Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av NIH 1R01HL140239-01 til AMC. Vi vil gjerne takke Cell Imaging Center ved Drexel University.

1. Bryst epitelcellevekst og analysemedier
<ol><li>MCF10A bryst epitelceller MERK: Den ikke-tumorigenic udødeliggjort bryst epitelcellelinjen er avledet fra en pasient med fibrocystisk sykdom43. Celler uttrykker ikke østrogenreseptor.<ol>
<li>For å forberede 20 μg/ml epidermal vekstfaktor (EGF), oppløs 100 μg lyofilisert EGF i 500 μL steril dH2O for å lage 200 μg/ml EGF. Tilsett 500 μL på 200 μg/ml EGF i 4,5 ml steril 0,1 % BSA i dH2O for å lage en 20 μg/ml...

Denne protokollen er den første av sitt slag til bioprint sfæroider i sin 3D-arkitektur for co-kultur med endotelceller også i deres 3D-arkitektur. Kritiske protokolltrinn inkluderer den første dannelsen av brystepitelsfæroider og HUVEC-nettverk. Ekstrem forsiktighet må utvises ved fôring av brystepitele sfæroider, da de lett forstyrres fra matriseløsningen. På samme måte må brystepitele sfæroider behandles med forsiktighet når de er pipetted av matriseløsningen og blandet inn i nettverkene. HUVEC-nettverk...

3D in vitro vaskulariserte tumormodeller er viktige verktøy for mekanistisk studie av kreftvekst og metastase. For brystkreft spesielt, bryst epitelceller dyrket i Matrigel organisere i polariserte sfæroider som ligner nærmere på in vivo mammary acinusarkitektur 1,2,3,4,5,6,7,8. 3D bryst epitelcellekultur påvirker også cellefunksjon, med 3D-kulturer som viser forskjeller i epidermal vekstfaktor (EGF) reseptormodulasjon8,9; onkogenfunksjon, inkludert ErbB210; vekst og apoptose signaliserer11,12; og kjemoterapiresistens 13,14. Vaskulære endotelceller reagerer på samme måte forskjellig på miljøstimuli i 3D vs. tradisjonell 2D-kultur15,16,17,18. Imidlertid kommer mye av forståelsen av vaskulære endotel- og brystepitelinteraksjoner fra 2D-kultur ved hjelp av beholdte medium- eller Transwell-innsatser, eller 3D-modeller der de to celletypene er fysisk separert19,20,21,22,23. Disse co-kultur modeller gir begrenset fysiologisk innsikt, siden både 3D kultur og celle-celle kontakt er avgjørende for vaskulær endotel - bryst epitelcelleinteraksjoner24,25,26.
3D kreftmodeller har blitt fabrikkert ved hjelp av en rekke teknikker, inkludert hengende drop sfæroid formasjon, bioprinting, magnetisk montering og kultur innen hydrogeler eller på konstruerte stillas5,27,28,29. Mer nylig ble 3D tumormodeller opprettet med flere celletyper arrangert i sine respektive 3D-strukturer. I ett eksempel på en tumor-on-a-chip plattform, kreft, endotel- og stromal celler ble blandet inn i en matrise og deretter injisert i de tre sentrale vevkamrene i en polydimetylsiloxane (PDMS) enhet. Vevskamrene ble avgrenset av to ytre kanaler som representerte en arterie og venule. Etter 5-7 dager med kultur dannet endotelceller et mikrovaskulært nettverk og kreftceller spredte seg for å danne små svulster i nærheten av vaskulaturen. Denne plattformen ble deretter brukt til å screene narkotika og narkotikakombinasjoner30. Ytterligere tumor-on-a-chip plattformer er opprettet for å studere metastase og krefttyper med spesifikke mekaniske stimuli (f.eks mekanisk belastning i lungene)31,32. Disse plattformene inkluderer imidlertid vanligvis ikke både vaskulatur og kreft i sine respektive 3D-strukturer.
Biofabrikasjon viser stort løfte i å fremme 3D in vitro vaskulariserte tumormodeller, siden det muliggjør tett romlig kontroll over celleplassering. Til tross for vekst av bioprinting i løpet av det siste tiåret, er det få studier som fokuserer spesielt påsvulster 33,34. I ett eksempel ble 3D-utskrift av HeLa-celler i en gelatin/alginat/fibrinogenhydrogel brukt til å lage en in vitro livmorhalskreftmodell. Tumorceller ble bioprinted som individuelle celler og deretter lov til å danne sfæroider, som viste en høyere spredningshastighet, økt matrise metalloproteinase uttrykk, og høyere chemoresistance enn celler i 2D kultur35. I disse studiene, som i mange andre36,37, dissosierte celle suspensjoner ble bioprinted, og deretter cellekulturer ble utstyrt med de nødvendige mekaniske og biokjemiske signaler for å gjøre det mulig for cellene å danne en 3D-struktur. Imidlertid kan cellulær selvmontering ta dager eller uker, kan kreve komplekse romlige og timelige miljøsignaler, eller kan ikke oppstå når to celletyper er co-kultivert. For eksempel induserte brystepitelceller celledød i endotelceller i 2D-kokultur, og dissosierte brystepitelceller dannet ikke 3D-sfæroider når biotrykket i alginat / gelatinhydrogels38. Dissosierte brystepitel- eller kreftceller dannet sfæroider i alginatbaserte bioinks bare når de er fanget i sirkulære PDMS-former. I andre tilfeller ble sfæroider dannet ved hjelp av suspenderte dråper i ultra-lav vedlegg sirkulære brønnplater og deretter blandet inn i alginatbaserte bioinks39,40.
Vi beskriver nå en alternativ 3D vev biomanufacturing metode i denne protokollen. I stedet for frø dissosierte celler og vente på at disse cellene skal danne 3D-strukturer, beskriver vi hvordan du lager og bioprint 3D tumor sfæroider på et vaskulært rørnettverk for å skape en tumorkokulturmodell som kan brukes nesten umiddelbart. Tumor spheroider kan dyrkes in vitro eller avledet fra menneskelig vev (organoider). På samme måte kan vaskulære rør dyrkes eller kan avledes fra fettvev mikrovaskulære fragmenter. Bioinks kan variere fra biologisk inaktiv alginat til den svært biologisk aktive Matrigel41. Siden denne 3D tumor co-kultur modellen kan opprettes med en rekke cellestrukturer og bioinks, kan den innlemme flere celletyper, ekstracellulære matriser, og chemokine gradienter15,42. Mens i sin nåværende formulering, endotelnettverkene kan ikke perfunderes, fremtidige iterasjoner kan integrere denne metoden med mikrofluids eller -on-chip systemer. Bioprinting 3D bryst epitelkuler på endotelnettverk muliggjør rask biofabrikasjon av menneskelige brystmodeller for narkotikatesting og personlig presisjon medisin27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Bioprinting fremstår som et lovende verktøy for å fremstille 3D humane kreftmodeller som bedre rekapulerer kritiske kjennetegn på in vivo vevarkitektur. I dagens lag-for-lag ekstrudering bioprinting, individuelle celler ekstruderes i en bioink sammen med komplekse romlige og timelige signaler for å fremme hierarkisk vev selvmontering. Imidlertid er denne biofabrikasjonsteknikken avhengig av komplekse interaksjoner mellom celler, bioinks og biokjemiske og biofysiske signaler. Dermed kan selvmontering ta dager eller uker, kan kreve spesifikke bioinks, og kan ikke alltid oppstå når det er mer enn én celletype involvert. Vi utviklet derfor en teknikk for å direkte bioprint pre-dannet 3D bryst epitel sfæroider i en rekke bioinks. Bioprinted pre-dannet 3D bryst epitel sfæroider opprettholdt sin levedyktighet og polarisert arkitektur etter utskrift. Vi trykte i tillegg 3D-sfæroidene på vaskulære endotelcellenettverk for å skape en co-kulturmodell. Dermed skaper den nye bioprinting teknikken raskt en mer fysiologisk relevant 3D menneskelig brystmodell til lavere pris og med høyere fleksibilitet enn tradisjonelle bioprinting teknikker. Denne allsidige bioprintteknikken kan ekstrapoleres for å lage 3D-modeller av andre vev i ekstra bioinks.

