Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Diese Forschung wurde von NIH 1R01HL140239-01 an AMC finanziert. Wir bedanken uns beim Cell Imaging Center der Drexel University.

1. Brustepithelzellwachstum und Assay-Medien
<ol><li>MCF10A Brustepithelzellen HINWEIS: Die nicht-tumorigenic verewigte Brustepithelzelllinie wird von einem Patienten mit fibrozystischer Erkrankungabgeleitet 43. Zellen drücken keinen Östrogenrezeptor aus.<ol>
<li>Um den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) von 20 g/ml vorzubereiten, lösen Sie 100 g lyophilisierten EGF in 500 l sterilen dH2O auf, um 200 g/ml EGF zu bilden. Fügen Sie 500 l von 200 g/ml EGF in 4,5 ml sterile 0,1% BSA...

Dieses Protokoll ist das erste seiner Art, das Sphäroide in ihrer 3D-Architektur für die Co-Kultur mit Endothelzellen auch in ihrer 3D-Architektur bioprintiert. Kritische Protokollschritte umfassen die Erstbildung von Brustepithelialsphäroiden und HUVEC-Netzwerken. Bei der Fütterung von Epithelsphäroiden ist äußerste Vorsicht geboten, da sie leicht von der Matrixlösung gestört werden können. Ebenso müssen Brustepithelilesphäroide mit Vorsicht behandelt werden, wenn sie von der Matrixlösung abgeführt und in ...

