Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo NIH 1R01HL140239-01 para a AMC. Gostaríamos de agradecer ao Centro de Imagens Celulares da Universidade Drexel.

1. Crescimento de células epiteliais mamárias e mídia de ensaio
<ol><li>Células epiteliais mamárias MCF10A NOTA: A linha de células epiteliais de mama imortalizada não tumorigênica é derivada de uma paciente com doença fibrocística43. As células não expressam receptor de estrogênio.<ol>
<li>Para preparar 20 μg/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), dissolva 100 μg de EGF liofilizado em 500 μL de dH2O estéril para fazer 200 μg/mL EGF. Adicione 500 μL de 200 ?...

Este protocolo é o primeiro de seu tipo a bioimpressão spheroids em sua arquitetura 3D para co-cultura com células endoteliais também em sua arquitetura 3D. As etapas críticas do protocolo incluem a formação inicial de esferoides epiteliais mamários e redes HUVEC. Deve-se ter extrema cautela na alimentação de esferoides epiteliais mamários, pois são facilmente interrompidos da solução matricial. Da mesma forma, os esferoides epiteliais mamários devem ser tratados com cuidado quando são pipetted fora da so...

Modelos de tumores vascularizados in vitro 3D são ferramentas essenciais para o estudo mecanicista do crescimento do câncer e da metástase. Para o câncer de mama em particular, as células epiteliais mamárias cultivadas em Matrigel se organizam em esferoides polarizados que se assemelham mais à arquitetura acinus mamária in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. A cultura epitelial da mama 3D também impacta a função celular, com culturas 3D mostrando diferenças na modulação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF)8,9; função oncogene, incluindo ErbB210; crescimento e apoptose sinalizando11,12; e resistência à quimioterapia13,14. As células endoteliais vasculares respondem de forma semelhante aos estímulos ambientais em 3D vs. cultura 2D tradicional15,16,17,18. No entanto, grande parte da compreensão das interações epiteliais vasculares e mamárias vem da cultura 2D usando pastilhas médias ou transwell condicionadas, ou modelos 3D nos quais os dois tipos de células são fisicamente separados19,20,21,22,23. Esses modelos de cocultura fornecem uma visão fisiológica limitada, uma vez que tanto a cultura 3D quanto o contato celular-célula são fundamentais para a endotelial vascular – interações epiteliais mamárias24,25,26.
Modelos de câncer 3D foram fabricados utilizando uma variedade de técnicas, incluindo formação de spheroid suspensa, bioimpressão, montagem magnética e cultura dentro de hidrogéis ou em andaimes projetados5,27,28,29. Mais recentemente, modelos de tumor 3D foram criados com vários tipos de células dispostos em suas respectivas estruturas 3D. Em um exemplo de uma plataforma tumor-on-a-chip, câncer, células endoteliais e estromais foram misturados em uma matriz e, em seguida, injetados nas três câmaras centrais de tecido em um dispositivo polidimetilsiloxano (PDMS). As câmaras de tecido eram cercadas por dois canais externos que representavam uma artéria e venule. Após 5-7 dias de cultura, as células endoteliais formaram uma rede microvascular e as células cancerígenas proliferaram para formar pequenos tumores perto da vasculatura. Esta plataforma foi então usada para rastrear drogas e combinações de drogas30. Plataformas adicionais de tumor-on-a-chip foram criadas para estudar metástase e tipos de câncer com estímulos mecânicos específicos (por exemplo, tensão mecânica no pulmão)31,32. No entanto, essas plataformas geralmente não incluem vasculatura e câncer em suas respectivas estruturas 3D.
A biofabização mostra grande promessa no avanço de modelos de tumores vascularizados in vitro 3D, uma vez que permite um controle espacial rigoroso sobre a localização celular. Apesar do crescimento da bioimpressão na última década, poucos estudos se concentram especificamente nos tumores33,34. Em um exemplo, a impressão 3D de células HeLa em um hidrogel gelatina/alginato/fibrinogen foi usada para criar um modelo de câncer cervical in vitro. As células tumorais foram bioimpressas como células individuais e, em seguida, autorizadas a formar esferoides, que apresentaram maior taxa de proliferação, aumento da expressão metaloproteinase matricial e maior que a quimiosistência do que as células na cultura 2D35. Nesses estudos, como em muitos outros36,37, as suspensões celulares dissociadas foram bioimpressionadas, e então as culturas celulares foram fornecidas com as sugestões mecânicas e bioquímicas necessárias para permitir que as células formassem uma estrutura 3D. No entanto, a automontagem celular pode levar dias ou semanas, pode exigir pistas ambientais espaciais e temporais complexas, ou pode não ocorrer quando dois tipos de células são co-cultivados. Por exemplo, as células epiteliais mamárias induziram a morte celular em células endoteliais em cocultura 2D, e as células epiteliais de mama dissociadas não formaram esferoides 3D quando bioimpressionadas em hidrogéis de alginato/gelatina38. Células epiteliais de mama dissociadas ou cancerosas formaram esferoides em bioinks à base de alginato somente quando presos em moldes PDMS circulares. Em outros casos, os esferoides foram formados usando gotículas suspensas em placas de poço circular de fixação ultra-baixa e, em seguida, misturados em bioinks à base de alginato39,40.
Descrevemos agora um método alternativo de biomafação de tecido 3D neste protocolo. Em vez de células dissociadas de sementes e esperar que essas células formem as estruturas 3D, descrevemos como criar e bioimpressular spheróides tumorais 3D em uma rede de tubos vasculares para criar um modelo de co-cultura tumoral que pode ser usado quase imediatamente. Os esferoides tumorais podem ser cultivados in vitro ou derivados de tecidos humanos (organoides). Da mesma forma, os tubos vasculares podem ser cultivados ou podem ser derivados de fragmentos microvasculares teciduais adiposos. Os bioinks podem variar de alginato biologicamente inativo ao Matrigel41altamente biologicamente ativo . Uma vez que este modelo de cocultura tumoral 3D pode ser criado com uma variedade de estruturas celulares e bioinks, ele pode incorporar vários tipos de células, matrizes extracelulares e gradientes de quimiocina15,42. Enquanto em sua formulação atual, as redes endoteliais não podem ser perfundidas, futuras iterações poderiam integrar esse método com microfluidos ou sistemas -on-chip. Bioimpressão epitelial 3D em redes endoteliais permite a biofabricação rápida de modelos de mama humana para testes de drogas e medicina de precisão personalizada27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

