Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Cette recherche a été financée par NIH 1R01HL140239-01 à AMC. Nous tenons à remercier le Cell Imaging Center de l’Université Drexel.

1. Croissance épithéliale des cellules mammaires et médias d’analyse
<ol><li>MCF10Une cellule épithéliale du sein NOTE : La ligne épithéliale immortalisée non tumorigenic de cellules épithéliales de sein est dérivée d’un patient présentant la maladie fibrocystic43. Les cellules n’expriment pas le récepteur d’oestrogène.<ol>
<li>Pour préparer le facteur épidermique de croissance (EGF) de 20 μg/mL, dissoudre 100 μg d’EGF lyophilisé dans 500 μL de dHstérile 2...

Ce protocole est le premier du genre à bioimprimer les sphéroïdes dans leur architecture 3D pour la co-culture avec les cellules endothéliales également dans leur architecture 3D. Les étapes critiques du protocole incluent la formation initiale de sphéroïdes épithéliales du sein et de réseaux HUVEC. Il faut faire preuve d’une extrême prudence dans l’alimentation des sphéroïdes épithéliales du sein, car ils sont facilement perturbés par la solution matricielle. De même, les sphéroïdes épithéliale...

Les modèles de tumeurs vascularisées in vitro 3D sont des outils essentiels pour l’étude mécaniste de la croissance et de la métastase du cancer. Pour le cancer du sein en particulier, les cellules épithéliales du sein cultivés à Matrigel s’organisent en sphéroïdes polarisés qui ressemblent plus étroitement à l’architecture in vivo mammaire acinus1,2,3,4,5,6,7,8. La culture cellulaire épithéliale du sein 3D influe également sur la fonction cellulaire, les cultures 3D montrant des différences dans la modulation des récepteurs du facteur épidermique de croissance (EGF)8,9; fonction oncogène, y compris ErbB210; croissance et apoptose signalant11,12; et résistance à lachimiothérapie 13,14. Les cellules endothéliales vasculaires réagissent également différemment aux stimuli environnementaux dans la culture 3D vs 2Dtraditionnelle 15,16,17,18. Cependant, une grande partie de la compréhension des interactions épithéliales vasculaires endothéliales et mammaires provient de la culture 2D à l’aide d’inserts moyens conditionnés ou Transwell, ou de modèles 3D dans lesquels les deux types de cellules sont physiquementséparés 19,20,21,22,23. Ces modèles de co-culture fournissent un aperçu physiologique limité, puisque la culture 3D et le contact cellule-cellule sont essentiels à l’endothélial vasculaire – interactions cellulaires épithélialesdu sein 24,25,26.
Les modèles 3D de cancer ont été fabriqués utilisant une série de techniques, y compris la formation sphéroïde de chute suspendue, la bioimpression, l’assemblage magnétique, et la culture dans les hydrogels ou sur les échafaudagesmachinés 5,27,28,29. Plus récemment, des modèles de tumeur 3D ont été créés avec plusieurs types de cellules disposés dans leurs structures 3D respectives. Dans un exemple d’une plate-forme de tumeur-sur-une-puce, le cancer, l’endothélial, et les cellules stromal ont été mélangés dans une matrice et puis injectés dans les trois chambres centrales de tissu dans un dispositif de polydimethylsiloxane (PDMS). Les chambres tissulaires étaient bordées par deux canaux extérieurs qui représentaient une artère et un venule. Après 5-7 jours de culture, les cellules endothéliales ont formé un réseau microvasculaire et les cellules cancéreuses ont proliféré pour former de petites tumeurs près de la vascularisation. Cette plate-forme a ensuite été utilisée pour filtrer les médicaments et les combinaisons demédicaments 30. D’autres plates-formes tumorales ont été créées pour étudier les métastases et les types de cancer avec des stimuli mécaniques spécifiques (p. ex., tension mécanique dans le poumon)31,32. Cependant, ces plates-formes n’incluent généralement pas à la fois la vasculature et le cancer dans leurs structures 3D respectives.
La biofabrication est très prometteuse dans l’avancement des modèles de tumeurs vascularisées 3D in vitro, puisqu’elle permet un contrôle spatial serré de l’emplacement cellulaire. Malgré la croissance de la bioimpression au cours de la dernière décennie, peu d’études se concentrent spécifiquement surles tumeurs 33,34. Dans un exemple, l’impression 3D des cellules HeLa dans un hydrogel gélatine/alginate/fibrinogen a été utilisée pour créer un modèle in vitro de cancer du col de l’utérus. Les cellules tumorales ont été bioimprimées sous forme de cellules individuelles, puis autorisées à former des sphéroïdes, ce qui a montré un taux de prolifération plus élevé, une augmentation de l’expression de la métalloprotéine de matrice et une chémoresistance plus élevée que les cellules de la culture 2D35. Dans ces études, comme dans beaucoupd’autres 36,37, suspensions cellulaires dissociées ont été bioimprimés, puis les cultures cellulaires ont été fournis avec les indices mécaniques et biochimiques nécessaires pour permettre aux cellules de former une structure 3D. Cependant, l’auto-assemblage cellulaire peut prendre des jours ou des semaines, peut nécessiter des indices environnementaux spatiaux et temporels complexes, ou peut ne pas se produire lorsque deux types de cellules sont co-cultivés. Par exemple, les cellules épithéliales de sein ont induit la mort cellulaire dans les cellules endothéliales dans la co-culture 2D, et les cellules épithéliales dissociées de sein n’ont pas former des sphéroïdes 3D une fois bioimprimées dans les hydrogels d’alginate/gélatine38. Les cellules épithéliales ou cancéreuses dissociées du sein formaient des sphéroïdes dans des bioinks à base d’alginate seulement lorsqu’elles étaient piégées dans des moules circulaires PDMS. Dans d’autres cas, des sphéroïdes ont été formés utilisant des gouttelettes suspendues dans des plaques circulaires de puits d’attachement ultra-basses, puis mélangés dans des bioinks à base d’alginate39,40.
Nous décrivons maintenant une méthode alternative de biomanufacturing de tissu 3D dans ce protocole. Plutôt que de semer des cellules dissociées et d’attendre que ces cellules forment les structures 3D, nous décrivons comment créer et bioimprimer des sphéroïdes tumoraux 3D sur un réseau de tubes vasculaires pour créer un modèle de co-culture tumorale qui peut être utilisé presque immédiatement. Les sphéroïdes tumoraux peuvent être cultivés in vitro ou dérivés de tissus humains (organoïdes). De même, les tubes vasculaires peuvent être cultivés ou peuvent être dérivés de fragments microvasculaires de tissu adipeux. Les bioinks peuvent aller de l’alginate biologiquement inactif au Matrigel41 très biologiquementactif. Puisque ce modèle de co-culture de tumeur 3D peut être créé avec une série de structures cellulaires et de bioinks, il peut incorporer plusieurs types de cellules, matrices extracellulaires, et gradients dechimiokine 15,42. Alors que dans sa formulation actuelle, les réseaux endothéliales ne peuvent pas être perfusés, les itérations futures pourraient intégrer cette méthode avec des microfluides ou des systèmes sur puce. La bioimpression de sphéroïdes épithéliales du sein 3D sur les réseaux endothéliales permet une biofabrication rapide des modèles mammaires humains pour le dépistage des drogues et la médecine de précisionpersonnalisée 27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