3D-in-vitro-vaskularisierte Tumormodelle sind wesentliche Werkzeuge für die mechanistische Untersuchung von Krebswachstum und Metastasen. Insbesondere bei Brustkrebs organisieren sich in Matrigel kultivierte Brustepithelzellen zu polarisierten Sphäroiden, die eher der in vivo-Mamma-Akuinusarchitektur1,2,3,4,5,6,7,8ähneln. 3D-Brustepithelzellkultur wirkt sich auch auf die Zellfunktion aus, wobei 3D-KulturenUnterschiede in der epidermalen Wachstumsfaktor-Modulation (EGF) zeigen 8,9; Onkogenfunktion, einschließlich ErbB210; Wachstum und Apoptose-Signalisierung11,12; und Chemotherapie-Resistenz13,14. Vaskuläre Endothelzellen reagieren ähnlich unterschiedlich auf Umweltreize in 3D im Vergleich zu traditioneller 2D-Kultur15,16,17,18. Ein Großteil des Verständnisses von vaskulären endotheliale und Brustepithel-Wechselwirkungen stammt jedoch aus der 2D-Kultur mit konditionierten Medium- oder Transwell-Einsätzen oder 3D-Modellen, bei denen die beiden Zelltypen physisch getrennt sind19,20,21,22,23. Diese Co-Kultur-Modelle bieten begrenzte physiologische Erkenntnisse, da sowohl 3D-Kultur als auch Zellzellkontakt entscheidend für vaskuläre endotheliale – Brustepithelzellinteraktionen24,25,26sind.
3D-Krebsmodelle wurden mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt, einschließlich hängender Tropfensphäroidbildung, Bioprinting, magnetische Montage und Kultur in Hydrogelen oder auf technischen Gerüsten5,27,28,29. In jüngerer Zeit wurden 3D-Tumormodelle mit mehreren Zelltypen erstellt, die in ihren jeweiligen 3D-Strukturen angeordnet sind. In einem Beispiel einer Tumor-on-a-Chip-Plattform wurden Krebs-, Endothel- und Stromalzellen in eine Matrix gemischt und dann in die drei zentralen Gewebekammern in einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Gerät injiziert. Die Gewebekammern wurden von zwei äußeren Kanälen umrandet, die eine Arterie und Venule darstellten. Nach 5-7 Tagen Kultur bildeten Endothelzellen ein mikrovaskuläres Netzwerk und Krebszellen vermehrten sich zu kleinen Tumoren in der Nähe der Vaskulatur. Diese Plattform wurde dann verwendet, um Drogen und Drogenkombinationen zu überprüfen30. Zusätzliche Tumor-on-a-Chip-Plattformen wurden geschaffen, um Metastasen und Krebsarten mit spezifischen mechanischen Reizen (z.B. mechanische Dehnung in der Lunge) zu untersuchen31,32. Diese Plattformen enthalten jedoch in der Regel nicht sowohl Vaskulatur als auch Krebs in ihren jeweiligen 3D-Strukturen.
Die Biofertigung ist vielversprechend bei der Weiterentwicklung von 3D-in-vitro-vaskularisierten Tumormodellen, da sie eine enge räumliche Kontrolle über die Zelllage ermöglicht. Trotz des Wachstums des Bioprinting in den letzten zehn Jahren konzentrieren sich nur wenige Studien speziell auf Tumore33,34. In einem Beispiel wurde der 3D-Druck von HeLa-Zellen in einem Gelatine-/Alginat-/Fibrinogen-Hydrogel verwendet, um ein in vitro Gebärmutterhalskrebsmodell zu erstellen. Tumorzellen wurden als einzelne Zellen biogedruckt und dann erlaubt, Sphäroide zu bilden, die eine höhere Proliferationsrate, erhöhte Matrix-Metalloproteinase-Expression und eine höhere Chemoresistenz als Zellen in 2D-Kultur35zeigten. In diesen Studien wurden, wie in vielen anderen36,37, dissoziierte Zellsuspensionen biogedruckt, und dann wurden die Zellkulturen mit den erforderlichen mechanischen und biochemischen Hinweisen versehen, um den Zellen eine 3D-Struktur zu ermöglichen. Die zelluläre Selbstmontage kann jedoch Tage oder Wochen dauern, komplexe räumliche und zeitliche Umwelthinweise erfordern oder nicht auftreten, wenn zwei Zelltypen mitkultiviert werden. Zum Beispiel induzierten Brustepithelzellen den Zelltod in Endothelzellen in 2D-Kokultur, und dissoziierte Brustepithelzellen bildeten keine 3D-Spheroide, wenn sie in Alginat/Gelatine-Hydrogelen38bioprinted wurden. Dissoziierte Brustepithel- oder Krebszellen bildeten Sphäroide in Alginat-basierten Bioinks nur, wenn sie in kreisförmigen PDMS-Formen eingeschlossen waren. In anderen Fällen wurden Sphäroide mit hängenden Tröpfchen in ultraniedrigen Befestigungskreisplatten gebildet und dann in Alginat-basierte Bioinks39,40gemischt.
Wir beschreiben nun eine alternative 3D-Gewebebiomanufacturing-Methode in diesem Protokoll. Anstatt entfernt von Samen dissoziierte Zellen und warten, bis diese Zellen die 3D-Strukturen bilden, beschreiben wir, wie man 3D-Tumorsphäride in einem Gefäßröhrennetzwerk erstellt und bioprintt, um ein Tumor-Kokulturmodell zu erstellen, das fast sofort verwendet werden kann. Tumorsphäride können in vitro angebaut oder aus menschlichen Geweben (Organoiden) gewonnen werden. Ebenso können Gefäßröhren angebaut oder aus mikrovaskulären Fragmenten des Fettgewebes abgeleitet werden. Bioinks können von biologisch inaktivem Alginat bis zum hochbiologisch aktiven Matrigel41reichen. Da dieses 3D-Tumor-Cokulturmodell mit einer Vielzahl von Zellstrukturen und Bioinks erstellt werden kann, kann es mehrere Zelltypen, extrazelluläre Matrizen und Chemokin-Gradienten15,42integrieren. Während in ihrer aktuellen Formulierung die Endothelnetzwerke nicht durchdrungen werden können, könnten zukünftige Iterationen diese Methode mit Mikrofluiden oder -on-Chip-Systemen integrieren. Bioprinting 3D Brust epitheliale Sphäroide auf endotheliale Netzwerke ermöglicht eine schnelle Biofertigung von menschlichen Brustmodellen für Arzneimitteltests und personalisierte Präzisionsmedizin27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Bioprinting entwickelt sich zu einem vielversprechenden Werkzeug, um 3D-Humankrebsmodelle herzustellen, die kritische Merkmale der In-vivo-Gewebearchitektur besser rekapitulieren. Beim aktuellen Schicht-für-Schicht-Extrusionsbioprinting werden einzelne Zellen in einem Bioink zusammen mit komplexen räumlichen und zeitlichen Hinweisen extrudiert, um die hierarchische Gewebeselbstmontage zu fördern. Diese Biofabrikationstechnik beruht jedoch auf komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen, Bioinken und biochemischen und biophysikalischen Hinweisen. Daher kann die Selbstmontage Tage oder sogar Wochen dauern, kann bestimmte Bioinks erfordern und kann nicht immer auftreten, wenn mehr als ein Zelltyp beteiligt ist. Deshalb haben wir eine Technik entwickelt, um vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride in einer Vielzahl von Bioinks direkt zu bioprinten. Biobedruckte vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride hielten ihre Lebensfähigkeit aufrecht und polarisierten die Architektur nach dem Druck. Zusätzlich haben wir die 3D-Sphäroide auf vaskuläre Endothelzellnetzwerke gedruckt, um ein Co-Kultur-Modell zu erstellen. So schafft die neuartige Bioprinting-Technik schnell ein physiologisch relevanteres 3D-Brustmodell zu geringeren Kosten und mit einer höheren Flexibilität als herkömmliche Bioprinting-Techniken. Diese vielseitige Bioprinting-Technik kann extrapoliert werden, um 3D-Modelle anderer Gewebe in zusätzlichen Bioinks zu erstellen.

Brustepithelzellen sollten sich nach 5-8 Tagen Kultur auf Matrixlösung und im Kulturmedium mit 2% Matrixlösung selbst in 3D-Sphäroide organisieren. Nicht-tumorigene MCF10A Brustepithelialsphäride sollten rund erscheinen und ein hohles Zentrum haben, mit Integrin 6 polarisiert bis zum äußeren Rand des Sphäroids(Abbildung 1, Einschub zeigt Hohlzentren). Hochinvasive MDA-MB-231 Brustkrebs-Epithelzellen bilden unregelmäßige Sphäroide. Sphäroide sollten verwendet werden, wenn sie einen...

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Brustepithelzellen als multizelluläre Sphäroide direkt auf vorgeformte endotheliale Netzwerke zu bioprinten, um schnell 3D-Brust-Endothel-Kokulturmodelle zu erstellen, die für Arzneimittelscreening-Studien verwendet werden können.

Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Forschung

Biotechnik

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

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Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Erschwingliche Sauerstoffmikroskopie-unterstützte Biofabrikation von mehrzelligen Sphäroiden

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...