A bioimpressão está emergindo como uma ferramenta promissora para fabricar modelos de câncer humano 3D que melhor recapitulem marcas críticas da arquitetura de tecidos in vivo. Na bioimpressão atual de extrusão de camada por camada, as células individuais são extrudadas em um bioink juntamente com pistas espaciais e temporais complexas para promover a auto-montagem do tecido hierárquico. No entanto, essa técnica de biofabricação conta com interações complexas entre células, bioinks e sinais bioquímicos e biofísicos. Assim, a automontagem pode levar dias ou até semanas, pode exigir bioinks específicos, e pode nem sempre ocorrer quando há mais de um tipo de célula envolvida. Desenvolvemos, portanto, uma técnica para bioimpressão pré-formada esferoides epiteliais de mama 3D em uma variedade de bioinks. Os esferoides epiteliais de mama 3D pré-formados bioimpressas sustentaram sua viabilidade e arquitetura polarizada após a impressão. Também imprimimos os esferoides 3D em redes de células endoteliais vasculares para criar um modelo de co-cultura. Assim, a nova técnica de bioimpressão cria rapidamente um modelo de mama humano 3D mais fisiologicamente relevante a um custo menor e com maior flexibilidade do que as técnicas tradicionais de bioimpressão. Esta técnica versátil de bioimpressão pode ser extrapolada para criar modelos 3D de outros tecidos em bioinks adicionais.

As células epiteliais mamárias devem se auto-organizar em esferoides 3D após 5-8 dias de cultura sobre solução matricial e em meio de cultura com solução de matriz de 2%. Epitóides epiteliais não tumorigênicos MCF10A devem aparecer redondos e ter um centro oco, com integrin α6 polarizado à borda externa do esferoide(Figura 1, inset mostra centros ocos). Células epiteliais altamente invasivas MDA-MB-231 formam esferoides irregulares. Os esferoides devem ser usados quando tiverem ...

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

O objetivo deste protocolo é bioimprimir diretamente as células epiteliais mamárias como esferoides multicelulares em redes endoteliais pré-formadas para criar rapidamente modelos de cocultura 3D de mama endotelial que podem ser usados para estudos de triagem de medicamentos.

Bioimpressão direta de esferoides de mama multicelular 3D em redes endoteliais

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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