La bioimpression est en train d’émerger comme un outil prometteur pour fabriquer des modèles 3D de cancer humain qui récapitulent mieux les caractéristiques critiques de l’architecture tissulaire in vivo. Dans la bioimpression actuelle de l’extrusion couche par couche, les cellules individuelles sont extrudées dans un bioink ainsi que des indices spatiaux et temporels complexes pour favoriser l’auto-assemblage hiérarchique des tissus. Cependant, cette technique de biofabrication repose sur des interactions complexes entre les cellules, les bioinks et les indices biochimiques et biophysiques. Ainsi, l’auto-assemblage peut prendre des jours, voire des semaines, peut nécessiter des bioinks spécifiques, et peut ne pas toujours se produire quand il ya plus d’un type de cellule impliqués. Nous avons donc développé une technique pour bioimprimer directement les sphéroïdes épithéliales pré-formés du sein 3D dans une variété de bioinks. Les sphéroïdes épithéliales 3D pré-formés de sein bioimprimés ont soutenu leur viabilité et leur architecture polarisée après impression. Nous avons en outre imprimé les sphéroïdes 3D sur les réseaux cellulaires endothéliales vasculaires pour créer un modèle de co-culture. Ainsi, la nouvelle technique de bioimpression crée rapidement un modèle de sein humain 3D plus pertinent physiologiquement à moindre coût et avec une plus grande flexibilité que les techniques traditionnelles de bioimpression. Cette technique polyvalente de bioimpression peut être extrapolée pour créer des modèles 3D d’autres tissus dans des bioinks supplémentaires.

Les cellules épithéliales du sein devraient s’auto-organiser en sphéroïdes 3D après 5-8 jours de culture sur la solution matricielle et dans le milieu de culture avec la solution matricielle de 2%. Les sphéroïdes épithéliales du sein MCF10A non tumoriogènes devraient apparaître ronds et avoir un centre creux, l’intégrine α6 polarisée jusqu’au bord externe du sphéroïde(figure 1, inset montre des centres creux). Les cellules épithéliales très invasives du cancer du sei...

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Le but de ce protocole est de bioimprimer directement les cellules épithéliales du sein sous forme de sphéroïdes multicellulaires sur les réseaux endothéliales pré-formés pour créer rapidement des modèles de co-culture mammaire-endothéliale 3D qui peuvent être utilisés pour des études de dépistage de médicaments.

Bioimpression directe de sphéroïdes mammaires multicellulaires 3D sur les réseaux endothéliales

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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