk kunnen maken en bioprinten om een tumorcocultuurmodel te creëren dat bijna onmiddellijk kan worden gebruikt. Tumorsferoïden kunnen in vitro worden gekweekt of afkomstig zijn van menselijke weefsels (organoïden). Op dezelfde manier kunnen vasculaire buizen worden gekweekt of kunnen worden afgeleid van adiposeweefsel microvasculaire fragmenten. Bioinks kan variëren van biologisch inactief alginaat tot het zeer biologisch actieve Matrigel41. Aangezien dit 3D tumor co-cultuurmodel met een verscheidenheid van celstructuren en bioinks kan worden gecre ërd, kan het veelvoudige celtypes, extracellulaire matrices, en chemokine gradiënten15,42omvatten. Hoewel in de huidige formulering de endotheelnetwerken niet kunnen worden doordrongend, kunnen toekomstige iteraties deze methode integreren met microfluïden of -on-chip-systemen. Bioprinting 3D borst epitheel sferoïden op endotheelnetwerken maakt snelle biofabrication van menselijke borstmodellen voor drug testen en gepersonaliseerde precisie geneeskunde27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Bioprinting ontpopt zich als een veelbelovend hulpmiddel om 3D-menselijke kankermodellen te fabriceren die kritieke kenmerken van in vivo weefselarchitectuur beter samenvatten. In de huidige laag-voor-laag extrusie bioprinting worden individuele cellen geëxtrudeerd in een bioink samen met complexe ruimtelijke en temporele signalen om hiërarchische weefsel zelfassemblage te bevorderen. Deze biofabricatietechniek is echter gebaseerd op complexe interacties tussen cellen, bioinks en biochemische en biofysische signalen. Zelfassemblage kan dus dagen of zelfs weken duren, kan specifieke bioinks vereisen en kan niet altijd optreden wanneer er meer dan één celtype bij betrokken is. Daarom ontwikkelden we een techniek om voorgevormde 3D borsteperiële sferoïden direct te bioprinten in een verscheidenheid aan bioinks. Bioprinted voorgevormde 3D borst epitheel sferoïden hielden hun levensvatbaarheid en gepolariseerde architectuur na het afdrukken. We hebben bovendien de 3D-sferoïden geprint op vasculaire endotheelcelnetwerken om een co-cultuurmodel te creëren. Zo creëert de nieuwe bioprintingtechniek snel een meer fysiologisch relevant 3D-menselijk borstmodel tegen lagere kosten en met een hogere flexibiliteit dan traditionele bioprintingtechnieken. Deze veelzijdige bioprinttechniek kan worden geëxtrapoleerd om 3D-modellen van andere weefsels in extra bioinks te maken.

Borsteperiële cellen moeten zichzelf organiseren in 3D-sferoïden na 5-8 dagen cultuur op matrixoplossing en in kweekmedium met 2% matrixoplossing. Niet-tumorigeen mcf10a borst epitheel sferoïden moeten rond lijken en hebben een hol centrum, met integrin α6 gepolariseerd aan de buitenste rand van de sferoïde(figuur 1, inzet toont holle centra). Zeer invasieve MDA-MB-231 epitheelcellen van borstkanker vormen onregelmatige sferoïden. Sferoïden moeten worden gebruikt wanneer ze een diamet...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Het doel van dit protocol is om borsteptheelcellen rechtstreeks bioprinten als meercellige sferoïden op voorgevormde endotheelnetwerken om snel 3D-borst-endotheel co-cultuurmodellen te creëren die kunnen worden gebruikt voor geneesmiddelenscreeningsstudies.

Directe bioprinting van 3D-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Het creëren van cardiale weefsels die mechanische integratie van sferoïden tonen met behulp van 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting van kraakbeen en huid weefsel analogen met behulp van een roman passief mengen eenheid techniek voor Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Betaalbare zuurstofmicroscopie-geassisteerde biofabricage van meercellige sferoïden

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...