Bryst epitelceller bør selv organisere i 3D-sfæroider etter 5-8 dager med kultur på matriseløsning og i kulturmedium med 2% matriseløsning. Ikke-tumorigenic MCF10A bryst epiteliske sfæroider skal vises rundt og har et hul senter, med integrin α6 polarisert til den ytre kanten av spheroid (Figur 1, inntreder viser hule sentre). Svært invasive MDA-MB-231 brystkreft epitelceller danner uregelmessige sfæroider. Sfæroider bør brukes når de er rundt 100 – 300 μm i diameter. Når sf?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Målet med denne protokollen er å direkte bioprint bryst epitelceller som flercellede sfæroider på pre-dannet endotelnettverk for raskt å skape 3D bryst-endotelkokultur modeller som kan brukes til narkotika screening studier.

Direkte bioprinting av 3D flercellede bryst spheroider på endotelnettverk

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Bygging av en Flercellede 3D Stillas for levering av Lagdelte Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modellering Eggstokkreft Flercellede spheroid Opptreden i en dynamisk 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Opprettelse av hjertevæv som viser mekanisk integrasjon av sfæroider ved hjelp av 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting brusk og huden vev Analogs utnytte en roman passiv miksing enhet teknikk for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-on-a-CD plattform for generering flercellede tredimensjonal Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller av 3D Bioprinting av gelatin Methacryloyl hydrogel basert Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Lignende Vev

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Rimelig oksygenmikroskopiassistert biofabrikasjon av multicellulære sfæroider

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...